Memoria para optar al titulo Profesional de Médico Veterinario / La amilina es una hormona de 37 aminoácidos secretada desde las células β pancreáticas junto con la insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa. Si bien, cumple varias funciones fisiológicas en nuestro organismo, durante el estrés metabólico asociado a etapas prediabéticas, la amilina empieza a agregarse formando fibrillas y depósitos amiloides, relacionados con pérdida de masa y función de las células β. Esta citotoxicidad estaría dada por la unión y la pérdida de integridad de la membrana plasmática que conduce a la formación de canales iónicos que desestabilizarían el ambiente intracelular. Se estudió el efecto de amilina sobre la viabilidad y funcionalidad en células Min – 6, midiendo producción de insulina y porcentaje de toxicidad. Se postula que la inserción del péptido a la membrana se produciría en células dañadas producto del estrés. Se evidenció una alta toxicidad de amilina en todas las condiciones, con una potenciación de su efecto nocivo en células expuestas a un medio alto y bajo en glucosa y en presencia de un inhibidor del metabolismo celular. También, se observó un efecto protector del ión zinc que actuaría bloqueando los canales formados por amilina, reduciendo su toxicidad. No se encontraron condiciones adecuadas para medir secreción de insulina. Se concluye que amilina se inserta en membranas de células β débiles, formando canales los cuales son bloqueados por Zn2+, en forma parecida a la acción del péptido β amiloide en cerebro. / Proyecto FONDECYT No. 1030611

A Diabetes mellitus em cães é cada vez mais frequente, decorrente de fatores genéticos e/ou ambientais, como um distúrbio endócrino que, de forma semelhante à que ocorre em humanos, falha no controle adequado de glicose no sangue, desencadeia a hiperglicemia, glicosúria e perda de peso. A terapia celular utilizando as células beta-pancreáticas tem sido alvo de estudos, devido à grande demanda de novos casos de Diabetes mellitus e à falta de órgãos para transplantes em humanos e animais. Acredita-se que a ciência possa responder e inovar em tratamentos, encontrando a possível cura para esta doença complexa. Portanto, o objetivo deste estudo foi obter e caracterizar células derivadas do pâncreas fetal canino de animais com idades compreendidas entre 50 e 60 dias de gestação. As células pancreáticas de fetos caninos apresentam morfologia fibroblastóide e crescimento em monocamada em cultivo, apresentam células pluripotentes e proliferativas, não são tumorigênicas e apresentam expressão de PDX1, um fator de transcrição que tem papel importante na ativação do gene promotor da insulina. O pâncreas possui inervação simpática, observado por fibras nervosas TH+. Histologicamente, o pâncreas fetal canino apresenta ácinos num estágio de organização avançado, com parênquima semelhante ao encontrado no cão adulto. As ilhotas pancreáticas são distribuídas no tecido de maneira irregular, organizando-se em pequenos aglomerados de células por entre os ácinos, especialmente próximas aos vasos sanguíneos. A coloração com Ditizona permitiu inferir a presença de insulina no tecido pancreático, o que foi comprovado mediante técnica de imunofluorescência, além da presença de células que expressam o hormônio somatostatina. Os resultados desta investigação indicam que o pâncreas fetal canino demonstra características favoráveis para ser uma fonte viável de células para estudos aplicados à terapia celular em cães. Outras investigações referentes à comprovação da produção de insulina in vitro por essas células se fazem necessárias / Diabetes mellitus in dogs is increasingly common, due to genetic and/or environmental factors such as an endocrine disorder, similarly to what occurs in humans, failure to adequately control blood glucose triggers hyperglycemia, glycosuria and weight loss. Cell therapy using the pancreatic beta cells has been the subject of studies, due to the great demand of new cases of diabetes mellitus and the lack of organs for transplants in humans and animals. It is believed that science can respond and innovate treatments, finding a possible cure for this disease complex. Therefore, the objective of this study was to obtain and characterize derived cells from canine fetal pancreas, of animals aged between 50 and 60 days of gestation. The pancreatic cells of canine fetuses exhibit fibroblastoid morphology and growth in monolayer culture, exhibit pluripotent and proliferative cells, are not tumorigenic and have PDX1 expression, a transcription factor that plays an important role in the activation of the insulin gene promoter. The pancreas has sympathetic innervation observed by TH+ nerve fibers. Histologically, the fetal pancreatic acini canine presents an advanced stage organization with similar parenchyma that found in adult dog. The pancreatic islets are distributed in the fabric unevenly, organizing themselves into small clusters of cells through the acini, especially close to the blood vessels. Staining with Dithizone allowed inferring the presence of insulin in the tissue, which was confirmed by immunofluorescence, in addition to cells that express somatostatin. The results of this investigation indicate that the canine fetal pancreas shows favorable characteristics to be a feasible source of cells for cell therapy applied to studies in dogs. Further investigation regarding the evidence of in vitro production of insulin by these cells are required

A Diabetes mellitus em cães é cada vez mais frequente, decorrente de fatores genéticos e/ou ambientais, como um distúrbio endócrino que, de forma semelhante à que ocorre em humanos, falha no controle adequado de glicose no sangue, desencadeia a hiperglicemia, glicosúria e perda de peso. A terapia celular utilizando as células beta-pancreáticas tem sido alvo de estudos, devido à grande demanda de novos casos de Diabetes mellitus e à falta de órgãos para transplantes em humanos e animais. Acredita-se que a ciência possa responder e inovar em tratamentos, encontrando a possível cura para esta doença complexa. Portanto, o objetivo deste estudo foi obter e caracterizar células derivadas do pâncreas fetal canino de animais com idades compreendidas entre 50 e 60 dias de gestação. As células pancreáticas de fetos caninos apresentam morfologia fibroblastóide e crescimento em monocamada em cultivo, apresentam células pluripotentes e proliferativas, não são tumorigênicas e apresentam expressão de PDX1, um fator de transcrição que tem papel importante na ativação do gene promotor da insulina. O pâncreas possui inervação simpática, observado por fibras nervosas TH+. Histologicamente, o pâncreas fetal canino apresenta ácinos num estágio de organização avançado, com parênquima semelhante ao encontrado no cão adulto. As ilhotas pancreáticas são distribuídas no tecido de maneira irregular, organizando-se em pequenos aglomerados de células por entre os ácinos, especialmente próximas aos vasos sanguíneos. A coloração com Ditizona permitiu inferir a presença de insulina no tecido pancreático, o que foi comprovado mediante técnica de imunofluorescência, além da presença de células que expressam o hormônio somatostatina. Os resultados desta investigação indicam que o pâncreas fetal canino demonstra características favoráveis para ser uma fonte viável de células para estudos aplicados à terapia celular em cães. Outras investigações referentes à comprovação da produção de insulina in vitro por essas células se fazem necessárias / Diabetes mellitus in dogs is increasingly common, due to genetic and/or environmental factors such as an endocrine disorder, similarly to what occurs in humans, failure to adequately control blood glucose triggers hyperglycemia, glycosuria and weight loss. Cell therapy using the pancreatic beta cells has been the subject of studies, due to the great demand of new cases of diabetes mellitus and the lack of organs for transplants in humans and animals. It is believed that science can respond and innovate treatments, finding a possible cure for this disease complex. Therefore, the objective of this study was to obtain and characterize derived cells from canine fetal pancreas, of animals aged between 50 and 60 days of gestation. The pancreatic cells of canine fetuses exhibit fibroblastoid morphology and growth in monolayer culture, exhibit pluripotent and proliferative cells, are not tumorigenic and have PDX1 expression, a transcription factor that plays an important role in the activation of the insulin gene promoter. The pancreas has sympathetic innervation observed by TH+ nerve fibers. Histologically, the fetal pancreatic acini canine presents an advanced stage organization with similar parenchyma that found in adult dog. The pancreatic islets are distributed in the fabric unevenly, organizing themselves into small clusters of cells through the acini, especially close to the blood vessels. Staining with Dithizone allowed inferring the presence of insulin in the tissue, which was confirmed by immunofluorescence, in addition to cells that express somatostatin. The results of this investigation indicate that the canine fetal pancreas shows favorable characteristics to be a feasible source of cells for cell therapy applied to studies in dogs. Further investigation regarding the evidence of in vitro production of insulin by these cells are required

Um dos objetivos no tratamento de Diabetes mellitus é aumentar a função, proliferação e sobrevivência de células beta pancreáticas, pois o transplante de ilhotas pancreáticas é severamente limitado pela escassez de doadores de órgãos. Nós mostramos que prolactina recombinante humana (rhPRL) apresenta efeitos benéficos em células beta, inibindo a apoptose. Recentemente reportamos o aumento dos níveis de expressão da proteína antiapoptótica HSP27/25, regulada por rhPRL em ilhotas humanas. Nosso objetivo é explorar o papel de HSP27/25 na citoproteção induzida por prolactina em células beta. Métodos: Células MIN6 parentais e silenciadas para HSP25 foram privadas de soro por 24h e cultivadas na presença ou ausência de rhPRL (300ng/mL). Posteriormente foram tratadas na presença ou ausência de uma combinação de citocinas (TNF-&#945;, INF-&#947 e IL-1&#946;) por diferentes períodos de tempo. A apoptose foi avaliada usando-se análise por citometria de fluxo. Os níveis de expressão gênica de HSP27/25 e membros da família BCL-2, da expressão proteica de membros desta mesma família, além de Caspase-9, Smac-Diablo HSP27/25, HSTF1, pP38 e pSTAT1 foram analisados por Westen blot. Ainda, foram avaliadas a atividade de Caspase-8 e -3, por ensaios fluorimétricos. Após o tratamento com rhPRL e citocinas, a proporção de núcleos fragmentados aumentou em células silenciadas para HSP25 (p<0,05), quando comparadas com células controles. A inibição da atividade de Caspase-3 e -8, tanto quanto os níveis de expressão proteica de caspase- 9, por rhPRL e o aumento da razão de expressão Bcl-2/Bax e BclxL/Bax foram revertidos em células silenciadas (p<0,05). Além disso, a cinética dos níveis de expressão de HSP27/25 e HSTF1 foram estudadas em culturas de ilhotas pancreáticas humanas, mostrando que enquanto HSTF1 apresenta um aumento significativo (p<0,01) nos níveis de expressão proteica após 10min de tratamento com rhPRL, HSP27 alcançou seu nível máximo após 2h do tratamento hormonal. Adicionalmente, foi detectado um aumento significante (p<0,05) nos níveis de fosforilação de STAT1 e de p38, após 10min, atingindo o pico de expressão após 30min (p<0,01) do tratamento com rhPRL. Estes estudos demonstram o papel chave de HSP27/25 sobre os efeitos citoprotetores induzidos por rhPRL, desde que a ausência desta proteína aboliu completamente os efeitos benéficos induzidos por PRL sobre a morte de células beta. Ainda, nós fornecemos pela primeira vez, evidências da corregulação de HSP27 e HSTF1 induzidas por rhPRL em células humanas pancreáticas, que pode estar sendo mediada pela ativação de STAT1 e p38. Coletivamente, nossos resultados podem conduzir para a atenuação da morte de células beta por meio da regulação de uma via de proteção endógena, a qual é independente da modulação do sistema imunológico. / One of the goals in Diabetes mellitus treatment is to enhance pancreatic &#946;-cell function, proliferation and survival since transplantation of pancreatic islets is severely limited by shortage of organ donors. We have shown that recombinant human prolactin (rhPRL) inhibits beta-cell apoptosis. We have recently reported PRL-induced up-regulation of the anti-apoptotic HSP25/27 in human islets. Since the function of HSP25/27 in beta-cells has not been directly studied, we set out to explore the role of HSP25/27 in prolactin-induced beta-cell cytoprotection. Methods: Parental and HSP25 knocked-down Min6 cells were serumstarved for 24h and then cultured in the presence or in the absence of rhPRL (300ng/mL) for different time periods. Apoptosis was evaluated using flow cytometry analysis. Levels of Bcl-2 gene family members, caspase-9, Bcl-2, BclxL, Bax, Smac-Diablo, HSP27/25, HSTF1, pStat- 1,pP38 were studied by western blot. Caspase-3 and -8 activity, were evaluated by fluorimetric assays. Upon cytokines and rhPRL treatment, the proportion of fragmented nuclei was increased in HSP25 silenced cells (p<0.05) when compared to control cells. The inhibition of cytokine-induced capase-3 and -8 activity as well as Bcl-2/Bax and BclxL/Bax ratios and caspase-9 protein levels mediated by rhPRL in wild type cells was reverted in knocked-down cells (p<0.05). Moreover, the kinetics of HSP 25/27 and HSTF1 expression levels studied in primary cultures of human pancreatic islets showed that while HSTF1 presented a significant increase (p<0.01) in protein expression level after 10 min of rhPRL treatment, HSP27 reached its maximum expression level upon 2h of hormonal treatment. Additionally, a significant (p<0.05) increase in both P38 and STAT1 phosphorylation levels were detected after 10min of rhPRL treatment reaching the highest levels upon 30 min (p<0.001) of hormonal treatment. Therefore, we demonstrated a key role for HSP25/27 in rhPRL-induced cytoprotective effects, since the lack of this protein completely abolished the beneficial effects induced by PRL on beta-cell death. Moreover, we provided for the first time, evidence for the co-regulation of HSP27 and HSTF1 induced by rhPRL in human pancreatic cells which could be mediated by activated STAT1 and P38. Collectively, our results could lead to the mitigation of beta-cell death through the up-regulation of an endogenous protective pathway which is independent on the modulation of the immune system.

O transplante de ilhotas pancreáticas constitui uma alternativa atraente para o tratamento de diabetes tipo 1 (DM1), contudo, é limitado devido à escassez de doadores de órgãos. O papel da prolactina humana recombinante (rhPRL), que apresenta efeitos benéficos em células-beta, e seu mecanismo de ação foram investigados neste estudo. O número de células apoptóticas diminui significativamente na presença de rhPRL. Essa citoproteção envolveu diminuição da razão BCL2/BAX e inibição de caspase-8, -9 e -3. Este estudo revelou, pela primeira vez, evidência direta do efeito protetor de lactogênios contra apoptose de células-beta humanas. Levando em consideração a relação conhecida entre citocinas e DM1 e observações recentes sugerindo o papel da autofagia no desenvolvimento e prevenção do DM1, foi investigada a conexão entre citocinas (IL-1&#946;, TNF&#945; e IFN-&#947;) e autofagia em células-beta. O co-tratamento com citocinas e rapamicina, um indutor de autofagia via inibição de mTOR, não aumentou os níveis de apoptose em células INS-1E. Contudo, exposição a citocinas levou ao aumento nos níveis de autofagossomos e na relação LC3-II/LC3-I, do mesmo modo que o tratamento com rapamicina. O tratamento com citocinas também levou à diminuição dos níveis de mTOR e 4E-BP1 fosforilados. Foi demonstrada aqui, pela primeira vez, uma relação direta entre o tratamento com citocinas e a indução de autofagia em células-beta. Recentemente, surgiram novas evidências mostrando ligação entre a morte de células-beta induzida por citocinas e indução de estresse de retículo endoplasmático. Em nosso modelo, foram observados níveis diminuídos de p-mTOR e aumento da formação de autofagossomos após o tratamento com indutores de estresse de retículo. Este estudo reforça também, resultados prévios sobre a hipótese da função de indutores de estresse de retículo em promover a autofagia. Além disso, o tratamento com rhPRL aumentou os níveis de p-mTOR e levou à diminuição na formação de autofagossomos após exposição a citocinas em células-beta. Estes resultados são relevantes para a caracterização mais aprofundada das funções dos lactogênios nessas células. Sabendo-se da necessidade de células-beta humanas para estudos detalhados em células-beta, nosso grupo gerou linhagens celulares derivadas de insulinomas humanos que secretam hormônios e expressam marcadores com o mesmo padrão de seu tecido original. Estas linhagens foram caracterizadas comparando-as com culturas primárias de células-beta através de eletroforese bidimensional acoplada a espectrometria de massa. Cerca de 1.800 spots foram detectados, sendo que menos de 1% apresentou expressão diferencial. As proteínas superexpressas em ilhotas, como Caldesmon, estão envolvidas em organização do citoesqueleto, influenciando a secreção hormonal. Contrariamente, quase todas as proteínas superexpressas nas células de insulinoma, como MAGE-A2, foram descritas aqui pela primeira vez, podendo estar relacionadas à sobrevivência celular e resistência à quimioterapia. Estes resultados mostram, pela primeira vez, mudanças na expressão de proteínas relacionadas ao fenótipo alterado dos insulinomas, direcionando a pesquisa ao estabelecimento de células-beta humanas bioengenheiradas e ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para insulinomas. Coletivamente, os dados obtidos neste estudo estendem o conhecimento molecular envolvido na citoproteção induzida por rhPRL e transformação maligna de células-beta pancreáticas, contribuindo para futuras aplicações na compreensão e no tratamento do DM1 / Transplantation of pancreatic islets constitutes an alternative for type 1 diabetes (DM1); however, it is limited by the shortage of organ donors. Here, we investigated the role of recombinant human prolactin (rhPRL), shown to have beneficial effects in beta-cells, and its mechanisms of action. Apoptotic beta-cells were decreased in the presence of rhPRL, with cytoprotection involving an increase of BCL2/BAX ratio and inhibition of caspase-8, -9 and -3. This study provides new direct evidence for a protective effect of lactogens in human beta-cell apoptosis. Taking into account the known relationship between cytokines and DM1 and recent observations suggesting a role for autophagy in the development and prevention of DM1, we investigated the connection between cytokines (IL-1&#946;, TNF-&#945; and IFN-&#947;) and autophagy in beta-cells. Co-treatment with cytokines and rapamycin, an inducer of autophagy through inhibition of mTOR, did not increase the apoptosis levels in INS-1E cells. However, exposure to cytokines increased the levels of autophagosome formation and LC3-II/LC3-I ratio. Treatment with cytokines also led to decreased levels of phosphorylated mTOR and 4E-BP1. We demonstrated for the first time, a direct relationship between cytokines treatment and induction of autophagy in beta-cells. Lately, new evidence point to a connection between cytokine-induced beta-cell death and endoplasmic reticulum stress. In our model, we observed that decreased levels of p-mTOR and increased autophagosome formation also ensued after treatment with endoplasmic reticulum stressors. This study also supports the previous hypothesis on the function of ER stressors in inducing autophagy. Furthermore, rhPRL treatment increased the levels of p-mTOR and decreased autophagosome formation after exposure to cytokines in beta-cells. These findings are also relevant for further characterization of lactogens functions in these cells. Considering the demand for human cells for further beta-cells studies, our group generated cell lines derived from human insulinomas which secrete hormones and express markers with the same pattern displayed by their original tissue. We set out to further characterize these lineages by comparing them to primary beta-cells using two-dimensional gel electrophoresis coupled to mass spectrometry. An average of 1,800 spots was detected with less than 1% exhibiting differential expression. Proteins upregulated in islets, such as Caldesmon, are involved in cytoskeletal organization thus influencing hormone secretion. In contrast, almost all proteins upregulated in insulinoma cells, such as MAGE-A2, first described here, could be related to cell survival and resistance to chemotherapy. Our results provide, for the first time, a molecular snapshot of the changes in expression of proteins correlated with the altered phenotype of insulinomas, prompting research towards the establishment of bioengineered human beta-cells, and the development of new therapeutic strategies for insulinomas. Collectively, the data obtained in this study extend the molecular knowledge involved in rhPRL-induced cytoprotection and malignant transformation of pancreatic beta-cells, contributing to future applications for understanding and treatment of DM1

O transplante de ilhotas pancreáticas constitui uma alternativa atraente para o tratamento de diabetes tipo 1 (DM1), contudo, é limitado devido à escassez de doadores de órgãos. O papel da prolactina humana recombinante (rhPRL), que apresenta efeitos benéficos em células-beta, e seu mecanismo de ação foram investigados neste estudo. O número de células apoptóticas diminui significativamente na presença de rhPRL. Essa citoproteção envolveu diminuição da razão BCL2/BAX e inibição de caspase-8, -9 e -3. Este estudo revelou, pela primeira vez, evidência direta do efeito protetor de lactogênios contra apoptose de células-beta humanas. Levando em consideração a relação conhecida entre citocinas e DM1 e observações recentes sugerindo o papel da autofagia no desenvolvimento e prevenção do DM1, foi investigada a conexão entre citocinas (IL-1&#946;, TNF&#945; e IFN-&#947;) e autofagia em células-beta. O co-tratamento com citocinas e rapamicina, um indutor de autofagia via inibição de mTOR, não aumentou os níveis de apoptose em células INS-1E. Contudo, exposição a citocinas levou ao aumento nos níveis de autofagossomos e na relação LC3-II/LC3-I, do mesmo modo que o tratamento com rapamicina. O tratamento com citocinas também levou à diminuição dos níveis de mTOR e 4E-BP1 fosforilados. Foi demonstrada aqui, pela primeira vez, uma relação direta entre o tratamento com citocinas e a indução de autofagia em células-beta. Recentemente, surgiram novas evidências mostrando ligação entre a morte de células-beta induzida por citocinas e indução de estresse de retículo endoplasmático. Em nosso modelo, foram observados níveis diminuídos de p-mTOR e aumento da formação de autofagossomos após o tratamento com indutores de estresse de retículo. Este estudo reforça também, resultados prévios sobre a hipótese da função de indutores de estresse de retículo em promover a autofagia. Além disso, o tratamento com rhPRL aumentou os níveis de p-mTOR e levou à diminuição na formação de autofagossomos após exposição a citocinas em células-beta. Estes resultados são relevantes para a caracterização mais aprofundada das funções dos lactogênios nessas células. Sabendo-se da necessidade de células-beta humanas para estudos detalhados em células-beta, nosso grupo gerou linhagens celulares derivadas de insulinomas humanos que secretam hormônios e expressam marcadores com o mesmo padrão de seu tecido original. Estas linhagens foram caracterizadas comparando-as com culturas primárias de células-beta através de eletroforese bidimensional acoplada a espectrometria de massa. Cerca de 1.800 spots foram detectados, sendo que menos de 1% apresentou expressão diferencial. As proteínas superexpressas em ilhotas, como Caldesmon, estão envolvidas em organização do citoesqueleto, influenciando a secreção hormonal. Contrariamente, quase todas as proteínas superexpressas nas células de insulinoma, como MAGE-A2, foram descritas aqui pela primeira vez, podendo estar relacionadas à sobrevivência celular e resistência à quimioterapia. Estes resultados mostram, pela primeira vez, mudanças na expressão de proteínas relacionadas ao fenótipo alterado dos insulinomas, direcionando a pesquisa ao estabelecimento de células-beta humanas bioengenheiradas e ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para insulinomas. Coletivamente, os dados obtidos neste estudo estendem o conhecimento molecular envolvido na citoproteção induzida por rhPRL e transformação maligna de células-beta pancreáticas, contribuindo para futuras aplicações na compreensão e no tratamento do DM1 / Transplantation of pancreatic islets constitutes an alternative for type 1 diabetes (DM1); however, it is limited by the shortage of organ donors. Here, we investigated the role of recombinant human prolactin (rhPRL), shown to have beneficial effects in beta-cells, and its mechanisms of action. Apoptotic beta-cells were decreased in the presence of rhPRL, with cytoprotection involving an increase of BCL2/BAX ratio and inhibition of caspase-8, -9 and -3. This study provides new direct evidence for a protective effect of lactogens in human beta-cell apoptosis. Taking into account the known relationship between cytokines and DM1 and recent observations suggesting a role for autophagy in the development and prevention of DM1, we investigated the connection between cytokines (IL-1&#946;, TNF-&#945; and IFN-&#947;) and autophagy in beta-cells. Co-treatment with cytokines and rapamycin, an inducer of autophagy through inhibition of mTOR, did not increase the apoptosis levels in INS-1E cells. However, exposure to cytokines increased the levels of autophagosome formation and LC3-II/LC3-I ratio. Treatment with cytokines also led to decreased levels of phosphorylated mTOR and 4E-BP1. We demonstrated for the first time, a direct relationship between cytokines treatment and induction of autophagy in beta-cells. Lately, new evidence point to a connection between cytokine-induced beta-cell death and endoplasmic reticulum stress. In our model, we observed that decreased levels of p-mTOR and increased autophagosome formation also ensued after treatment with endoplasmic reticulum stressors. This study also supports the previous hypothesis on the function of ER stressors in inducing autophagy. Furthermore, rhPRL treatment increased the levels of p-mTOR and decreased autophagosome formation after exposure to cytokines in beta-cells. These findings are also relevant for further characterization of lactogens functions in these cells. Considering the demand for human cells for further beta-cells studies, our group generated cell lines derived from human insulinomas which secrete hormones and express markers with the same pattern displayed by their original tissue. We set out to further characterize these lineages by comparing them to primary beta-cells using two-dimensional gel electrophoresis coupled to mass spectrometry. An average of 1,800 spots was detected with less than 1% exhibiting differential expression. Proteins upregulated in islets, such as Caldesmon, are involved in cytoskeletal organization thus influencing hormone secretion. In contrast, almost all proteins upregulated in insulinoma cells, such as MAGE-A2, first described here, could be related to cell survival and resistance to chemotherapy. Our results provide, for the first time, a molecular snapshot of the changes in expression of proteins correlated with the altered phenotype of insulinomas, prompting research towards the establishment of bioengineered human beta-cells, and the development of new therapeutic strategies for insulinomas. Collectively, the data obtained in this study extend the molecular knowledge involved in rhPRL-induced cytoprotection and malignant transformation of pancreatic beta-cells, contributing to future applications for understanding and treatment of DM1

Um dos objetivos no tratamento de Diabetes mellitus é aumentar a função, proliferação e sobrevivência de células beta pancreáticas, pois o transplante de ilhotas pancreáticas é severamente limitado pela escassez de doadores de órgãos. Nós mostramos que prolactina recombinante humana (rhPRL) apresenta efeitos benéficos em células beta, inibindo a apoptose. Recentemente reportamos o aumento dos níveis de expressão da proteína antiapoptótica HSP27/25, regulada por rhPRL em ilhotas humanas. Nosso objetivo é explorar o papel de HSP27/25 na citoproteção induzida por prolactina em células beta. Métodos: Células MIN6 parentais e silenciadas para HSP25 foram privadas de soro por 24h e cultivadas na presença ou ausência de rhPRL (300ng/mL). Posteriormente foram tratadas na presença ou ausência de uma combinação de citocinas (TNF-&#945;, INF-&#947 e IL-1&#946;) por diferentes períodos de tempo. A apoptose foi avaliada usando-se análise por citometria de fluxo. Os níveis de expressão gênica de HSP27/25 e membros da família BCL-2, da expressão proteica de membros desta mesma família, além de Caspase-9, Smac-Diablo HSP27/25, HSTF1, pP38 e pSTAT1 foram analisados por Westen blot. Ainda, foram avaliadas a atividade de Caspase-8 e -3, por ensaios fluorimétricos. Após o tratamento com rhPRL e citocinas, a proporção de núcleos fragmentados aumentou em células silenciadas para HSP25 (p<0,05), quando comparadas com células controles. A inibição da atividade de Caspase-3 e -8, tanto quanto os níveis de expressão proteica de caspase- 9, por rhPRL e o aumento da razão de expressão Bcl-2/Bax e BclxL/Bax foram revertidos em células silenciadas (p<0,05). Além disso, a cinética dos níveis de expressão de HSP27/25 e HSTF1 foram estudadas em culturas de ilhotas pancreáticas humanas, mostrando que enquanto HSTF1 apresenta um aumento significativo (p<0,01) nos níveis de expressão proteica após 10min de tratamento com rhPRL, HSP27 alcançou seu nível máximo após 2h do tratamento hormonal. Adicionalmente, foi detectado um aumento significante (p<0,05) nos níveis de fosforilação de STAT1 e de p38, após 10min, atingindo o pico de expressão após 30min (p<0,01) do tratamento com rhPRL. Estes estudos demonstram o papel chave de HSP27/25 sobre os efeitos citoprotetores induzidos por rhPRL, desde que a ausência desta proteína aboliu completamente os efeitos benéficos induzidos por PRL sobre a morte de células beta. Ainda, nós fornecemos pela primeira vez, evidências da corregulação de HSP27 e HSTF1 induzidas por rhPRL em células humanas pancreáticas, que pode estar sendo mediada pela ativação de STAT1 e p38. Coletivamente, nossos resultados podem conduzir para a atenuação da morte de células beta por meio da regulação de uma via de proteção endógena, a qual é independente da modulação do sistema imunológico. / One of the goals in Diabetes mellitus treatment is to enhance pancreatic &#946;-cell function, proliferation and survival since transplantation of pancreatic islets is severely limited by shortage of organ donors. We have shown that recombinant human prolactin (rhPRL) inhibits beta-cell apoptosis. We have recently reported PRL-induced up-regulation of the anti-apoptotic HSP25/27 in human islets. Since the function of HSP25/27 in beta-cells has not been directly studied, we set out to explore the role of HSP25/27 in prolactin-induced beta-cell cytoprotection. Methods: Parental and HSP25 knocked-down Min6 cells were serumstarved for 24h and then cultured in the presence or in the absence of rhPRL (300ng/mL) for different time periods. Apoptosis was evaluated using flow cytometry analysis. Levels of Bcl-2 gene family members, caspase-9, Bcl-2, BclxL, Bax, Smac-Diablo, HSP27/25, HSTF1, pStat- 1,pP38 were studied by western blot. Caspase-3 and -8 activity, were evaluated by fluorimetric assays. Upon cytokines and rhPRL treatment, the proportion of fragmented nuclei was increased in HSP25 silenced cells (p<0.05) when compared to control cells. The inhibition of cytokine-induced capase-3 and -8 activity as well as Bcl-2/Bax and BclxL/Bax ratios and caspase-9 protein levels mediated by rhPRL in wild type cells was reverted in knocked-down cells (p<0.05). Moreover, the kinetics of HSP 25/27 and HSTF1 expression levels studied in primary cultures of human pancreatic islets showed that while HSTF1 presented a significant increase (p<0.01) in protein expression level after 10 min of rhPRL treatment, HSP27 reached its maximum expression level upon 2h of hormonal treatment. Additionally, a significant (p<0.05) increase in both P38 and STAT1 phosphorylation levels were detected after 10min of rhPRL treatment reaching the highest levels upon 30 min (p<0.001) of hormonal treatment. Therefore, we demonstrated a key role for HSP25/27 in rhPRL-induced cytoprotective effects, since the lack of this protein completely abolished the beneficial effects induced by PRL on beta-cell death. Moreover, we provided for the first time, evidence for the co-regulation of HSP27 and HSTF1 induced by rhPRL in human pancreatic cells which could be mediated by activated STAT1 and P38. Collectively, our results could lead to the mitigation of beta-cell death through the up-regulation of an endogenous protective pathway which is independent on the modulation of the immune system.