O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4615.pdf: 2688296 bytes, checksum: 18c8fbe6fb83004856a32c02827d70f5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / Rabies is a zoonotic viral disease caused by a virus of the genus Lyssavirus that affects several species of mammals. Rabies remains a global public health threat that kills more than 55,000 people per year mainly in developing countries, this disease once established do not have a specific treatment. The RV envelope is composed of a glycoprotein, known as a unique antigen capable of conferring immune response against the rabies, and therefore, is the focus of research for development an efficient and safe recombinant vaccine based on this viral antigen. Cell line stably transfected S2 Drosophila melanogaster have been used in the production of many heterologous proteins and has been studied for the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP) in our laboratory. This approach involves the selection of high producing cell populations; procedure that requires considerable periods of time (months), increasing management and costs of production. In this sense, in recent decades, many systems focused on the expression of heterologous proteins by transient expression of genes, were analyzed because they allow obtaining significant quantities of recombinant protein in a short period of time (weeks). For the use of transient transfection technology can be found a variety of methods and available agents, such as electroporation, cationic lipids, cationic polymers and calcium phosphate precipitated. The choice and optimization of each of them depends mainly on the cell type and protein being expressed. Thus, the objective of this study was to evaluate the transient expression of the glycoprotein gene of rabies virus (RVGP) in insect cells of Drosophila melanogaster S2 lineage, evaluating the vehicles transfection: calcium phosphate, cationic lipid (Cellfectin) and cationic polymer (ExGen500 and JetPEI). In order to determine the most efficient transfection agent, experiments were performed in 6 well plate and bottle of 100 mL of culture, which analyzed the influence of cell density, the concentration of DNA and transfection reagent volume on the expression of RVGP assessed by ELISA and fluorescence microscopy. Yields ranging from 50-90 ng/107cel were obtained in different experiments on multiwell plate, suggesting strong effect of ratio DNA: transfection agent used. Comparison of transfection agents showed no significant differences. In transfections made in suspension culture was analyzed the effect of the plasmid (whether or not the signal of BiP cell secretion) on the expression RVGP. When we used the plasmid containing the signal BiP (pMTiRVGP) were obtained 160 ng/107cel of RVGP production, and 200 ng/mL of volumetric production without significant differences between the different transfection agents. However, significant differences were found when we used the plasmid not containing the signal BiP (pMTRVGP), with the RVGP production was 60 ng/107cells in cells transfected with Cellfectin, ExGen500 and calcium phosphate, except in cells transfected with JetPEI was reached a production of 120 ng/107cells. In preliminary experiment bottle type "spinner" with a working volume of 60 mL were achieved expressions of 140 ng/107cel of RVGP in cells transfected with JetPEI and calcium phosphate. This suggests that optimization of culture conditions and transfection are possible to increase recombinant protein expression in cultured on a large scale. / A raiva é uma enfermidade causada por um vírus do gênero Lyssavirus que afeta várias espécies de mamíferos. Esta doença apresenta um alto custo social e econômico principalmente em países em desenvolvimento. Na superfície do vírus da raiva está localizada a glicoproteína do vírus, reconhecida como antígeno capaz de conferir resposta imunológica contra a raiva, sendo, o foco de pesquisas no desenvolvimento de uma vacina recombinante. Células da linhagem Drosophila melanogaster S2 estavelmente transfectadas têm sido usadas na produção de muitas proteínas heterólogas e tem sido estudada para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em nosso laboratório. A abordagem para a obtenção de linhagens recombinantes estáveis envolve a seleção de populações celulares altamente produtoras; sendo um processo que requer consideráveis períodos de tempo (meses), uma elevada manipulação e altos custos de produção. Neste sentido, nas últimas décadas, muitos sistemas focados na expressão de proteínas heterólogas através da expressão transiente de genes foram analisados, porque eles permitem a obtenção de quantidades consideráveis de proteína recombinante em um curto período de tempo (semanas). Para o uso da tecnologia de transfecção transiente pode ser encontrada uma variedade de métodos e agentes disponíveis, tais como eletroporação, lipídeos catiônicos, polímeros catiônicos e fosfato de cálcio. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão transiente do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto da linhagem Drosophila melanogaster S2, avaliando os veículos de transfecção fosfato de cálcio, lipídeo catiônico (Cellfectin) e polímero catiônico (ExGen500 e JetPEI). A fim de determinar o agente de transfecção mais eficiente, foram feitos experimentos em placa de 6 poços e frasco de cultivo de 100mL, onde foram analisados a influência da densidade celular; a concentração de DNA, o volume do reagente de transfecção sobre a expressão da RVGP analisada através do método de ELISA. Quantidades de RVGP que variaram entre 50-90 ng/107cel foram obtidas nos diferentes experimentos feitos em placa, sugerindo um efeito da relação DNA: agente de transfecção. A comparação entre os agentes de transfecção não mostrou diferenças significativas. Nas transfecções feitas em cultura em suspensão foi analisado o efeito de transfectar o plasmídeo para expressão de RVGP contendo ou não o sinal de secreção celular BiP. Quando foi usado o plasmídeo contendo o sinal BiP (pMTiRVGP) foram atingidas valores de RVGP de 160 ng/107cel e produções volumétricas de 200 ng/mL, porém sem diferenças significativas entre os diferentes agentes de transfecção. Entretanto, foram encontradas diferenças quando foi usado o plasmídeo não contendo o sinal BiP (pMTRVGP), onde a produção de RVGP foi de 60 ng/107cells nas células transfectadas com Cellfectin, ExGen500 e fosfato de cálcio, porém as células transfectadas com JetPEI obtiveram uma produção de 120 ng/107cels de RVGP. Em experimento em frasco de cultivo tipo spinner com volume de trabalho de 60 mL, foram atingidas expressões de RVGP de 140 ng/107cel para células transfectadas com JetPEI e fosfato de cálcio, sugerindo que otimizações nas condições de cultivo e transfecção ainda podem ser testadas visando aumentar a expressão da proteína recombinante em cultivos em larga escala.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.