Memoria para optar al titulo Profesional de Médico Veterinario / La amilina es una hormona de 37 aminoácidos secretada desde las células β pancreáticas junto con la insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa. Si bien, cumple varias funciones fisiológicas en nuestro organismo, durante el estrés metabólico asociado a etapas prediabéticas, la amilina empieza a agregarse formando fibrillas y depósitos amiloides, relacionados con pérdida de masa y función de las células β. Esta citotoxicidad estaría dada por la unión y la pérdida de integridad de la membrana plasmática que conduce a la formación de canales iónicos que desestabilizarían el ambiente intracelular. Se estudió el efecto de amilina sobre la viabilidad y funcionalidad en células Min – 6, midiendo producción de insulina y porcentaje de toxicidad. Se postula que la inserción del péptido a la membrana se produciría en células dañadas producto del estrés. Se evidenció una alta toxicidad de amilina en todas las condiciones, con una potenciación de su efecto nocivo en células expuestas a un medio alto y bajo en glucosa y en presencia de un inhibidor del metabolismo celular. También, se observó un efecto protector del ión zinc que actuaría bloqueando los canales formados por amilina, reduciendo su toxicidad. No se encontraron condiciones adecuadas para medir secreción de insulina. Se concluye que amilina se inserta en membranas de células β débiles, formando canales los cuales son bloqueados por Zn2+, en forma parecida a la acción del péptido β amiloide en cerebro. / Proyecto FONDECYT No. 1030611

O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM 2) é uma doença crônica na qual os pacientes apresentam capacidade secretória de insulina inadequada para suplantar a resistência insulínica concomitante e, como resultado, advém a hiperglicemia. Os mecanismos que explicam a diminuição da secreção insulínica não são completamente conhecidos e acredita-se que o depósito de amilina, um achado histopatológico freqüente nesses pacientes, esteja envolvido. A amilina humana é uma proteína co-secretada com a insulina capaz de se agregar e se depositar nas ilhotas pancreáticas. Ainda não está totalmente estabelecido se a toxicidade da amilina humana é mediada pelas fibrilas maduras, conforme demonstrado em trabalhos mais antigos, ou por oligômeros de tamanho intermediário, como tem sido aventado nos trabalhos mais recentes. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de genes modulados por oligômeros, bem como por fibrilas maduras de amilina, em ilhotas pancreáticas de rato. As ilhotas foram isoladas a partir de ratos Wistar, mantidas em cultura por 24 horas e a seguir tratadas com 10 M de oligômeros ou de fibrilas maduras de amilina por 24 horas adicionais em concentração fisiológica ou suprafisiológica de glicose. O RNA total foi extraído e utilizado para análise da expressão gênica por microarranjos de DNA. O conteúdo de RNA de alguns genes modulados nas condições experimentais estudadas também foi avaliado por RT-qPCR, a fim de validar os resultados obtidos pela análise de microarranjos. A análise das vias significativamente afetadas pelas preparações de amilina demonstrou que, em ilhotas mantidas em concentração fisiológica de glicose, os oligômeros de amilina modularam, entre outros, processos relacionados à Resposta ao Estresse e à Apoptose, processos não modulados pelas fibrilas maduras de amilina. Em concentração suprafisiológica de glicose, o tratamento com oligômeros de amilina deixou de modular as vias relacionadas a Estresse e Apoptose, surgindo como moduladas vias relacionadas aos processos de Regulação da endocitose e Biossíntese de óxido nítrico. Os resultados do RT-qPCR sugeriram que somente os oligômeros (e não as fibrilas maduras) de amilina modulam genes relacionados a apoptose (Anxa1, Rab5a) e ao estresse oxidativo (Nos2 e Xdh), o que vai ao encontro dos estudos mais recentes que atribuem às fibrilas intermediárias um papel na citotoxicidade das células . Um achado novo do presente estudo foi a identificação do mRNA do Gipr (receptor de polipeptídeo inibitório gástrico) como alvo de regulação negativa pelos oligômeros de amilina, o que sugere que esse possa ser um mecanismo adicional pelo qual essas fibrilas intermediárias de amilina sejam deletérias para a célula pancreática. / Type 2 diabetes mellitus is a chronic disease in which there is inability of pancreatic cells to secrete sufficient insulin to overcome the insulin resistance in the peripheral tissues with resultant hyperglycemia. Mechanisms leading to diminished insulin secretion are not completely known and the amyloid deposit, a frequent histopathological finding in patients with type 2 diabetes, is believed to be involved. Human amylin, a protein co-secreted with insulin, is capable of aggregating and forming deposits in the pancreatic islets. It is not fully established whether amylin cytotoxicity is mediated by mature amylin fibrils or by soluble oligomers. The objective of this study was to evaluate the gene profiling modulated by oligomers as well as by mature amylin fibrils in rat pancreatic islets. The islets were isolated from Wistar rats, maintained in culture for 24 hours and then treated with 10 M of oligomers or mature amylin fibrils for additional 24 hour in physiologic and supraphysiologic glucose concentrations. Total RNA was extracted and used for gene expression analysis by microarray. RNA content of some modulated genes was evaluated by RT-qPCR in order to validate the results obtained from the microarray analysis. The analysis of the pathways significantly affected by the two amylin preparations demonstrated that, in islets maintained in physiological glucose concentration, amylin oligomers modulated, among others, processes related to Response to stress and to Apoptosis, which were not modulated by mature amylin fibrils. In supraphysiological glucose concentration, treatment with oligomers did not modulate the pathways related to Stress and Apoptosis, which were replaced by processes related to Endocytosis regulation and Nitric oxide biosynthesis. RT-qPCR results suggested that only amylin oligomers modulate genes related to apoptosis (Anxa1, Rab5a) and oxidative stress (Nos2 e Xdh), which is in agreement with studies indicating a role for oligomers in the cytotoxicity of cells. A new finding of the present study was the identification of the Gipr (gastric inhibitory polypeptide receptor) mRNA as a target for downregulation by amylin oligomers, which suggests that this might be an additional mechanism by which these oligomers are deleterious to the pancreatic cells.

O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM 2) é uma doença crônica na qual os pacientes apresentam capacidade secretória de insulina inadequada para suplantar a resistência insulínica concomitante e, como resultado, advém a hiperglicemia. Os mecanismos que explicam a diminuição da secreção insulínica não são completamente conhecidos e acredita-se que o depósito de amilina, um achado histopatológico freqüente nesses pacientes, esteja envolvido. A amilina humana é uma proteína co-secretada com a insulina capaz de se agregar e se depositar nas ilhotas pancreáticas. Ainda não está totalmente estabelecido se a toxicidade da amilina humana é mediada pelas fibrilas maduras, conforme demonstrado em trabalhos mais antigos, ou por oligômeros de tamanho intermediário, como tem sido aventado nos trabalhos mais recentes. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de genes modulados por oligômeros, bem como por fibrilas maduras de amilina, em ilhotas pancreáticas de rato. As ilhotas foram isoladas a partir de ratos Wistar, mantidas em cultura por 24 horas e a seguir tratadas com 10 M de oligômeros ou de fibrilas maduras de amilina por 24 horas adicionais em concentração fisiológica ou suprafisiológica de glicose. O RNA total foi extraído e utilizado para análise da expressão gênica por microarranjos de DNA. O conteúdo de RNA de alguns genes modulados nas condições experimentais estudadas também foi avaliado por RT-qPCR, a fim de validar os resultados obtidos pela análise de microarranjos. A análise das vias significativamente afetadas pelas preparações de amilina demonstrou que, em ilhotas mantidas em concentração fisiológica de glicose, os oligômeros de amilina modularam, entre outros, processos relacionados à Resposta ao Estresse e à Apoptose, processos não modulados pelas fibrilas maduras de amilina. Em concentração suprafisiológica de glicose, o tratamento com oligômeros de amilina deixou de modular as vias relacionadas a Estresse e Apoptose, surgindo como moduladas vias relacionadas aos processos de Regulação da endocitose e Biossíntese de óxido nítrico. Os resultados do RT-qPCR sugeriram que somente os oligômeros (e não as fibrilas maduras) de amilina modulam genes relacionados a apoptose (Anxa1, Rab5a) e ao estresse oxidativo (Nos2 e Xdh), o que vai ao encontro dos estudos mais recentes que atribuem às fibrilas intermediárias um papel na citotoxicidade das células . Um achado novo do presente estudo foi a identificação do mRNA do Gipr (receptor de polipeptídeo inibitório gástrico) como alvo de regulação negativa pelos oligômeros de amilina, o que sugere que esse possa ser um mecanismo adicional pelo qual essas fibrilas intermediárias de amilina sejam deletérias para a célula pancreática. / Type 2 diabetes mellitus is a chronic disease in which there is inability of pancreatic cells to secrete sufficient insulin to overcome the insulin resistance in the peripheral tissues with resultant hyperglycemia. Mechanisms leading to diminished insulin secretion are not completely known and the amyloid deposit, a frequent histopathological finding in patients with type 2 diabetes, is believed to be involved. Human amylin, a protein co-secreted with insulin, is capable of aggregating and forming deposits in the pancreatic islets. It is not fully established whether amylin cytotoxicity is mediated by mature amylin fibrils or by soluble oligomers. The objective of this study was to evaluate the gene profiling modulated by oligomers as well as by mature amylin fibrils in rat pancreatic islets. The islets were isolated from Wistar rats, maintained in culture for 24 hours and then treated with 10 M of oligomers or mature amylin fibrils for additional 24 hour in physiologic and supraphysiologic glucose concentrations. Total RNA was extracted and used for gene expression analysis by microarray. RNA content of some modulated genes was evaluated by RT-qPCR in order to validate the results obtained from the microarray analysis. The analysis of the pathways significantly affected by the two amylin preparations demonstrated that, in islets maintained in physiological glucose concentration, amylin oligomers modulated, among others, processes related to Response to stress and to Apoptosis, which were not modulated by mature amylin fibrils. In supraphysiological glucose concentration, treatment with oligomers did not modulate the pathways related to Stress and Apoptosis, which were replaced by processes related to Endocytosis regulation and Nitric oxide biosynthesis. RT-qPCR results suggested that only amylin oligomers modulate genes related to apoptosis (Anxa1, Rab5a) and oxidative stress (Nos2 e Xdh), which is in agreement with studies indicating a role for oligomers in the cytotoxicity of cells. A new finding of the present study was the identification of the Gipr (gastric inhibitory polypeptide receptor) mRNA as a target for downregulation by amylin oligomers, which suggests that this might be an additional mechanism by which these oligomers are deleterious to the pancreatic cells.

O depósito de amilina é um achado histopatológico frequente em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) e parece estar relacionado à disfunção da célula beta pancreática característica desta doença. Um estudo previamente desenvolvido em nosso laboratório verificou que oligômeros de amilina humana provocam diminuição na expressão do mRNA do gene que codifica o receptor do hormônio incretínico peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (Gipr) e aumento do índice de apoptose em ilhotas pancreáticas de rato mantidas em cultura. Considerando o importante papel do depósito amilóide e das incretinas na fisiopatologia do DM 2, os objetivos deste trabalho foram investigar (1) o efeito da amilina humana sobre a expressão dos receptores de incretinas e (2) a modulação de seu efeito tóxico por outras condições concomitantes presentes no DM, como a lipotoxicidade e os produtos finais de glicação avançada (AGEs). Para isto, foi realizada a avaliação da expressão do mRNA dos genes Gipr e Glp1r (receptor do peptídeo semelhante ao glucagon) por PCR em tempo real em ilhotas expostas apenas aos oligômeros de amilina humana (10 M) por 4 e 8 h e em ilhotas expostas aos oligômeros e ao palmitato (0,5 mM) por 24 e 48 h; avaliação da expressão das proteínas GIPR e GLP1R por Western blot em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina por 12 h; e avaliação do índice de apoptose pela quantificação da atividade de caspase 3 em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina isoladamente, ou na presença de palmitato (0,5mM) por 48 h ou 5 mg/ml de albumina glicada (AlbGAD) por 72 h. A amilina não provocou alteração na expressão dos genes Gipr e Glp1r após 4 h de exposição. Após 8 e 24 h de tratamento, os oligômeros modularam negativamente a expressão destes genes. Entretanto, o tratamento das ilhotas com amilina por 48 h resultou no aumento da expressão do mRNA dos receptores de incretinas. O tratamento simultâneo com palmitato não alterou o efeito modulatório da amilina sobre a expressão dos genes Gipr e Glp1r após 24 e 48 h. A exposição das ilhotas aos oligômeros de amilina por 12 h não causou alteração na expressão das proteínas GIPR e GLP1R. A lipotoxicidade e a albumina glicada não aumentaram o efeito pró-apoptótico da amilina sobre as ilhotas pancreáticas. Em conclusão, a redução na expressão gênica dos receptores de incretinas em ilhotas pancreáticas de rato expostas aos oligômeros de amilina, que poderia indicar um mecanismo adicional pelo qual a amilina exerceria seu efeito deletério sobre células beta, diminuindo o efeito insulinotrópico induzido pelas incretinas em pacientes com DM 2, não foi constatada em relação à expressão protéica de GIPR e GLP1R no período de tempo estudado. O aumento na expressão do mRNA destes receptores provocado pela amilina após 48 horas de incubação poderia ser um mecanismo de compensação das células frente aos efeitos tóxicos dos oligômeros de amilina. O efeito próapoptótico da amilina humana sobre as células beta não parece ser potencializado pela lipotoxicidade ou por AGEs / The amyloid deposit is a common histopathological feature in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and it seems to be related to the pancreatic beta cell dysfunction characteristic of this disease. A study previously developed in our laboratory found that human amylin oligomers decrease mRNA expression of the glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (Gipr) and increase apoptosis rate in rat pancreatic islets maintained in culture. Considering the important role of the amyloid deposition and of incretins in the pathophysiology of T2DM, the aims of the present study were to investigate (1) the effect of human amylin on the expression of incretin receptors and (2) the modulation of amylin toxicity by other concomitant conditions present in T2DM, as lipotoxicity and advanced glycation end products (AGEs). The evaluation of mRNA expression of Gipr and Glp1r (glucagonlike peptide -1 receptor) was performed by real time PCR in islets exposed only to human amylin oligomers (10 M) for 4 and 8 h, and in islets exposed to human amylin and palmitate (0,5 mM) for 24 and 48 h; GIPR and GLP1R protein expression was assessed by Western blot in islets treated with amylin oligomers by 12 h; apoptosis rate was evaluated by measuring caspase 3 activity in islets treated with amylin alone or combined to palmitate (0,5 mM) for 48 h or 5 mg/mL of glycated albumin (AlbGAD) for 72 h. Amylin did not affect the expression of Gipr and Glp1r mRNA following 4 h of exposure. Eight and 24 h after treatment, amylin negatively modulated the expression of these genes. However, treatment of the islets for 48 h with amylin elicited an increase in mRNA expression of both incretin receptors. The simultaneous treatment with palmitate did not change the effects of amylin on the expression of Gipr and Glp1r mRNA after 24 and 48 h. Exposure of islets to amylin for 12 h caused no change in GIPR and GLP1R protein expression. Lipotoxocity and glycated albumin did not increase the pro-apoptotic effect of amylin on pancreatic islets. In conclusion, the reduction in mRNA expression of the incretin receptors on rat pancreatic islets exposed to amylin, which could indicate an additional mechanism whereby amylin exert its deleterious effect on beta cells, reducing the insulinotropic effects of incretins in patients with T2DM was not confirm regarding GIPR and GLP1R protein expression at the time period studied. The increased mRNA expression of these receptors caused by amylin after 48 h of incubation could be a compensation mechanism against the toxic effects of amylin oligomers. The pro-apoptotic effect of amylin on human beta cells does not appear to be potentiated by lipotoxicity or by advanced glycation end products

O depósito de amilina é um achado histopatológico frequente em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) e parece estar relacionado à disfunção da célula beta pancreática característica desta doença. Um estudo previamente desenvolvido em nosso laboratório verificou que oligômeros de amilina humana provocam diminuição na expressão do mRNA do gene que codifica o receptor do hormônio incretínico peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (Gipr) e aumento do índice de apoptose em ilhotas pancreáticas de rato mantidas em cultura. Considerando o importante papel do depósito amilóide e das incretinas na fisiopatologia do DM 2, os objetivos deste trabalho foram investigar (1) o efeito da amilina humana sobre a expressão dos receptores de incretinas e (2) a modulação de seu efeito tóxico por outras condições concomitantes presentes no DM, como a lipotoxicidade e os produtos finais de glicação avançada (AGEs). Para isto, foi realizada a avaliação da expressão do mRNA dos genes Gipr e Glp1r (receptor do peptídeo semelhante ao glucagon) por PCR em tempo real em ilhotas expostas apenas aos oligômeros de amilina humana (10 M) por 4 e 8 h e em ilhotas expostas aos oligômeros e ao palmitato (0,5 mM) por 24 e 48 h; avaliação da expressão das proteínas GIPR e GLP1R por Western blot em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina por 12 h; e avaliação do índice de apoptose pela quantificação da atividade de caspase 3 em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina isoladamente, ou na presença de palmitato (0,5mM) por 48 h ou 5 mg/ml de albumina glicada (AlbGAD) por 72 h. A amilina não provocou alteração na expressão dos genes Gipr e Glp1r após 4 h de exposição. Após 8 e 24 h de tratamento, os oligômeros modularam negativamente a expressão destes genes. Entretanto, o tratamento das ilhotas com amilina por 48 h resultou no aumento da expressão do mRNA dos receptores de incretinas. O tratamento simultâneo com palmitato não alterou o efeito modulatório da amilina sobre a expressão dos genes Gipr e Glp1r após 24 e 48 h. A exposição das ilhotas aos oligômeros de amilina por 12 h não causou alteração na expressão das proteínas GIPR e GLP1R. A lipotoxicidade e a albumina glicada não aumentaram o efeito pró-apoptótico da amilina sobre as ilhotas pancreáticas. Em conclusão, a redução na expressão gênica dos receptores de incretinas em ilhotas pancreáticas de rato expostas aos oligômeros de amilina, que poderia indicar um mecanismo adicional pelo qual a amilina exerceria seu efeito deletério sobre células beta, diminuindo o efeito insulinotrópico induzido pelas incretinas em pacientes com DM 2, não foi constatada em relação à expressão protéica de GIPR e GLP1R no período de tempo estudado. O aumento na expressão do mRNA destes receptores provocado pela amilina após 48 horas de incubação poderia ser um mecanismo de compensação das células frente aos efeitos tóxicos dos oligômeros de amilina. O efeito próapoptótico da amilina humana sobre as células beta não parece ser potencializado pela lipotoxicidade ou por AGEs / The amyloid deposit is a common histopathological feature in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and it seems to be related to the pancreatic beta cell dysfunction characteristic of this disease. A study previously developed in our laboratory found that human amylin oligomers decrease mRNA expression of the glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (Gipr) and increase apoptosis rate in rat pancreatic islets maintained in culture. Considering the important role of the amyloid deposition and of incretins in the pathophysiology of T2DM, the aims of the present study were to investigate (1) the effect of human amylin on the expression of incretin receptors and (2) the modulation of amylin toxicity by other concomitant conditions present in T2DM, as lipotoxicity and advanced glycation end products (AGEs). The evaluation of mRNA expression of Gipr and Glp1r (glucagonlike peptide -1 receptor) was performed by real time PCR in islets exposed only to human amylin oligomers (10 M) for 4 and 8 h, and in islets exposed to human amylin and palmitate (0,5 mM) for 24 and 48 h; GIPR and GLP1R protein expression was assessed by Western blot in islets treated with amylin oligomers by 12 h; apoptosis rate was evaluated by measuring caspase 3 activity in islets treated with amylin alone or combined to palmitate (0,5 mM) for 48 h or 5 mg/mL of glycated albumin (AlbGAD) for 72 h. Amylin did not affect the expression of Gipr and Glp1r mRNA following 4 h of exposure. Eight and 24 h after treatment, amylin negatively modulated the expression of these genes. However, treatment of the islets for 48 h with amylin elicited an increase in mRNA expression of both incretin receptors. The simultaneous treatment with palmitate did not change the effects of amylin on the expression of Gipr and Glp1r mRNA after 24 and 48 h. Exposure of islets to amylin for 12 h caused no change in GIPR and GLP1R protein expression. Lipotoxocity and glycated albumin did not increase the pro-apoptotic effect of amylin on pancreatic islets. In conclusion, the reduction in mRNA expression of the incretin receptors on rat pancreatic islets exposed to amylin, which could indicate an additional mechanism whereby amylin exert its deleterious effect on beta cells, reducing the insulinotropic effects of incretins in patients with T2DM was not confirm regarding GIPR and GLP1R protein expression at the time period studied. The increased mRNA expression of these receptors caused by amylin after 48 h of incubation could be a compensation mechanism against the toxic effects of amylin oligomers. The pro-apoptotic effect of amylin on human beta cells does not appear to be potentiated by lipotoxicity or by advanced glycation end products