Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1835.pdf: 1426469 bytes, checksum: f474e4a11463f269c448f21cb7cd2ed6 (MD5) Previous issue date: 2008-03-14 / Universidade Federal de Sao Carlos / The increment of the expression of complex correctly processed recombinant proteins, like the ones produced by animal cells, is essential for the development of an efficient large scale bioprocess. The manipulation of culture conditions plays a very important role in the controlled and optimized expression of these proteins in bioreactors. The response of mammalian and insect cells to temperature effect has been studied by several researchers as a potential strategy to enhance production of recombinant proteins. The present study evaluated the influence of the temperature in the culture of recombinant Drosophila melanogaster S2 cells in Sf-900 II medium supplemented with aminoacids with the aim of enhancing the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP). The cultures were carried out in Schott flasks (in shaker) as well as in a bubble-free stirred tank bioreactor. Five temperatures were tested in Schott flasks cultures: 16, 20, 24, 28 and 34ºC. The results obtained in cultures at those temperatures in terms of maximum specific growth rate (µmax) and maximum RVGP concentration (CGPV max) were, respectively: 0.009, 0.020, 0.039, 0.036 and 0.022 h-1, and 0.075, 2.973, 0.480, 1.404 and 0.013 mg.mL-1. The best temperature for RVGP production (20oC) was chosen to be evaluated in the bioreactor operated in batch and feed-batch mode, keeping 28oC as control. The results of µmax and CGPV max in batch mode were: 0,061 h-1 and 0,149 mg.mL-1 at 28oC and 0,027 h-1 and 0.354 mg.mL-1 at 20oC. A batch experiment with stepwise temperature decrease from 20ºC to 16ºC presented a µmax ranging from 0.024 to 0.012 h-1 and a final CGPV max of 0.567 mg.mL-1. On the other hand, at 20ºC in feed-batch mode, µmax was 0.024 h-1 and CGPV max 1.155 mg.mL-1. The larger production of RVGP observed in Schott flasks can be a consequence of a more favorable condition for the expression of the protein at low values of dissolved oxygen concentrations that are seen in flasks but not in controlled bioreactor cultures at 50% DO. Overall, these results show an increase of recombinant protein expression at lower temperatures, especially when µmax is kept fairly low. The largest production of RVGP was obtained in the culture at 20°C in Schott flask when CGPV max was 2.973 mg.mL-1, while the production obtained at the control temperature of 28ºC was only of 1.404 mg.mL-1. Thus, the use of reduced culture temperatures, around 20°C, seems to be the best strategy for the optimization of RVGP production. / aumento da expressão de proteínas recombinantes complexas corretamente processadas como as produzidas por células animais é essencial para o desenvolvimento de um bioprocesso eficiente em larga escala. A manipulação das condições de cultivo desempenha um papel muito importante na expressão otimizada e controlada dessas proteínas em biorreatores. A resposta de células de mamíferos e de insetos quando submetidas ao efeito da temperatura vem sendo estudada por vários pesquisadores como estratégia potencial para o aumento de expressão de proteínas recombinantes. No presente trabalho propõe-se avaliar a influência da temperatura no cultivo celular com o propósito de intensificar a produção da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) em cultivo de células de Drosophila melanogaster S2 recombinante em meio de cultura Sf900-II suplementado com aminoácidos, em frascos Schott (em shaker) e em biorreator de tanque agitado livre de bolhas. Para tal, foram avaliadas cinco temperaturas de cultivo em frasco Schott: 16, 20, 24, 28 e 34ºC. Os resultados obtidos de velocidade específica de crescimento máxima (µmax) nesses cultivos foram, respectivamente: 0,009, 0,020, 0,039, 0,036 e 0,022 h-1, e de concentração máxima de GPV (CGPV max): 0,075, 2,973, 0,480, 1,404 e 0,013 mg.mL-1. A melhor temperatura para produção de GPV (20oC) foi escolhida para ser testada em biorreator operado em batelada e batelada alimentada, mantendo 28oC como controle. Os resultados de µmax e CGPV max em batelada foram: 0,061 h-1 e 0,149 mg.mL-1 a 28oC e 0,027 h-1 e 0,354 mg.mL-1 a 20oC. Um experimento em batelada com temperatura decrescente em etapas de 20ºC a 16oC apresentou um µmax variando de 0,024 a 0,012 h-1 e uma CGPV max final de 0,567 mg.mL-1. Por outro lado, a 20ºC em batelada alimentada, µmax foi de 0,024 h-1 e CGPV max de 1,155 mg.mL-1. A maior produção de GPV observada em frascos Schott pode ser conseqüência de uma condição mais favorável para expressão da proteína em condições de baixa concentração de oxigênio dissolvido como as usuais em frascos Schott mas não em cultivos em biorreator com oxigênio dissolvido controlado a 50%. Em geral, estes resultados mostram uma maior expressão da proteína recombinante nas temperaturas mais baixas, especialmente quando µmax é mantido razoavelmente baixa. A maior produção de GPV foi obtida no cultivo realizado a 20ºC em frasco Schott quando CGPV max=2,973 mg.mL-1 em comparação a 1,404 mg.mL-1 obtida no cultivo controle a 28ºC. Assim, a utilização de temperaturas de cultivo mais baixas, próximas de 20ºC, pode ser considerada a melhor estratégia na otimização da produção de GPV.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-09Bitstream added on 2014-06-13T19:12:51Z : No. of bitstreams: 1 gomes_mo_me_sjrp.pdf: 699414 bytes, checksum: ee095f99dc71e8ce40b12d06b033a24f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Uma questão central da evolução da resistência a inseticidas é o custo adaptativo do organismo contendo um genótipo que confere a resistência. O custo adaptativo refere-se à sobrevivência e à habilidade reprodutiva de um organismo. As mutações que conferem resistência aos inseticidas são preditas trazerem um custo na ausência dos mesmos e, consequentemente não se fixam nas populações. Entretanto, a resistência ao DDT em Drosophila melanogaster (DDT-R) está se aproximando de uma fixação global, mesmo após ter sido abolido o uso do DDT. Existem evidências consideráveis na literatura apoiando a hipótese que a resistência ao DDT baseada no metabolismo é poligênica em Drosophila e está parcialmente associada à superexpressão de genes do citocromo P450. Alguns trabalhos, entretanto consideram que a superexpressão de um único gene, Cyp6g1, associado com a inserção de um elemento transponível, Accord em D. melanogaster e Doc em D. simulans, é suficiente para promover a resistência, enquanto outros discutem que a superexpressão desse gene não confere necessariamente a resistência em D. melanogaster. O presente trabalho avaliou sete componentes do valor adaptativo (fertilidade, fecundidade, viabilidade ovo-pupa, viabilidade pupa-imago, viabilidade ovoimago, longevidade e o tempo de desenvolvimento) em quatro experimentos que diferiram quanto à metodologia. Essa análise teve por objetivo avaliar o custo dos fenótipos resistentes de linhagens recém coletadas e de laboratório de D. melanogaster e de D. simulans. Além disso, foi realizada uma análise do polimorfismo dos exons 1 e 2 do gene Cyp6g1, de linhagens resistentes e suscetíveis de laboratório, e resistentes recém coletadas dessas espécies, com o objetivo de examinar a relação entre o nível de suscetibilidade ao DDT e o polimorfismo. Foi verificado que, mesmo após um período de dois anos em... / A central matter of the evolution in insecticide resistance is the adaptive cost of the organism carrying a genotype that confers resistance. The adaptive cost refers to the survival and reproductive capacity of an organism. Mutations that confer pesticide resistance are predicted to carry a cost in the absence of the pesticide and consequently they are not fixed in the population. However, DDT resistance in Drosophila melanogaster (DDT-R) is closer to a global fixation, even after the suppression of DDT use. There is considerable evidence in the literature supporting the hypothesis that DDT resistance in Drosophila, based on metabolism, is poligenic and partially associated with overexpression of CYP genes. However, a recent study concluded that a single P450 gene, Cyp6g1, associated with the insertion of Accord element in the upstream region, in D. melanogaster, is sufficient to promote resistance. In a striking example of parallel evolution, the insertion of a different transposon, Doc element, is correlated with overtranscription of Cyp6g1 homolog in D. simulans and also show to be related to resistance. Other studies disagree that the overexpression of this gene necessarily confers resistance in D. melanogaster. Seven fitness components (fertility, fecundity, viability – egg-pupa, pupa-imago, egg-imago – developmental time and longevity) were evaluated in the present study, in four experiments that differed in methodology. This analysis aimed at evaluating the cost of the resistant phenotype in both species. In addition, the analysis of the polymorphism of exons 1 and 2 of Cyp6g1 gene of the susceptible and resistant strains of D. melanogaster and D. simulans was performed with the aim of examining the relationship between the degree of polymorphism and the susceptibility to DDT. D. melanogaster and D. simulans strains showed high intra and interspecific variability... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-16Bitstream added on 2014-06-13T20:29:22Z : No. of bitstreams: 1 okamoto_dn_me_sjrp.pdf: 676452 bytes, checksum: 7d8aa473e5171e8c8a4187d9499700da (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A presença de resíduos químicos no ambiente afeta todo o ecossistema. Uma das técnicas empregadas para o estudo dos efeitos tóxicos dos resíduos químicos é o biomonitoramento, que utiliza como modelos organismos vivos, entre eles os insetos. Um dos gêneros utilizados é a Drosophila, em particular a espécie D. melanogaster de distribuição cosmopolita. É um organismo geneticamente bem explorado, de fácil manutenção e rápido ciclo biológico, que após o seqüenciamento completo de seu genoma revelou homologia de 60% de seus genes com os genes de doenças humanas. Entre as substâncias químicas que foram investigadas neste trabalho, incluem-se três metais tóxicos (alumínio, cromo e chumbo), um corante (azul Coomassie brilliant G250) e o produto sintético acrilamida. A análise foi realizada em concentrações baixas (50µM) com ênfase na característica acumulativa de cada produto químico durante dez gerações de exposição. As análises, fundamentadas na biologia do inseto, avaliaram sua produtividade, alterações morfológicas, viabilidade das diversas fases do desenvolvimento, o peso dos insetos, o comportamento sexual e a atividade enzimática da carboxilesterase. Foi realizado também um experimento de produtividade comparativo com duas linhagens, uma massal e outra isofêmea. A exposição à acrilamida, aumentou a produtividade na primeira exposição, e também reduziu a viabilidade de ovos para adultos nas gerações F3 e F10. Por sua vez, entre os metais, o chumbo, afetou a viabilidade de ovos em pupas na décima geração e apresentou alterações no tempo de pré-cópula e de cópula. A exposição ao cloreto de alumínio, revelou na primeira e na quinta geração aumento do tempo de pré-cópula, e na décima geração aumento do tempo de cópula. O dicromato de potássio...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-12Bitstream added on 2014-06-13T20:54:02Z : No. of bitstreams: 1 rangel_vf_me_sjrp.pdf: 852839 bytes, checksum: 3d2eb971002011ec16f7a22fafd009c2 (MD5) / A Hidroxiuréia (HU) é utilizada como medicamento em várias doenças humanas, incluindo anemia falciforme e câncer. Basicamente, na primeira, atua aumentando a porcentagem de hemoglobina fetal, o que diminui a gravidade do quadro clínico por inibir a polimerização da hemoglobina S e, no segundo, atua impedindo a síntese de DNA na fase S, desta forma bloqueando a divisão celular. Há preocupação com o tratamento longo com essa substância por causar efeitos colaterais, um dos quais se relaciona a problemas na fertilidade masculina. A Drosophila, devido a várias características, como ser o organismo com maior homologia com o homem quanto às doenças genéticas, por utilizar esses genes homólogos nos mesmos processos, mas de forma simplificada e por expressar os genes humanos em construções transgênicas, é hoje muito utilizada em estudos de doenças humanas e de respostas a fármacos, buscando esclarecer mecanismos de ação e conseqüências do uso. Neste trabalho, foram estudados, sob o efeito da HU em duas concentrações (0,1 e 0,25mg/ml de meio de cultura), no modelo biológico mencionado, as características taxa de oviposição, produtividade (número de descendentes), tempo de desenvolvimento, mortalidade, longevidade, tempo de pré-cópula , duração da cópula, presença de alterações morfológicas externas, morfologia do aparelho reprodutor masculino, modificações do peso das moscas, morfologia dos cromossomos politênicos e padrão de expressão das enzimas esterasicas. A produtividade foi analisada em seis gerações consecutivas, visando obter maior compreensão dos efeitos da HU. Cada característica analisada envolveu uma metodologia diferente, descrita no corpo do trabalho. A análise estatística foi baseada na aplicação da ANOVA, e nas comparações de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. Em algumas características o efeito do tratamento mostrou-se... / Hydroxyurea (HU) is used as a medicine in several human diseases, including sickle cell disease (SCD) and cancer. Basically, in the first, HU acts by increasing the percentage of fetal hemoglobin, thus decreasing the severity of the disease symptoms due to inhibition of the hemoglobin S polymerization. In the second mentioned disease, it acts by preventing DNA synthesis in S phase, thereby blocking cell division. There is some concern about side effects caused by the long-term treatment with HU. One of them relates to problems in male fertility. Drosophila, because of its characteristics, such as being the organism with the highest homologies with man as to genetic diseases, since it uses homologous genes in these processes in a simplified form, and also by expressing human genes in transgenic constructs, is now being widely used in studies of human diseases and responses to drugs, seeking for clarifying action mechanisms and consequences of their use. In this work, we studied, in Drosophila biological characteristics under the effect of HU in two concentrations (0.1 and 0.25 mg / ml of culture medium), including oviposition rate, productivity (number of offspring), time development, mortality, longevity, pre-mating and mating duration, presence of morphological changes in external morphology and in the male reproductive system, fly weight changes, polytene chromosome morphology and patterns of esterase enzymes. Productivity was analyzed in six consecutive generations. Each feature analyzed involved a different methodology, described in the body of the work. Statistical analysis was based on the application of ANOVA, and comparisons using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests. In some characteristics, the effect of treatment was dosisdependent. In the light of numbers, productivity was higher in control experiments (C) of six generations, and among the treated ones with... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4615.pdf: 2688296 bytes, checksum: 18c8fbe6fb83004856a32c02827d70f5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / Rabies is a zoonotic viral disease caused by a virus of the genus Lyssavirus that affects several species of mammals. Rabies remains a global public health threat that kills more than 55,000 people per year mainly in developing countries, this disease once established do not have a specific treatment. The RV envelope is composed of a glycoprotein, known as a unique antigen capable of conferring immune response against the rabies, and therefore, is the focus of research for development an efficient and safe recombinant vaccine based on this viral antigen. Cell line stably transfected S2 Drosophila melanogaster have been used in the production of many heterologous proteins and has been studied for the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP) in our laboratory. This approach involves the selection of high producing cell populations; procedure that requires considerable periods of time (months), increasing management and costs of production. In this sense, in recent decades, many systems focused on the expression of heterologous proteins by transient expression of genes, were analyzed because they allow obtaining significant quantities of recombinant protein in a short period of time (weeks). For the use of transient transfection technology can be found a variety of methods and available agents, such as electroporation, cationic lipids, cationic polymers and calcium phosphate precipitated. The choice and optimization of each of them depends mainly on the cell type and protein being expressed. Thus, the objective of this study was to evaluate the transient expression of the glycoprotein gene of rabies virus (RVGP) in insect cells of Drosophila melanogaster S2 lineage, evaluating the vehicles transfection: calcium phosphate, cationic lipid (Cellfectin) and cationic polymer (ExGen500 and JetPEI). In order to determine the most efficient transfection agent, experiments were performed in 6 well plate and bottle of 100 mL of culture, which analyzed the influence of cell density, the concentration of DNA and transfection reagent volume on the expression of RVGP assessed by ELISA and fluorescence microscopy. Yields ranging from 50-90 ng/107cel were obtained in different experiments on multiwell plate, suggesting strong effect of ratio DNA: transfection agent used. Comparison of transfection agents showed no significant differences. In transfections made in suspension culture was analyzed the effect of the plasmid (whether or not the signal of BiP cell secretion) on the expression RVGP. When we used the plasmid containing the signal BiP (pMTiRVGP) were obtained 160 ng/107cel of RVGP production, and 200 ng/mL of volumetric production without significant differences between the different transfection agents. However, significant differences were found when we used the plasmid not containing the signal BiP (pMTRVGP), with the RVGP production was 60 ng/107cells in cells transfected with Cellfectin, ExGen500 and calcium phosphate, except in cells transfected with JetPEI was reached a production of 120 ng/107cells. In preliminary experiment bottle type "spinner" with a working volume of 60 mL were achieved expressions of 140 ng/107cel of RVGP in cells transfected with JetPEI and calcium phosphate. This suggests that optimization of culture conditions and transfection are possible to increase recombinant protein expression in cultured on a large scale. / A raiva é uma enfermidade causada por um vírus do gênero Lyssavirus que afeta várias espécies de mamíferos. Esta doença apresenta um alto custo social e econômico principalmente em países em desenvolvimento. Na superfície do vírus da raiva está localizada a glicoproteína do vírus, reconhecida como antígeno capaz de conferir resposta imunológica contra a raiva, sendo, o foco de pesquisas no desenvolvimento de uma vacina recombinante. Células da linhagem Drosophila melanogaster S2 estavelmente transfectadas têm sido usadas na produção de muitas proteínas heterólogas e tem sido estudada para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em nosso laboratório. A abordagem para a obtenção de linhagens recombinantes estáveis envolve a seleção de populações celulares altamente produtoras; sendo um processo que requer consideráveis períodos de tempo (meses), uma elevada manipulação e altos custos de produção. Neste sentido, nas últimas décadas, muitos sistemas focados na expressão de proteínas heterólogas através da expressão transiente de genes foram analisados, porque eles permitem a obtenção de quantidades consideráveis de proteína recombinante em um curto período de tempo (semanas). Para o uso da tecnologia de transfecção transiente pode ser encontrada uma variedade de métodos e agentes disponíveis, tais como eletroporação, lipídeos catiônicos, polímeros catiônicos e fosfato de cálcio. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão transiente do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto da linhagem Drosophila melanogaster S2, avaliando os veículos de transfecção fosfato de cálcio, lipídeo catiônico (Cellfectin) e polímero catiônico (ExGen500 e JetPEI). A fim de determinar o agente de transfecção mais eficiente, foram feitos experimentos em placa de 6 poços e frasco de cultivo de 100mL, onde foram analisados a influência da densidade celular; a concentração de DNA, o volume do reagente de transfecção sobre a expressão da RVGP analisada através do método de ELISA. Quantidades de RVGP que variaram entre 50-90 ng/107cel foram obtidas nos diferentes experimentos feitos em placa, sugerindo um efeito da relação DNA: agente de transfecção. A comparação entre os agentes de transfecção não mostrou diferenças significativas. Nas transfecções feitas em cultura em suspensão foi analisado o efeito de transfectar o plasmídeo para expressão de RVGP contendo ou não o sinal de secreção celular BiP. Quando foi usado o plasmídeo contendo o sinal BiP (pMTiRVGP) foram atingidas valores de RVGP de 160 ng/107cel e produções volumétricas de 200 ng/mL, porém sem diferenças significativas entre os diferentes agentes de transfecção. Entretanto, foram encontradas diferenças quando foi usado o plasmídeo não contendo o sinal BiP (pMTRVGP), onde a produção de RVGP foi de 60 ng/107cells nas células transfectadas com Cellfectin, ExGen500 e fosfato de cálcio, porém as células transfectadas com JetPEI obtiveram uma produção de 120 ng/107cels de RVGP. Em experimento em frasco de cultivo tipo spinner com volume de trabalho de 60 mL, foram atingidas expressões de RVGP de 140 ng/107cel para células transfectadas com JetPEI e fosfato de cálcio, sugerindo que otimizações nas condições de cultivo e transfecção ainda podem ser testadas visando aumentar a expressão da proteína recombinante em cultivos em larga escala.