Orientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: O remodelamento ósseo é um processo complexo que depende do balanço entre formação e reabsorção óssea, mecanismo regulado pelas células ósseas e fatores sistêmicos, como o Sistema Nervoso Simpático (SNS). Os mediadores deste sistema são capazes de regular o metabolismo ósseo através dos receptores adrenérgicos expressos na superfície dos osteoblastos. Entretanto, o papel dos receptores β-adrenérgicos ainda não está totalmente elucidado no processo de diferenciação osteogênica. Objetivos: avaliar o papel dos receptores β-adrenérgicos na diferenciação osteoblástica de células tronco mesenquimais da medula óssea de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Métodos: Ratos machos Wistar e SHR (10 semanas) foram utilizados para a coleta da medula óssea a partir do fêmur, as quais foram plaqueadas em garrafas de cultivo celular e depois em placas de 24 poços, onde receberam o meio osteogênico (MO: MEM, mais 50 µg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de β-glicerofosfato e 10-8 M de dexametasona), e o tratamento com Isoprenalina (0,01 µM), Carvedilol (1 µM), antagonista adrenérgico não seletivo, ou Nebivolol (0,1 µM), antagonista β1-adrenérgico. O ensaio de proliferação celular (MTT) e a atividade de fosfatase alcalina (Fal) foram realizados nos dias 7, 10 e 14. A mineralização foi avaliada no dia 14 através do vermelho de Alizarina. A expressão gênica dos marcadores osteogênicos e dos receptores β1 e β2 adrenérgicos foi avaliada no dia 7 por RT-PCR em tempo real. A atividade pro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-07Bitstream added on 2015-03-03T12:06:10Z : No. of bitstreams: 1 000799295.pdf: 1434919 bytes, checksum: 36275b6266ae49abeed7a7bba084d604 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Células-tronco mesenquimais (CTMs) obtidas a partir da medula óssea são capazes de se diferenciarem, sobretudo, em condrócitos, adipócitos e osteoblastos. Durante a osteogênese in vitro, alguns parâmetros são utilizados para caracterizar este processo, tais como atividade da fosfatase alcalina (FAL), mineralização e expressão de proteínas associadas à osteoblastos. Ratos espontaneamente hipertensos (SHR) são um modelo animal de hipertensão essencial humana e desenvolvem hipertensão após 4 semanas de idade. Esta linhagem apresenta alterações significativas no metabolismo ósseo. O objetivo do presente estudo foi investigar se, o genótipo hipertensivo poderia interferir na diferenciação osteoblástica das CTMs de ratos SHR e qual mecanismo está alterado quando comparadas com a linhagem progenitora, ratos Wistar. Para isso, nós obtivemos CTMs da medula óssea de ratos Wistar e SHR com 4 semanas de idade, sem a hipertensão estabelecida, afim de avaliar somente o possível efeito do genótipo hipertensivo na diferenciação osteogênica in vitro. Nós induzimos, ou não, a diferenciação osteogênica in vitro por meio da utilização dos indutores osteogênicos: ácido ascórbico, ?-glicerofosfato e dexametasona. Os resultados demonstraram que, CTMs indiferenciadas de SHR (SHRC) demonstraram taxa de proliferação aumentada em comparação a CTMs, na mesma condição, de Wistar (WC), e após a indução da osteogênica, a taxa de proliferação apresentou uma diminuição acentuada no grupo SHR (SHRMO) do que no grupo Wistar na mesma condição (WMO). Embora não fora observada diferença significativa na atividade da FAL entre SHRMO e WOM no 7° dia, a mineralização e a diferenciação osteoblástica foram menores no grupo SHRMO no mesmo período experimental. Os fatores de transcrição Osterix e ?-catenina parecem estar envolvidos na diferenciação reduzida no grupo SHRMO... / Mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow are able to differentiate mainly into chondrocytes, adipocytes and osteoblasts. During in vitro osteogenesis, some parameters are used to characterize this process, such as the activity of alkaline phosphatase (ALP), mineralization and osteoblast-associated proteins expression. Spontaneously hypertensive rats (SHR) is an animal model of human essential hypertension. This animals developing hypertension after 4 weeks of age. This strain shows significant changes in bone metabolism. The aim of this study was to investigate whether the hypertensive genotype could influence the osteoblastic differentiation of MSCs from SHR and which mechanism are altered when compared to the parental strain, Wistar rats. For that, we have obtained bone marrow MSCs from Wistar and SHR rats at 4 weeks of age, without hypertension established in order to evaluate only the possible effect of hypertensive genotype on osteogenic differentiation in vitro. We induced or non-osteogenic differentiation in vitro using osteogenic inducers: ascorbic acid, dexamethasone and ?-glycerophosphate. The results demonstrate that undifferentiated MSCs SHR (SHRC) showed increased proliferation rate compared to MSCs, in the same condition Wistar (WC) and after osteogenic induction, proliferation rate showed a marked decrease in SHR (SHRMO) than in Wistar group in the same condition (WMO). Although it was not observed significant difference in ALP activity between WMO and SHRMO on day 7, mineralization and osteoblast differentiation were lower on group SHRMO in the same experimental period. The transcription factors Osterix and ?-catenin appear to be involved in reduced differentiation in SHRMO group because they showed lower expression in this experimental group. Furthermore, the decreased... / FAPESP: 12/01924-9 / FAPESP: 11/06070-5 / FAPESP: 11/19458-1

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O potencial efeito terapeutico das celulas-tronco mesenquimais (MSCs) e seu meio condicionado (CM) tem sido extensivamente estudados. Eles possuem a capacidade de reparar tecidos, reduzir inflamacao local e modular respostas imunologicas. A inflamacao tubulo-intersticial progride para fibrose e pode levar a doenca renal cronica (DRC). A obstrucao ureteral unilateral (UUO) e um modelo bem estabelecido de fibrose renal. No presente estudo examinamos fatores que podem ser influenciados pela administracao de MSCs ou de seu CM na modelo de UUO. As MSCs foram extraidas de femures e tibias de ratos, cultivadas in vitro e caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciacao celular. Quatro grupos de ratas foram usados nos experimentos (n=7, cada): SHAM, UUO (Obstrucao Ureteral Unilateral), UUO+MSCs (Obstrucao+ MSCs) e UUO+CM (Obstrucao + CM). As MSCs ou seu CM foram administrados via veia cava abdominal apos total ligadura do ureter. Apos 7 ou 14 dias os animais foram eutanasiados e tiveram soro e rins coletados. Foram observadas reducoes nas expressoes de moleculas como COL1A1, α-SMA e TNF-α nos animais tratados com MSCs ou seu CM. Observou-se, por imunohistoquimica, reducoes nos niveis de caspase-3 ativada, α-SMA and PCNA nos animais tratados. Os resultados sugerem que a administracao intravenosa de MSCs ou de seu CM reduz a progressao da fibrose e modula fatores envolvidos na apoptose, inflamacao proliferacao celular e transdiferenciacao epitelio-mesenquimal (EMT) em ratas Wistar submetidas a UUO, indicando uma possivel ferramenta na prevencao ou reducao na progressao para DRC / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-05Bitstream added on 2015-03-03T12:07:39Z : No. of bitstreams: 1 000798816.pdf: 2368369 bytes, checksum: 4eddcaa3ea68fd87ba08aadc29999c26 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do estroma da medula óssea possuem potencial para se diferenciar in vivo e in vitro, em vários tipos celulares, incluindo osteoblastos e adipócitos. Durante o envelhecimento, há o maior número de células que se diferenciam espontaneamente em adipócitos, comprometendo a qualidade óssea, bem como perda da massa óssea decorrente do estilo de vida sedentário. Dentre fatores capazes de modular a diferenciação de CTMs em prol a formação óssea, sinais mecânicos estão sendo estudados como alternativa para o tratamento da osteoporose. Neste estudo, analisamos como o treinamento de força (TF) influencia a remodelação óssea durante o envelhecimento. Para isso, analisamos o potencial osteogênico de diferenciação de CTMs isoladas da medula óssea de ratas adultas (09 meses) e idosas (21 meses) que realizaram ou não o exercício físico com sobrecarga. Os resultados mostraram que o TF aumentou a expressão da proteína óssea morfogênica 2 (BMP2), regulando a diferenciação dos osteoblastos e formação óssea por promover up-regulation do fator de transcrição relacionado com o Runt 2 (Runx2) e down-regulation do fator de transcrição de adipócitos, receptor ativado por proliferadores de peroxissoma ? (Ppar?) em CTMs diferenciadas de doadoras idosas. Além disso, os valores de densidade mineral óssea areal e os parâmetros biomecânicos na tíbia das ratas idosas foram otimizados após a realização do TF. Estes resultados sugerem que o aumento dos fatores de transcrição e proteínas de matriz, bem como o decréscimo de Ppar?, desencadeado pelo TF, contribui para a melhoria da qualidade do osso de ratas idosas treinadas / In vivo and in vitro studies indicate that a subpopulation of bone marrow stromal cells derived mesenchymal stem cells (MSCs) has potential to differentiate into multiple cell types, including osteoblasts and adipocytes. During the aging, greater number of cells is able to differentiate spontaneously into adipocytes, committing bone quality, well as loss of bone mass due to the sedentary lifestyle. Among the factors capable of modulating differentiation of MSCs to promote bone formation mechanical signals are being studied as an alternative for the treatment of osteoporosis. In this study, we analyzed how the strength training (ST) participates in the bone remodeling during the aging. For this purpose, we analyzed the osteogenic potential of differentiation of MSCs isolated from the bone marrow of adult (09 months) and elderly (21 months) female rats that performed or not physical activity with overcharge. The results showed that the ST increased the bone morphogenic protein 2 (BMP2), regulated the osteoblast differentiation and bone formation for up-regulation of the osteogenic master transcription factor, Runt-related transcription factor 2 (Runx2) and the down-regulation of the adipocytes master transcription factor, peroxisome proliferator-activated receptor ? (Ppar?) in differentiated MSCs of the elderly donors. In addition, the values of areal bone mineral density and biomechanical parameters in the tibia of elderly rats were optimized after the realization of ST. These results suggest that increase of transcription factors and matrix proteins as well as the decrease of Ppar?, triggered by ST, contributes to better bone quality of trained elderly / FAPESP: 11/15501-0

Orientador: Rita Cássia Menegati Dornelles / Banca: Márcio Mateus Beloti / Banca: Sandra Lia do Amaral / Resumo: Células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do estroma da medula óssea possuem potencial para se diferenciar in vivo e in vitro, em vários tipos celulares, incluindo osteoblastos e adipócitos. Durante o envelhecimento, há o maior número de células que se diferenciam espontaneamente em adipócitos, comprometendo a qualidade óssea, bem como perda da massa óssea decorrente do estilo de vida sedentário. Dentre fatores capazes de modular a diferenciação de CTMs em prol a formação óssea, sinais mecânicos estão sendo estudados como alternativa para o tratamento da osteoporose. Neste estudo, analisamos como o treinamento de força (TF) influencia a remodelação óssea durante o envelhecimento. Para isso, analisamos o potencial osteogênico de diferenciação de CTMs isoladas da medula óssea de ratas adultas (09 meses) e idosas (21 meses) que realizaram ou não o exercício físico com sobrecarga. Os resultados mostraram que o TF aumentou a expressão da proteína óssea morfogênica 2 (BMP2), regulando a diferenciação dos osteoblastos e formação óssea por promover up-regulation do fator de transcrição relacionado com o Runt 2 (Runx2) e down-regulation do fator de transcrição de adipócitos, receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ (Pparγ) em CTMs diferenciadas de doadoras idosas. Além disso, os valores de densidade mineral óssea areal e os parâmetros biomecânicos na tíbia das ratas idosas foram otimizados após a realização do TF. Estes resultados sugerem que o aumento dos fatores de transcrição e proteínas de matriz, bem como o decréscimo de Pparγ, desencadeado pelo TF, contribui para a melhoria da qualidade do osso de ratas idosas treinadas / Abstract: In vivo and in vitro studies indicate that a subpopulation of bone marrow stromal cells derived mesenchymal stem cells (MSCs) has potential to differentiate into multiple cell types, including osteoblasts and adipocytes. During the aging, greater number of cells is able to differentiate spontaneously into adipocytes, committing bone quality, well as loss of bone mass due to the sedentary lifestyle. Among the factors capable of modulating differentiation of MSCs to promote bone formation mechanical signals are being studied as an alternative for the treatment of osteoporosis. In this study, we analyzed how the strength training (ST) participates in the bone remodeling during the aging. For this purpose, we analyzed the osteogenic potential of differentiation of MSCs isolated from the bone marrow of adult (09 months) and elderly (21 months) female rats that performed or not physical activity with overcharge. The results showed that the ST increased the bone morphogenic protein 2 (BMP2), regulated the osteoblast differentiation and bone formation for up-regulation of the osteogenic master transcription factor, Runt-related transcription factor 2 (Runx2) and the down-regulation of the adipocytes master transcription factor, peroxisome proliferator-activated receptor γ (Pparγ) in differentiated MSCs of the elderly donors. In addition, the values of areal bone mineral density and biomechanical parameters in the tibia of elderly rats were optimized after the realization of ST. These results suggest that increase of transcription factors and matrix proteins as well as the decrease of Pparγ, triggered by ST, contributes to better bone quality of trained elderly / Mestre

Orientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Gustavo Pompermaier Garlet / Banca: Willian Fernando Zambuzzi / Resumo: Células-tronco mesenquimais (CTMs) obtidas a partir da medula óssea são capazes de se diferenciarem, sobretudo, em condrócitos, adipócitos e osteoblastos. Durante a osteogênese in vitro, alguns parâmetros são utilizados para caracterizar este processo, tais como atividade da fosfatase alcalina (FAL), mineralização e expressão de proteínas associadas à osteoblastos. Ratos espontaneamente hipertensos (SHR) são um modelo animal de hipertensão essencial humana e desenvolvem hipertensão após 4 semanas de idade. Esta linhagem apresenta alterações significativas no metabolismo ósseo. O objetivo do presente estudo foi investigar se, o genótipo hipertensivo poderia interferir na diferenciação osteoblástica das CTMs de ratos SHR e qual mecanismo está alterado quando comparadas com a linhagem progenitora, ratos Wistar. Para isso, nós obtivemos CTMs da medula óssea de ratos Wistar e SHR com 4 semanas de idade, sem a hipertensão estabelecida, afim de avaliar somente o possível efeito do genótipo hipertensivo na diferenciação osteogênica in vitro. Nós induzimos, ou não, a diferenciação osteogênica in vitro por meio da utilização dos indutores osteogênicos: ácido ascórbico, β-glicerofosfato e dexametasona. Os resultados demonstraram que, CTMs indiferenciadas de SHR (SHRC) demonstraram taxa de proliferação aumentada em comparação a CTMs, na mesma condição, de Wistar (WC), e após a indução da osteogênica, a taxa de proliferação apresentou uma diminuição acentuada no grupo SHR (SHRMO) do que no grupo Wistar na mesma condição (WMO). Embora não fora observada diferença significativa na atividade da FAL entre SHRMO e WOM no 7° dia, a mineralização e a diferenciação osteoblástica foram menores no grupo SHRMO no mesmo período experimental. Os fatores de transcrição Osterix e β-catenina parecem estar envolvidos na diferenciação reduzida no grupo SHRMO... / Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow are able to differentiate mainly into chondrocytes, adipocytes and osteoblasts. During in vitro osteogenesis, some parameters are used to characterize this process, such as the activity of alkaline phosphatase (ALP), mineralization and osteoblast-associated proteins expression. Spontaneously hypertensive rats (SHR) is an animal model of human essential hypertension. This animals developing hypertension after 4 weeks of age. This strain shows significant changes in bone metabolism. The aim of this study was to investigate whether the hypertensive genotype could influence the osteoblastic differentiation of MSCs from SHR and which mechanism are altered when compared to the parental strain, Wistar rats. For that, we have obtained bone marrow MSCs from Wistar and SHR rats at 4 weeks of age, without hypertension established in order to evaluate only the possible effect of hypertensive genotype on osteogenic differentiation in vitro. We induced or non-osteogenic differentiation in vitro using osteogenic inducers: ascorbic acid, dexamethasone and β-glycerophosphate. The results demonstrate that undifferentiated MSCs SHR (SHRC) showed increased proliferation rate compared to MSCs, in the same condition Wistar (WC) and after osteogenic induction, proliferation rate showed a marked decrease in SHR (SHRMO) than in Wistar group in the same condition (WMO). Although it was not observed significant difference in ALP activity between WMO and SHRMO on day 7, mineralization and osteoblast differentiation were lower on group SHRMO in the same experimental period. The transcription factors Osterix and β-catenin appear to be involved in reduced differentiation in SHRMO group because they showed lower expression in this experimental group. Furthermore, the decreased... / Mestre

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Joaquim Murray Bustorff Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Volpe_BrunoBosch_M.pdf: 3151194 bytes, checksum: afd54e9f5fdcdd55a24ddfa4b90d02a7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As fístulas enterocutâneas (FE) são de difícil cicatrização e seu tratamento cirúrgico frequentemente falha, fazendo com que a fistula volte a abrir. Estudos recentes têm demonstrado que a terapia celular pode ser uma nova forma de tratamento nesta área. As células tronco mesenquimais (MSCs) são capazes de se auto- renovar tem alta capacidade proliferativa, podendo se diferenciar em várias linhagens celulares. Ainda apresentam capacidade imunomodulatória. A medula óssea, o sangue de cordão umbilical e o tecido adiposo são as principais fontes de MSCs. O tecido adiposo (TA) é de fácil acesso, sendo que o procedimento de lipoaspiração é um procedimento comum. O tratamento de fístulas enterocutâneas com AT-MSCs já foi testado algumas vezes, porém a fístula em sua grande maioria não se fecha totalmente. O objetivo deste estudo foi analisar o potencial terapêutico das MSCs aderidas a fios de sutura no intuito de melhorar a cicatrização e recuperação no tratamento de FE. O TA foi obtido através do procedimento de lipoaspiração. O TA foi submetido ao processo de digestão com colagenase. As células ficaram em meio de cultura DMEM com baixa glicose e com SFB durante 3 dias. Quando atingiram 80% de confluência, as células aderentes foram tratadas com tripsina e ressuspendidas com o meio citado acima. Na 4ª passagem essas células foram caracterizadas com citometria de fluxo, microscopia confocal e diferenciadas nas três linhagens mesodérmicas para confirmação que realmente são MSCs. Após, a confirmação de que as células eram realmente células tronco mesenquimais, elas foram aderidas em fios de sutura de poliglactina (4-0 Poly Vicryl / Poliglactina 910). Foram gotejadas 106 MSCs em cima de cada fio de sutura e logo em seguida foi adicionada a cola de fibrina (20uL Fibrinogênio, 30uL Trombina e 10uL Cloreto de Cálcio) para ajudar na fixação das células. Os fios de sutura com MSCs aderidas ficaram em meio de cultura durante 24 horas para proliferação celular. As amostras foram analisadas por microscopia confocal de imnunofluorescência e eletrônica de varredura. O experimento animal utilizou ratos Wistar com 10 semanas de vida que foram distribuídos em três grupos: Grupo Controle (GC) que incluiu 5 animais onde a formação da fístula foi através de cirurgia sem nenhum tipo de suporte. Grupo Injeção (GI) que incluiu 8 animais que receberam uma injeção de 106 AT-MSCs ao redor do local de formação da fístula. Grupo Sutura (GS) que incluiu 9 animais que receberam sutura de 4-0 Vicryl (poliglactina) com 106 AT-MSCs aderidas com a ajuda de cola de fibrina. Após a exposição do ceco foi realizada enterotomia de 5mm, sendo então realizada a sutura da abertura a abertura da parede abdominal (superfície interna da pele) com 4 pontos separados com 4-0 Vicryl - Poly J-304 Polyglactin 910. No grupo GS, o fio para confecção da fístula, como descrita acima, continha 106 AT-MSCs aderidas. As fístulas foram fotografadas no dia da cirurgia e no 3°, 6°, 9°, 12°, 15°, 17°, 19° e 21° dias, onde foram anestesiados e sacrificados. O tamanho da área da fístula foi mensurado através do software ImageJ. Foram utilizados dois métodos estatísticos para analisar os dados do modelo animal. O primeiro método foi o Two-way Anova, fazendo a análise comparativa da cicatrização entre os três grupos, e o segundo o One-way analysis of variance, fazendo a análise comparativa da cicatrização entre os três grupos nos dias D0, D12 e D21. As microscopias confocal de imunofluorescência e eletrônica de varredura demonstraram a presença de AT-MSCs aderidas aos fios de sutura. No experimento animal mostrou que a média de redução do tamanho da área da fístula no 21º dia foi de 46,54% no GC, 71,80% no GI e 90,34% no GS (p<0,05), demonstrando que as MSCs foram eficazes na cicatrização das fístulas enterocutâneas tanto no grupo que recebeu a injeção de células quanto no grupo que utilizou as células aderidas ao fio de sutura. As MSCs foram capazes de se fixarem nos fios de sutura. Quando as fístulas enterocutâneas receberam a sutura com MSCs aderidas, elas mostraram uma melhor recuperação e cicatrização da fístula. AT-MSCs aderidas a fios de sutura pode ser uma nova e efetiva forma no tratamento de fístulas enterocutâneas / Abstract: Enterocutaneous fistulas (EF) are difficult to resolve and surgical failure is frequent. Cell therapy could be a new approach in this area. Mesenchymal stem cells (MSCs) have high proliferative capacity, can differentiate into several lineages and have immunomodulatory capacity. Adipocyte tissue (AT) is an easy source of them. Enterocutaneous fistula (EF) treatment with MSCs was yet performed but sometimes, the fistula did not close completely. The aim of this study is to analyze if AT-MSCs could attached in the suture filament in order to be used for EF treatment. AT obtained from lipoaspirate procedure was submitted to collagenase digestion. Cells were cultured in DMEM low glucose medium, with FBS during 3 days. At the 4ª passages, cells were characterized by flow cytometry, confocal microscopy, differentiated to mesodermal lineages to confirm MSCs and telomerase enzyme activity and karyotype analysis. The experiments were performed with polyester suture filament. MSCs, 106 cells, were fixed in the suture filament by adding fibrin glue.Filaments was led in the medium described above during 3 days. Samples were analyzed by confocal and scanning electron microscopy. The animal experiments were performed on 10 weeks old male Wistar rats divided into 3 groups. Control Group (CG): 5 animals undergoing fistula formation alone. Injection Group (IG):8 animals receiving 106 AT-MSCs injected around the suture line. Suture Filament Group (SG): 9 animals in which suture were performed using 4-0 Vicryl with 106 MSCs attached in the filament with fibrin glue. The cecum was accessed through a standard 7mm stab incision on the lower left side of the abdomen. Upon exposure, a 5mm enterotomy was performed and sutured to the abdominal wall in order to produce the fistula. To ensure normal closure of the fistula the opening in the cecum wall was fixed to the internal surface of the skin, without maturation, using four separate 4-0 Vicryl stitches (Poly J-304 Polyglactin 910 Ethicon). The fistulas were photographed on the day of operation and on the 3°, 6°, 9°, 12°, 15°, 17°, 19° and 21° day, in which they were anesthetized and sacrificed. Measure of the size of the fistula was performed using ImageJ software. Statistic comparison between the groups was performed by ANOVA. Confocal and scanning electronic microscopy results demonstrated that the cells were able to attach to the suture filaments. Animal experiments showed that the average size reduction of the fistula area at 21th day was: control group, 46.54%; injected group 71.80% and sutured group 90.34% (p<0,05). MSCs were able to attach to the suture filaments. When the fistulas were sutured with filaments containing MSCs they showed better recovery and healing than the injected and control group. Adipocyte tissue MSCs adhered to suture filament might be a new and effective approach for enterocutaneus fistulas treatment / Mestrado / Fisiopatologia Cirúrgica / Mestre em Ciências

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem seus efeitos terapêuticos predominantemente pela sua atividade parácrina. Como o secretoma desempenha um papel direto nas atividades biológicas das MSCs, a análise de seus componentes proteicos é um passo fundamental para identificar os principais responsáveis no controle e regulação dos muitos processos biológicos desenvolvidos por essas células. O secretoma de MSCs pode ser modificado e melhorado de forma in vitro para estimular efeitos celulares específicos desejados para aplicações terapêuticas, e uma maneira de modificá-lo é por meio de modificações nas condições de cultura. No presente estudo, objetivou-se descrever o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AD-MSCs) de gatos e cães submetidos a diferentes condições de cultivo, identificamos e comparamos os efeitos exercidos por diferentes modificações de cultivo. Para a produção de meio condicionado, as células foram descongeladas e cultivadas com meio DMEM/F12 com 20% de FBS, suplementado com antibióticos e antimicóticos em uma incubadora com umidade controlada a 37,5 °C, e 5% de CO2. Após atingir pelo menos 70% de confluência, as garrafas foram lavadas três vezes com solução salina balanceada Hanks (HBSS) e foram cultivadas em quatro condicionamentos distintos. O meio condicionado foi colhido após 4 dias, centrifugado por 10 min/300 g, filtrado em um filtro 0,22 μm e congelado a -80 °C. Foram realizadas a extração e concentração proteica de to... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It is now known that mesenchymal stem cells (MSCs) exert their therapeutic effects predominantly through their paracrine activity. Since the secretome plays a direct role in the biological activities of MSCs, the analysis of their protein components is a fundamental step in identifying the main responsible for the control and regulation of the many biological processes developed by these cells. The MSCs secretome can be modified and improved in vitro to stimulate specific cellular effects desired for therapeutic applications, and one way of modifying it is through modifications in the culture conditions. In the present study, in addition to describing for the first time the secretome of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AD-MSCs) in feline species, we identified and compared the effects exerted by different culture modifications, such as the use of serum-free medium and hypoxia in the protein production by AD-MSCs in canines and felines. For the conditioned media production, the cells were thawed and cultured with DMEM/F12 medium with 20% fetal bovine serum (FBS), supplemented with antibiotics and antimycotics in controlled incubator ay 37.5 °C with 5% CO2. After reaching at least 70% confluency, the flasks were washed three times with Hanks balanced salt solution (HBSS) and were grown in four different conditions. Conditioned media were collected after 4 days, centrifuged for 10 min/300 g, filtered on a 0.22 μm filter and frozen at -80 °C. Protein extraction... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As células mesenquimais estromais multipotentes (CMM) são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos (0,01%-0,0005%) e às elevadas doses necessárias para uma infusão (aproximadamente 106 células/Kg paciente) tornou-se necessário o desenvolvimento de tecnologias de expansão in vitro, eficientes e de custo reduzido, que permitam a obtenção de CMM com manutenção das características funcionais (diferenciação e inibição da proliferação de linfócitos), imunofenotípicas e citogenéticas. As CMM são células aderentes, ou seja, necessitam de um substrato sólido para se aderir e proliferar. O procedimento convencional de expansão em garrafas estáticas, geralmente envolve um processo laborioso em que não há correto controle e monitoramento dos parâmetros de cultivo e possui uma maior susceptibilidade à contaminação devido à excessiva manipulação para atingir o número ideal de células. Além disso, este tipo de cultivo não permite uma produção em larga escala. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um bioprocesso escalonável, economicamente viável e eficiente para expansão de CMM derivadas da medula óssea em microcarregadores. Para isso, as células foram cultivadas em microcarregador Cyotdex 3, em frasco spinner com o meio -MEM suplementado com 15% de SFB. Foram avaliadas neste trabalho, a adesão celular aos microcarregadores, crescimento, metabolismo, recuperação celular final e avaliação das propriedades funcionais e imunofenotípicas pré e pós cultivo, comparando ao cultivo já estabelecido em garrafas estáticas. De maneira geral, os resultados obtidos mostraram que foi possível expandir CMM utilizando a tecnologia de microcarregadores. A análise do metabolismo celular mostrou que não houve exaustão de nutrientes importantes como glicose e glutamina durante o cultivo, tampouco formação dos subprodutos lactato e amônia em concentrações inibitórias. As células recuperadas após a expansão mantiveram as características imunofenotípicas e funcionais. A produção média (n=10) foi de aproximadamente 4,9x105 cel/mL. Como o sistema utilizado permite o escalonamento, se utilizássemos um biorreator de 1L, seria possível a produção de aproximadamente 5x108 células que seriam suficientes para tratar mais de 3 pacientes de até 70Kg na dose de 2x106 células/Kg. Para expansão da mesma quantidade de células na forma tradicional seriam necessárias 135 garrafas de 175 cm2 com um custo total de expansão duas vezes superior à estimativa do custo de expansão utilizando microcarregadores. / Multipotent mesenchymal stromal cells are currently an attractive source for applications in tissue engineering and cell therapy. Due to the low availability in tissues (0,01%-0,0005%) and the high doses necessary for an infusion (about 106 cells/Kg patient), it has become necessary the development of effective and low cost technologies for in vitro expansion that enable to obtain MSC with maintenance of functional (differentiation and inhibition of lymphocytes proliferation), immunophenotypic and cytogenetics characteristics. MSC are adherent cells, i.e., they need a solid substrate to adhere and proliferate. The conventional procedure for expansion in static flasks normally involves a laborious process in which there is no suitable control and monitoring of the cultivation parameters besides presenting a higher susceptibility to contamination due to excessive manipulation to reach the ideal amount of cells. Moreover, this kind of cultivation does not allow a large scale production. For this reason, this work was proposed with the objective to develop a low cost, effective and scalable bioprocess for expansion of bone marrow-derived MSC in microcarriers. Cells grew on microcarriers Cyotdex 3, in spinner flasks with the -MEM medium supplemented with 15% FBS. We evaluated the cell adhesion to microcarriers, growth, metabolism, final cell recovery, and the functional and immunophenotypic properties before and after cultivation, comparing them with the cultivation already established in static flasks. In general, the results obtained showed that it was possible to expand MSC using microcarriers technology. The analysis of the cell metabolism showed that there was no depletion of important nutrients such as glucose and glutamine during cultivation, neither formation of lactate and ammonia subproducts in inhibitory concentrations. The cells recovered after the expansion kept the immunophenotypic and functional characteristics. The mean production (n=10) was about 4,9x105 cel/mL. As the system used allows the scale-up, if we had used a bioreactor of 1L it would had been possible to produce approximately 5x108 cells that would be enough to treat more than three patients of up to 70kg with a dose of 2x106 cells/kg. For the expansion of the same amount of cells in the traditional way, it would be necessary 135 T-flasks of 175 cm2 with total cost twice higher than the estimate cost of expansion using microcarriers.

Orientador: Rui Seabra Ferreira / Resumo: Desenvolvido em 1990 por um grupo de pesquisadores do Centro de Estudo de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP), no Estado de São Paulo, Brasil, o Biopolímero de Fibrina (BPF) possuía o principal objetivo de ser um adesivo à base de fibrina sem o uso de sangue humano, a fim de evitar a transmissão de doenças infecciosas por meio deste insumo. Após diversas pesquisas com o BPF, comprovou-se não somente sua capacidade adesiva, como também sua ação coagulante, sua ação como auxiliar no reparo ósseo e cartilaginoso e sua função como arcabouço para células-tronco mesenquimais (CTMs), devido ao fato de que o BPF possui uma estrutura tridimensional adequada. Em estudos recentes e ao exercer essa função, tal material não afetou o microambiente biológico das células, ou seja, permitiu a adesão, proliferação e diferenciação celular, e aderência e crescimento destas. Tais características, apresentadas pelo BPF, são desejáveis na maioria dos biopolímeros utilizáveis, o que ressalta a importância do aprofundamento das pesquisas com BPF e suas interações em experimentos in vivo. Assim, no capítulo 1 realizamos uma ampla revisão na literatura sobre biopolímeros de fibrina, células-tronco e reparação de tecido ósseo. No capítulo 2 é apresentado o artigo científico “Arcabouço de fibrina para células-tronco mesenquimais como potencial osteogênico”. / Abstract: Developed in 1990 by a group of researchers from the Center for the Study of Venomous and Poisonous Animals (CEVAP) in the State of São Paulo, Brazil, the Fibrin Biopolymer (GMP) had the main objective of being a fibrin-based adhesive without the use of human blood in order to avoid the transmission of infectious diseases by means of this input. After several investigations with BPF, it was verified not only its adhesive capacity, but also its coagulant action, its action as an aid in bone and cartilage repair and its function as a framework for mesenchymal stem cells (MSCs), due to the fact that the BPF has an adequate three-dimensional structure. In recent studies and in carrying out this function, such material did not affect the biological microenvironment of the cells, that is, it allowed cell adhesion, proliferation and differentiation, and adhesion and growth of these cells. These characteristics, presented by BPF, are desirable in most usable biopolymers, which underscores the importance of deepening GMP research and its interactions in in vivo experiments. Thus, in Chapter 1 we conducted a broad review in the literature on biopolymers of fibrin, stem cells and repair of bone tissue. In chapter 2 the scientific paper "Fibrin scaffold for mesenchymal stem cells as osteogenic potential" is presented. / Doutor