Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-23T18:08:27Z No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-23T18:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é o agente causador da doença de Chagas, que afeta entre 8 e 9 milhões de pessoas em todo mundo. Este protozoário é responsável por uma variedade de manifestações clínicas em humanos, possui uma ampla gama de hospedeiros e apresenta grande diversidade genética e biológica. As pequenas regiões codificantes (uORFs) presentes na região 5’não traduzida (5’UTR) de mRNAs maduros são conhecidas por afetar a eficiência da tradução de muitos genes eucariotos. Pouco é conhecido sobre a existência e conservação de uORFs em genes de Tripanossomatídeos. Este trabalho se propôs avaliar o grau de conservação das uORFs e seu potencial como marcador molecular das populações de T. cruzi, através da análise de sete genes contendo uORFs previamente selecionados. Oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados e fragmentos das 5’UTRs contendo uORFs foram amplificados, através de PCR, de cepas representativas de cada um dos três grupos populacionais do parasito, TcI, TcII e ZIII. Após clonagem e sequenciamento, alto grau de conservação das uORFs foi observado de um ponto de vista populacional e a ruptura de uma uORF foi observada em apenas um gene. Isto é um forte indicativo de que em T. cruzi essas uORFs são funcionalmente ativas, pois do contrário teriam sido extintas das 5’UTRs durante o processo evolutivo sofrido pelos grupos populacionais de T. cruzi. A observação de mutações grupo-específicas nas sequências nucleotídicas das 5’UTRs de alguns genes, motivou a realização de testes para a utilização desses fragmentos como possíveis marcadores moleculares para as populações do parasito. A obtenção dos fragmentos dos genes codificantes de ATPase e Ferredoxina foi realizada em mais de 15 cepas e isolados. Verificou-se a existência de mutações grupo-específicas na 5’UTR do gene ATPase, que corroboram com a classificação filogenética proposta deste parasito. Na 5’UTR do gene Ferredoxina, notou-se a presença de uma sequência repetitiva simples, composta por dinucleotídeos CA (citosina e adenina) seguidos de mononucleotídeos A. As variações desta repetição puderam ser utilizadas para agrupar todos os isolados/cepas de T. cruzi do estudo em nove genótipos distintos, os quais são relativamente independentes da classificação atualmente proposta de três grandes grupos populacionais. O uso desta pequena repetição na 5’UTR do gene Ferredoxina permite uma nova forma de classificar os isolados e cepas de T. cruzi. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease in humans, and affects about nine million of people around the world. It induces a variety of clinical presentations in patients, have a wide range of vertebrate hosts and exhibits great diversity of genetic and biological characteristics. Upstream Open Reading Frames (uORFs) are small open reading frames located in the 5’ UTR of a mature mRNA. They have been shown to affect the translation efficiency of many eukaryotic genes. Scarce information is available about the existence and conservation of uORFs in Trypanosomatids genes. This study aims to evaluate both the degree of sequence conservation in uORFs and its potential as molecular marker of populations of T. cruzi. To this end, upon a PCR amplification and cloning of 5'UTR fragments, sequence analysis of seven genes that presents uORFs were carried out in four strains that are typical representative of three main population groups in T. cruzi. A remarkable degree of conservation of uORFs was observed in all isolates. Out of several mutational events observed in these uORFs, a disruption of a uORF was observed in only one gene. This indicates that in T. cruzi these uORFs are functionally active, otherwise it would have changed during the evolutionary process. The observation of group-specific mutations in the 5'UTRs of some genes suggested that they could be used in an PCR amplification assay as molecular markers for T. cruzi populations. The fragments of genes ATPase and Ferredoxin were amplified from 15 strains and isolates. After sequencing, the group-specific mutations observed in the 5'UTR of the gene ATPase corroborate the current classification of T. cruzi populations in three main groups: TcI, TcII and ZIII. In the 5'UTR of the Ferredoxin gene, the sequence alignment revealed the presence of a small repetitive sequence composed of dinucleotides CA and mononucleotides Adenine. The variations in length and composition of this simple repetitive sequence allowed the clustering of all 15 isolates into nine distinct genotypes, which were not correlated to main population groups. Thus, a new approach to strain typing in T. cruzi can be envisaged by using this SSR (simple sequence repeat).