Células HEK293T e Huh7 foram adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM). Parâmetros metabólicos e de crescimento foram avaliados, além da expressão gênica heteróloga, utilizando um sistema de expressão que produz pseudo-partículas (ppHCV), derivadas do vírus da Leucemia Murina (MLV) e da Hepatite C (HCV). A adaptação foi realizada através de diluição sequencial para SFM. A linhagem HEK293T foi adaptada em dois SFM: Hybridoma-SFM e CHO-S-SFMII, a linhagem Huh7 foi adaptada nos quatro SFM escolhidos. O consumo de substratos para cada linhagem foi diferente entre os SFM, apesar de o crescimento celular ter sido semelhante. Para a análise da expressão gênica, três vetores foram co-transfectados em células HEK293T. Foi observado que para a produção de ppHCV, o tempo de coleta foi de 48 horas. O método de co-transfecção por lipofectamina produziu mais cópias de vírus, sendo que quantificações de 5,30x103 cópias RNA/μL foram encontradas para vírus produzidos em células adaptadas no meio Hybridoma-SFM através de qRT-PCR. Estas ppHCV foram usadas para infectar células Huh7, células infectadas produziram cerca de 10 ng de proteína recombinante/106 células. / HEK 293-T and Huh7 cells were adapted in serum free mediu (SFM). Metabolic and growth parameters were assessed, as well as heterologous gene expression, using an expression system that produces pseudo-particles (ppHCV), derived from the murine leukemia virus (MLV), and Hepatitis C (HCV). The adaptation was performed by sequential dilution in SFM. The HEK- 293T line was adapted in two SFM: Hybridoma-SFM and CHO-S-SFMII, the Huh7 line was adapted in four chosen SFM. The consumption of substrates were different for each line in SFM, while cell growth was similar. For the analysis of gene expression, three vectors were co-transfected into HEK-293T cells. It was observed that for the production of ppHCV, the collection time was 48 hours. The method of co-transfection with lipofectamine produced more copies of the virus into the cells, 5,30 x103 RNA copies/μL were found to virus produced in the cells adapted in Hybridoma- SFM, by qRT-PCR. These ppHCV were used to infect Huh 7, infected cells produced around 10 ng recombinant protein /106 cells.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

Células HEK293T e Huh7 foram adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM). Parâmetros metabólicos e de crescimento foram avaliados, além da expressão gênica heteróloga, utilizando um sistema de expressão que produz pseudo-partículas (ppHCV), derivadas do vírus da Leucemia Murina (MLV) e da Hepatite C (HCV). A adaptação foi realizada através de diluição sequencial para SFM. A linhagem HEK293T foi adaptada em dois SFM: Hybridoma-SFM e CHO-S-SFMII, a linhagem Huh7 foi adaptada nos quatro SFM escolhidos. O consumo de substratos para cada linhagem foi diferente entre os SFM, apesar de o crescimento celular ter sido semelhante. Para a análise da expressão gênica, três vetores foram co-transfectados em células HEK293T. Foi observado que para a produção de ppHCV, o tempo de coleta foi de 48 horas. O método de co-transfecção por lipofectamina produziu mais cópias de vírus, sendo que quantificações de 5,30x103 cópias RNA/μL foram encontradas para vírus produzidos em células adaptadas no meio Hybridoma-SFM através de qRT-PCR. Estas ppHCV foram usadas para infectar células Huh7, células infectadas produziram cerca de 10 ng de proteína recombinante/106 células. / HEK 293-T and Huh7 cells were adapted in serum free mediu (SFM). Metabolic and growth parameters were assessed, as well as heterologous gene expression, using an expression system that produces pseudo-particles (ppHCV), derived from the murine leukemia virus (MLV), and Hepatitis C (HCV). The adaptation was performed by sequential dilution in SFM. The HEK- 293T line was adapted in two SFM: Hybridoma-SFM and CHO-S-SFMII, the Huh7 line was adapted in four chosen SFM. The consumption of substrates were different for each line in SFM, while cell growth was similar. For the analysis of gene expression, three vectors were co-transfected into HEK-293T cells. It was observed that for the production of ppHCV, the collection time was 48 hours. The method of co-transfection with lipofectamine produced more copies of the virus into the cells, 5,30 x103 RNA copies/μL were found to virus produced in the cells adapted in Hybridoma- SFM, by qRT-PCR. These ppHCV were used to infect Huh 7, infected cells produced around 10 ng recombinant protein /106 cells.

Células de mamíferos são os hospedeiros mais frequentemente utilizados para a fabricação de proteínas biofarmacêuticas e para a produção de vacinas virais, A qualidade é um elemento-chave para o estabelecimento de um processo de bioconversão eficiente. No presente trabalho utilizamos a linhagem de células BHK- 21C13(Baby Hamster Kidney) adaptadas para cultivo em suspensão. O uso de Soro Fetal Bovino (SFB) é tradicionalmente utilizado, sendo considerado um suplemento universal, pois permite o crescimento em várias linhagens de células de mamíferos; porém, uso de SFB apresenta risco de infecção por prions, variabilidade entre lotes e aumento no custo em etapa de purificação (Downstream processing). O objetivo do presente trabalho foi comparar o cultivo de células BHK-21 C13 entre dois meios suplementados com SFB e sem SFB, através do estudo cinético para cultivo em suspensão estático e agitado com frascoT, frasco spinner e biorreator, respectivamente. Os parâmetros; Xmáx e µmáx, não foram significativamente influenciados pelo meio de cultura em cultivo estático, em cultivo com agitação em frasco spinner e também no cultivo em biorreator. O tempo de duplicação ficou próximo para todas as condições testadas. A produtividade alcançada foi: 0,032x106 cel/mL.h-1 para o meio com SFB e 0,031 X106 cel/mL.h-1 para o meio sem SFB. Ao final do processo foi possível obter uma concentração celular em torno de 4,7x106 cel/mL, tanto para o cultivo com SFB quanto para o cultivo sem SFB. Dessa forma, o uso de meio de cultivo sem SFB não alterou os principais parâmetros cinéticos, não apresentando as desvantagens do uso do SFB. / Mammalian cells are the most frequently used hosts for the production of biopharmaceutical proteins and viral vaccines. Quality is a key element for the establishment of an efficient bioconversion process. In this work, we used the cell line Baby Hamster Kidney C13 (BHK-21 C13) adapted to suspension culture was used. Fetal Bovine Serum (FBS) is traditionally used and it is considered a universal insert due to its power to increase cell growth in this kind of animal cells. However, the utilization of FBS introduces risks of infection from prions, variability between batches and increase in cost associated to purification stages (downstream processing). This work aimed to compare the kinetic behaviors of BHK-21 C13 cells in two media supplemented with FBS and without FBS using both one static and two suspension systems, T-flask, spinner flask and bioreactor respectively. The parameters; Xmax and µmax were not significantly influenced by the culture medium in T- flask culture static, in spinner flask cultivation and were neither significantly influenced by growing in culture media stirred bioreactor. The doubling time was close to all conditions tested. At the end of the growth phase it was possible to obtain a nearby cell concentration of 4.7 x 106 cells / ml, both for cultivation with FBS as for FBS without cultivation. Thus, the use of culture medium without FBS did not affect the main kinetic parameters. Besides, it does not show the disadvantages of culture media using FBS.

O objetivo deste trabalho foi estudar o processo pelo qual hormônios e fatores de crescimento controlam a proliferação celular em mamíferos. O modelo experimental utilizado foi linhagens de células estabelecidas em cultura. Os estudos centraram-se em dois tipos básicos de células: fibroblastos e células adrenais e o ataque experimental foi feito sob dois pontos de vista: bioquímico e genético. O ataque bioquímico envolveu desenvolver estudos cinéticos da síntese de DNA não só durante o carenciamento de células para soro, como também durante a reestimulação de células carenciadas por:soro, hormônios e fatores de crescimento. Medidas do conteúdo intracelular de cAMP foram efetuadas com o intuito de adquirir informações à respeito do mecanismo de ação destes fatores. Um modelo de ciclo celular foi proposto no qual o controle do crescimento seria exercido através de reguladores positivos e negativos que agiriam estimulando ou inibindo a passagem de células do estado de repouso (Go) para a fase proliferativa. Entre os reguladores positivos (estimuladores) do sistema fibroblasto, encontra-se hormônios clássicos, como esteróides e insulina, e fatores de crescimento de natureza hormonal como EGF, PF (fator proteico extraído de glândulas pituitárias) e prostaglandina F2α. O esteróide hidrocortisona pode agir como regulador negativo, inibindo o crescimento de fibroblastos. Medidas do período de tempo transcorrido desde a estimulação de células carenciadas (Go), até o aparecimento da onda de síntese de DNA (período definido operacionalmente como Gl) foram feitas. Em fibroblastos 3T3 este período foi de 12 a 13 horas tanto para células estimuladas com soro como com hormônios clássicos (hidrocortisona, insulina) ou fatores de crescimento (EGF, PF) ou ainda com combinações deles (EGF + PF + insulina; PF + hidrocortisona; PF + hidrocortisona + insulina). No sistema células adrenais, adrenocorticotropina (ACTH) foi o único hormônio clássico que apresentou atividade sobre o crescimento destas células e também o único efetuador negativo encontrado. Neste sistema PF mostrou-se como o único fator com atividade estimulatória sobre o crescimento. Gl aqui foi de 11 horas tanto para células estimuladas com soro como com PF. Além disso os hormônios clássicos hidrocortisona e insulina não apresentaram atividade estimulatória por si só ou em combinação com PF. A análise da ação de hidrocortisona no sistema fibroblasto e de ACTH no sistema células adrenais estimuladas, forneceu evidências de que após deixar Go, em direção a S, numa certa altura de Gl as células tornam-se irreversivelmente comprometidas com o processo replicativo. Este comprometimento parece ocorrer 5 horas antes de S, sendo referido como Glc. Em face destes resultados foi proposto que os reguladores agem estimulando ou inibindo a transição Go → Glc. Na tentativa de obter maior definição do sistema de controle do crescimento, aproveitamo-nos das vantagens oferecidas pelo modelo experimental usado, para a busca de mutantes do tipo regulatório. Esta busca resultou no isolamento das linhagens ST1 e AR-1, derivadas, respectivamente, de fibroblastos 3T3 e células adrenais Y-l. Entre os vários aspectos interessantes da linhagem ST1 destaca-se: a) o dramático efeito de hidrocortisona causando mudança nas características das células as quais passam de um fenótipo tipicamente transformado para normal. Este fenômeno foi observado tanto \"in vitro\" (através de medidas de parâmetros de crescimento) como \"in vivo\" (através de ensaios de tumorogenicidade); b) as alterações morfológicas de caráter antagônico provocadas, por um lado, pela adição de hidrocortisona (causando achatamento) e, por outro, pela retirada do soro ou adição de cAMP ao meio de cultura (arredondamento). Através do estudo da ação de inibidores, obteve-se evidências do envolvimento de microtúbulos nestas alterações morfológicas. A análise do conteúdo intracelular de cAMP indicou que este nucleotídeo não atua como mediador da ação de hidrocortisona. Sua ação parece ser devida à indução de alterações no sistema superfície celular - membrana -citoesqueleto. Ao contrário de outros variantes de células Y-l resistentes à ACTH, células AR-1 mostraram-se também resistentes a cAMP. A utilidade destas células nos estudos da postulada mediação deste nucleotídeo na ação de ACTH, é óbvia. / The aim of this work was to study the process by which hormones and growth factors control proliferation of mammalian cells. Cell lines established in culture were used as the experimental model. The studies were centered on two basic types of cells: fibroblasts and adrenal cells and the experimental approach was made from two viewpoints: biochemical and genetic. The biochemical approach involved kinetic studies of the DNA synthesis process not only during serum starvation but also during restimulation of serum starved cells by serum, hormones and growth factors. Intracellular cyclic AMP determinations were made in order to gain informations on the mechanism of action of these factors. A cell cycle model was proposed in which cell growth control would be exerted by positive and negative regulators that would act by stimulating or inhibiting the flow of cells from a resting state (Go) to the proliferative phase. Among the positive regulators (stimulators) found for the fibroblast system are: classical hormones, like steroids and insulin, and growth factors of homonal nature, like EGF, PF (protein factor extracted from pituitary glands) and prostaglandin F2α. The steroid hydrocortisone can also act as a negative regulator, inhibiting fibroblast growth. Measurements of the time interval between stimulation of serum starved (Go) cells and the onset of DNA synthesis (period that is operationally defined as Gl) were made. In 3T3 fibroblasts this period was 12 to 13 hours for cells stimulated not only by serum but also by classical hormones (hydrocortisone, insulin) or growth factors (EGF, PF) or even by combinations of these factors (EGF + PF + insulin; PF + hydrocortisone; PF + hydrocortisone + insulin). In the adrenal system, adrenocorticotropin (ACTH) was the only classical hormone to present activity on the growth of these cells and also the only negative regulator found. In this system PF was shown to be the only factor with growth stimulatory activity. GL was estimated as 11 hours for cells stimulated with serum or PF. Moreover hydrocortisone and insulin had no stimulatory activity \"per si\" or in combination with PF. The analysis of hydrocortisone action on the fibroblast system on one hand and of that of ACTH on the adrenal system, on the other, indicated that upon leaving Go, towards S, at a certain point in Gl, cells become irreversibly committed to the replicative process. This commitment seems to occur 5 hours before S and is referred to as Glc. In view of these data we proposed that regulators act by stimulating or inhibiting the transition Go → Glc. In an attempt to obtain a better definition of the growth control system and taking advantage of the experimental model utilized, we searched for mutants of the regulatory type. This search resulted in the isolation of the lines ST1 and AR-l from 3T3 fibroblasts and Y-l adrenal cells, respectively. Among several interesting aspects of the STl cell line, we point out: a) the dramatic effect of hydrocortisone changing the characteristics of these cells from a typically transformed phenotype to a normal pattern. This phenomenon was observed both \"in vitro\" (by measuring a number of growth parameters) and \"in vivo\" (by tumorogenicity assays). b) morphological alterations of antagonistic nature caused by hydrocortisone (flattening) on one hand, and by the removal of serum or cAMP addition to the culture medium (rounding) on the other. Evidence for the involvement of microtubules in these alterations were obtained through studies on the action of several inhibitors. Quantitative analysis of intracellular cAMP indicated that this nucleotide does not act as a mediator of hydrocortisone action. Rather, this action seems to be due to the induction of alterations on the cell surface-membrane-cytoskeleton system. Contrary to other variants of the Y-1 line which are resistant to ACTH, AR-1 cells are also resistant to cAMP. The usefulness of these cells in studies of the postulated mediation by cAMP of the ACTH action, is obvious.

Células de mamíferos são os hospedeiros mais frequentemente utilizados para a fabricação de proteínas biofarmacêuticas e para a produção de vacinas virais, A qualidade é um elemento-chave para o estabelecimento de um processo de bioconversão eficiente. No presente trabalho utilizamos a linhagem de células BHK- 21C13(Baby Hamster Kidney) adaptadas para cultivo em suspensão. O uso de Soro Fetal Bovino (SFB) é tradicionalmente utilizado, sendo considerado um suplemento universal, pois permite o crescimento em várias linhagens de células de mamíferos; porém, uso de SFB apresenta risco de infecção por prions, variabilidade entre lotes e aumento no custo em etapa de purificação (Downstream processing). O objetivo do presente trabalho foi comparar o cultivo de células BHK-21 C13 entre dois meios suplementados com SFB e sem SFB, através do estudo cinético para cultivo em suspensão estático e agitado com frascoT, frasco spinner e biorreator, respectivamente. Os parâmetros; Xmáx e µmáx, não foram significativamente influenciados pelo meio de cultura em cultivo estático, em cultivo com agitação em frasco spinner e também no cultivo em biorreator. O tempo de duplicação ficou próximo para todas as condições testadas. A produtividade alcançada foi: 0,032x106 cel/mL.h-1 para o meio com SFB e 0,031 X106 cel/mL.h-1 para o meio sem SFB. Ao final do processo foi possível obter uma concentração celular em torno de 4,7x106 cel/mL, tanto para o cultivo com SFB quanto para o cultivo sem SFB. Dessa forma, o uso de meio de cultivo sem SFB não alterou os principais parâmetros cinéticos, não apresentando as desvantagens do uso do SFB. / Mammalian cells are the most frequently used hosts for the production of biopharmaceutical proteins and viral vaccines. Quality is a key element for the establishment of an efficient bioconversion process. In this work, we used the cell line Baby Hamster Kidney C13 (BHK-21 C13) adapted to suspension culture was used. Fetal Bovine Serum (FBS) is traditionally used and it is considered a universal insert due to its power to increase cell growth in this kind of animal cells. However, the utilization of FBS introduces risks of infection from prions, variability between batches and increase in cost associated to purification stages (downstream processing). This work aimed to compare the kinetic behaviors of BHK-21 C13 cells in two media supplemented with FBS and without FBS using both one static and two suspension systems, T-flask, spinner flask and bioreactor respectively. The parameters; Xmax and µmax were not significantly influenced by the culture medium in T- flask culture static, in spinner flask cultivation and were neither significantly influenced by growing in culture media stirred bioreactor. The doubling time was close to all conditions tested. At the end of the growth phase it was possible to obtain a nearby cell concentration of 4.7 x 106 cells / ml, both for cultivation with FBS as for FBS without cultivation. Thus, the use of culture medium without FBS did not affect the main kinetic parameters. Besides, it does not show the disadvantages of culture media using FBS.

O objetivo deste trabalho foi estudar o processo pelo qual hormônios e fatores de crescimento controlam a proliferação celular em mamíferos. O modelo experimental utilizado foi linhagens de células estabelecidas em cultura. Os estudos centraram-se em dois tipos básicos de células: fibroblastos e células adrenais e o ataque experimental foi feito sob dois pontos de vista: bioquímico e genético. O ataque bioquímico envolveu desenvolver estudos cinéticos da síntese de DNA não só durante o carenciamento de células para soro, como também durante a reestimulação de células carenciadas por:soro, hormônios e fatores de crescimento. Medidas do conteúdo intracelular de cAMP foram efetuadas com o intuito de adquirir informações à respeito do mecanismo de ação destes fatores. Um modelo de ciclo celular foi proposto no qual o controle do crescimento seria exercido através de reguladores positivos e negativos que agiriam estimulando ou inibindo a passagem de células do estado de repouso (Go) para a fase proliferativa. Entre os reguladores positivos (estimuladores) do sistema fibroblasto, encontra-se hormônios clássicos, como esteróides e insulina, e fatores de crescimento de natureza hormonal como EGF, PF (fator proteico extraído de glândulas pituitárias) e prostaglandina F2α. O esteróide hidrocortisona pode agir como regulador negativo, inibindo o crescimento de fibroblastos. Medidas do período de tempo transcorrido desde a estimulação de células carenciadas (Go), até o aparecimento da onda de síntese de DNA (período definido operacionalmente como Gl) foram feitas. Em fibroblastos 3T3 este período foi de 12 a 13 horas tanto para células estimuladas com soro como com hormônios clássicos (hidrocortisona, insulina) ou fatores de crescimento (EGF, PF) ou ainda com combinações deles (EGF + PF + insulina; PF + hidrocortisona; PF + hidrocortisona + insulina). No sistema células adrenais, adrenocorticotropina (ACTH) foi o único hormônio clássico que apresentou atividade sobre o crescimento destas células e também o único efetuador negativo encontrado. Neste sistema PF mostrou-se como o único fator com atividade estimulatória sobre o crescimento. Gl aqui foi de 11 horas tanto para células estimuladas com soro como com PF. Além disso os hormônios clássicos hidrocortisona e insulina não apresentaram atividade estimulatória por si só ou em combinação com PF. A análise da ação de hidrocortisona no sistema fibroblasto e de ACTH no sistema células adrenais estimuladas, forneceu evidências de que após deixar Go, em direção a S, numa certa altura de Gl as células tornam-se irreversivelmente comprometidas com o processo replicativo. Este comprometimento parece ocorrer 5 horas antes de S, sendo referido como Glc. Em face destes resultados foi proposto que os reguladores agem estimulando ou inibindo a transição Go → Glc. Na tentativa de obter maior definição do sistema de controle do crescimento, aproveitamo-nos das vantagens oferecidas pelo modelo experimental usado, para a busca de mutantes do tipo regulatório. Esta busca resultou no isolamento das linhagens ST1 e AR-1, derivadas, respectivamente, de fibroblastos 3T3 e células adrenais Y-l. Entre os vários aspectos interessantes da linhagem ST1 destaca-se: a) o dramático efeito de hidrocortisona causando mudança nas características das células as quais passam de um fenótipo tipicamente transformado para normal. Este fenômeno foi observado tanto \"in vitro\" (através de medidas de parâmetros de crescimento) como \"in vivo\" (através de ensaios de tumorogenicidade); b) as alterações morfológicas de caráter antagônico provocadas, por um lado, pela adição de hidrocortisona (causando achatamento) e, por outro, pela retirada do soro ou adição de cAMP ao meio de cultura (arredondamento). Através do estudo da ação de inibidores, obteve-se evidências do envolvimento de microtúbulos nestas alterações morfológicas. A análise do conteúdo intracelular de cAMP indicou que este nucleotídeo não atua como mediador da ação de hidrocortisona. Sua ação parece ser devida à indução de alterações no sistema superfície celular - membrana -citoesqueleto. Ao contrário de outros variantes de células Y-l resistentes à ACTH, células AR-1 mostraram-se também resistentes a cAMP. A utilidade destas células nos estudos da postulada mediação deste nucleotídeo na ação de ACTH, é óbvia. / The aim of this work was to study the process by which hormones and growth factors control proliferation of mammalian cells. Cell lines established in culture were used as the experimental model. The studies were centered on two basic types of cells: fibroblasts and adrenal cells and the experimental approach was made from two viewpoints: biochemical and genetic. The biochemical approach involved kinetic studies of the DNA synthesis process not only during serum starvation but also during restimulation of serum starved cells by serum, hormones and growth factors. Intracellular cyclic AMP determinations were made in order to gain informations on the mechanism of action of these factors. A cell cycle model was proposed in which cell growth control would be exerted by positive and negative regulators that would act by stimulating or inhibiting the flow of cells from a resting state (Go) to the proliferative phase. Among the positive regulators (stimulators) found for the fibroblast system are: classical hormones, like steroids and insulin, and growth factors of homonal nature, like EGF, PF (protein factor extracted from pituitary glands) and prostaglandin F2α. The steroid hydrocortisone can also act as a negative regulator, inhibiting fibroblast growth. Measurements of the time interval between stimulation of serum starved (Go) cells and the onset of DNA synthesis (period that is operationally defined as Gl) were made. In 3T3 fibroblasts this period was 12 to 13 hours for cells stimulated not only by serum but also by classical hormones (hydrocortisone, insulin) or growth factors (EGF, PF) or even by combinations of these factors (EGF + PF + insulin; PF + hydrocortisone; PF + hydrocortisone + insulin). In the adrenal system, adrenocorticotropin (ACTH) was the only classical hormone to present activity on the growth of these cells and also the only negative regulator found. In this system PF was shown to be the only factor with growth stimulatory activity. GL was estimated as 11 hours for cells stimulated with serum or PF. Moreover hydrocortisone and insulin had no stimulatory activity \"per si\" or in combination with PF. The analysis of hydrocortisone action on the fibroblast system on one hand and of that of ACTH on the adrenal system, on the other, indicated that upon leaving Go, towards S, at a certain point in Gl, cells become irreversibly committed to the replicative process. This commitment seems to occur 5 hours before S and is referred to as Glc. In view of these data we proposed that regulators act by stimulating or inhibiting the transition Go → Glc. In an attempt to obtain a better definition of the growth control system and taking advantage of the experimental model utilized, we searched for mutants of the regulatory type. This search resulted in the isolation of the lines ST1 and AR-l from 3T3 fibroblasts and Y-l adrenal cells, respectively. Among several interesting aspects of the STl cell line, we point out: a) the dramatic effect of hydrocortisone changing the characteristics of these cells from a typically transformed phenotype to a normal pattern. This phenomenon was observed both \"in vitro\" (by measuring a number of growth parameters) and \"in vivo\" (by tumorogenicity assays). b) morphological alterations of antagonistic nature caused by hydrocortisone (flattening) on one hand, and by the removal of serum or cAMP addition to the culture medium (rounding) on the other. Evidence for the involvement of microtubules in these alterations were obtained through studies on the action of several inhibitors. Quantitative analysis of intracellular cAMP indicated that this nucleotide does not act as a mediator of hydrocortisone action. Rather, this action seems to be due to the induction of alterations on the cell surface-membrane-cytoskeleton system. Contrary to other variants of the Y-1 line which are resistant to ACTH, AR-1 cells are also resistant to cAMP. The usefulness of these cells in studies of the postulated mediation by cAMP of the ACTH action, is obvious.