Le développement du cerveau nécessite une organisation finement régulée du système nerveux. Celle-ci dépend de mécanismes tels que la neurogenèse, la neuromigration et l'élaboration de contacts des neurones avec les cellules voisines et la matrice extracellulaire. Pour ce faire, plusieurs molécules sont mises à contribution, dont des facteurs de croissance, des protéases, des molécules d'adhésion cellulaire et de guidage ainsi que les composantes de la matrice extracellulaire. La céruloplasmine (CP) est une glycoprotéine à cuivre bleu de 132 kDa. Principalement sécrétée par les hépatocytes dans la circulation systémique, la CP est également exprimée à la surface d'astrocytes dans le cerveau. Elle agit à titre de principal transporteur plasmatique du cuivre, présente des propriétés antioxydantes et possède des activités oxydasique et ferroxydasique. Cette dernière activité fait de la CP un important régulateur du métabolisme du fer dans l'organisme. Nous avons montré dernièrement que la CP peut induire, in vitro, l'agrégation de neurones nouvellement différenciés de cellules souches embryonnaires P19. Cette action soulève la possibilité d'un rôle de la CP dans l'organisation du système nerveux en développement. Nous testons l'hypothèse que les mécanismes de cette neuroagrégation pourraient dépendre (1) de l'existence de récepteurs neuronaux de la CP, lesquels pourraient être purifiés par chromatographie d'affinité sur de la CP immobilisée en vue de leur caractérisation, et/ou (2) d'une action de protéases compte tenu que des protéases sont impliquées dans l'organisation du système nerveux en développement. Les résultats montrent que la CP peut être couplée à des billes de CNBr-Sepharose avec une efficacité de 100% pour un rapport de 7 mg de protéine par ml de gel. La CP couplée conserve 57% de son activité oxydasique initiale alors que la protéine libre incubée dans des conditions similaires a perdu 82% de son activité. Ainsi, l'immobilisation a un effet protecteur sur l'activité et donc la conformation de la CP. La colonne chromatographique CP-agarose a permis de retenir spécifiquement une protéine de 30 kDa à partir d'extraits de protéines membranaires d'érythrocytes bovins. Cette protéine pourrait correspondre à la forme monomérique du récepteur érythrocytaire rapporté dans la littérature. Des extraits de cerveaux de rat ont été déplétés de leur CP endogène puis chromatographiés sur un gel de CP-agarose. Une protéine de 45 kDa, éluée de ce gel, est reconnue par un anticorps anti-CP, indiquant une fragmentation de la CP immobilisée par une protéase de l'extrait. Ce fragment pourrait avoir une signification biologique puisqu'une forme immunoréactive de 45 kDa de la CP prédomine dans le cerveau de rats adultes et de nouveau-nés, contrairement à la forme native de 132 kDa qui prédomine dans la circulation. Le SBTI (inhibiteur de trypsine de la fève de soya) et l'aprotinine, des inhibiteurs de protéases à sérine, inhibent l'agrégation de neurones P19 induite par l'addition de CP native in vitro. Les neurones traités avec la CP en présence de ces inhibiteurs sont bien répartis sur le support de culture et étendent de nombreux neurites, contrairement aux neurones traités avec la CP seulement. En aucun cas la CP n'est dégradée dans le milieu neuroconditionné. La reeline, une protéase à sérine extracellulaire ayant un rôle établi dans la neuromigration développementale, existe sous des formes de 400, 300 et 180 kDa dans le cerveau, alors que les neurones P19 sécrètent la reeline sous formes de 400 et 180 kDa. Le traitement des neurones avec la CP induit la production de la forme de 300 kDa, production inhibée par le SBTI et l'aprotinine. Alors que l'existence de récepteurs neuronaux de la CP demeure pour le moment élusive, les résultats indiquent qu'une activité protéasique serait impliquée dans l'action neuroagrégative de la CP et que la reeline et non la CP serait une cible de cette activité. L'ensemble du travail supporte donc l'hypothèse que l'action neuroagrégative de la CP in vitro reflète l'implication de la protéine dans la neuromigration in vivo. Il soulève aussi la possibilité que des fragments physiologiques de la CP aient une action neuroagrégative comme celle de la CP native. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, neurones P19, migration neuronale, reeline, activité protéolytique

L'infarctus du myocarde est une maladie très répandue dans les pays industrialisés. La condition d'ischémie-reperfusion qui en est à l'origine endommage les tissus par la production accrue d'espèces oxygénées réactives (EOR) qui conduisent les cellules à un état de stress oxydatif. L'oxyde nitrique (NO·) est non seulement une EOR mais aussi une molécule de signalisation importante dans le système cardiovasculaire. Plusieurs effets cytoprotecteurs du NO· et de ses dérivés ont été démontrés dans le coeur ischémie-reperfusé, mais des effets cytotoxiques ont aussi été rapportés. La céruloplasmine (CP) est une glycoprotéine à cuivre circulante multifonctionnelle. Quoiqu'elle soit étudiée depuis longtemps, certaines de ses propriétés demeurent incomprises. Elle est entre autres reconnue comme un antioxydant circulant très important. L'équipe du Dr Mateescu a d'ailleurs rapporté qu'elle protège le coeur isolé des EOR durant l'ischémie-reperfusion. D'autres équipes ont toutefois montré une activité pro-oxydante de la CP qui ferait d'elle un facteur de risque associé aux maladies cardiovasculaires. Deux activités de la CP ont récemment été mises en évidence in vitro: la synthèse de nitrosothiols (RSNO) et de nitrites (NO₂¯) deux dérivés du NO· considérés comme des formes d'entreposage qui prolongeraient la durée de vie de ce facteur. Nous avons donc posé l'hypothèse d'une implication de la CP dans la potentialisation des effets du NO· par ses nouvelles activités. Le but de cette étude était ainsi d'évaluer l'effet cytoprotecteur de la combinaison CP + NO· et de vérifier l'implication d'une activité S-nitrosante et/ou nitrite-synthase de la CP. Pour ce faire, des cultures de cardiomyocytes de rats nouveau-nés ont été soumises à un stress oxydatif généré par l'ajout de H₂O₂ au milieu de culture. L'effet toxique ou protecteur de la CP et d'un donneur de NO·, le PAPA NONOate, a été déterminé par la mesure de la viabilité cellulaire à l'aide d'une coloration au Hoechst 33342 et à l'iodure de propidium. Les dérivés RSNO et NO₂¯du NO· ont été mesurés dans les milieux de culture par les réactifs colorimétriques de Griess ou par la sonde fluorescente DAN, après une optimisation de ces méthodes de dosage. Les résultats, qui vont à l'encontre de l'hypothèse de départ, ont montré que ni la CP, ni la combinaison CP + NO· ne protègent les cardiomyocytes du H₂O₂. La CP a même exercé un effet cytotoxique sur les cellules en présence de H₂O₂. Le NO· à faible concentration procure une certaine protection contre le H₂O₂, mais en intensifie la toxicité à forte concentration. En conditions acellulaires, l'activité S-nitrosante de la CP sur le glutathion a été confirmée et est comparable à celle de la littérature. La synthèse de NO₂¯ n'a toutefois pas été observée à des niveaux détectables. Des faits nouveaux ont aussi été révélés: la CP est capable d'« auto-nitrosation » et l'albumine inhibe l'activité S-nitrosante de la CP. Cette étude indiquerait que l'action cardioprotectrice de la CP contre les dommages causés par l'ischémie-reperfusion n'inclurait pas une protection contre le H₂O₂, ni une potentialisation de l'action du NO· contre ce H₂O₂. L'albumine présente dans le milieu de culture pourrait avoir masqué les possibles interactions entre la CP et le NO·. Ce dernier résultat suggère que la CP circulante aurait peu d'impact sur le métabolisme du NO· en situation physiologique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, Oxyde nitrique, Cardiomyocytes, Stress oxydatif, S-nitrosation.

La céruloplasmine (CP) est une protéine à cuivre plasmatique qui constitue, entre autres, un important marqueur de l'inflammation et possède plusieurs propriétés antioxydantes, incluant la capacité à piéger des espèces oxygénées réactives (EOR) et à contrer la génération de •OH par une activité ferroxydase. Des études antérieures ont aussi attribué à la CP une action protectrice sur un cœur de rat isolé soumis à l'ischémie-reperfusion, mais les mécanismes de cette cardioprotection n'ont pas tous été élucidés. Dans le passé, une étude a montré une action dépolarisante de la CP sur les membranes de cellules de neuroblastome, impliquant possiblement des canaux à K+. Par conséquent, un effet de la CP sur le potentiel d'action et les contractions des cardiomyocytes constitue une hypothèse du mécanisme de cardioprotection par la CP. De plus, la littérature relate deux nouvelles activités enzymatiques de la CP, qui pourraient logiquement contrer les effets délétères du H2O2 lors de l'ischémie-reperfusion. Premièrement, la CP exercerait une activité NO-oxydase permettant de former des thiols S-nitrosés (RSNO). Ainsi, la possibilité que la CP protège les thiols de protéines cellulaires par S-nitrosation est envisageable. Deuxièmement, l'activité glutathion(GSH)-peroxydase consommatrice de H2O2 de la CP pourrait aussi contribuer à protéger les cellules cardiaques. Les objectifs de cette étude visaient donc à évaluer, au niveau cellulaire, l'implication des activités dépolarisante, NO-oxydase/RSNO-synthase et GSH-peroxydase de la CP dans la cardioprotection. Des études de microscopie de fluorescence dynamique ont été faites pour déterminer l'effet de la CP sur les contractions des cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture en suivant les influx calciques. Aussi, les activités NO-oxydase/RSNO-synthase et GSH-peroxydase de la CP ont été vérifiées en milieu acellulaire, respectivement par dosage fluorimétrique du NO+, par dosage colorimétrique de Griess des RSNO et par dosage colorimétrique du H2O2 résiduel. A partir des conditions optimales déterminées en milieu acellulaire, l'effet protecteur des différentes combinaisons de CP avec les molécules potentiellement impliquées (GSH, Cys, NO•) a été analysé par mesure de la viabilité des cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture soumis à un stress oxydatif par le H2O2. La microscopie de fluorescence dynamique n'a pas permis d'obtenir d'effets reproductibles de la CP sur la contractilité des cardiomyocytes. L'activité NO-oxydase/RSNO-synthase de la CP, ainsi que la capacité de la protéine à diminuer le H2O2 en présence de GSH, ont été validées en conditions acellulaires. Cependant, seule la combinaison de la CP avec le GSH a protégé significativement les cardiomyocytes de l'effet létal du H2O2. Ce résultat confère pour la première fois une importance physiologique à la collaboration antioxydante des deux molécules. Le mécanisme cardioprotecteur par la CP et le GSH demeure énigmatique, puisque les dosages acellulaires n'ont pas permis de confirmer l'activité GSH-peroxydase précédemment attribuée à la CP. En effet, une action sacrificielle de la CP pourrait avoir masqué son activité catalytique. Néanmoins, ce mécanisme serait sensible à la présence de NO•, qui diminue la protection offerte par la CP et le GSH. Le NO• pourrait S-nitroser et inactiver un résidu Cys important dans l'action d'ébouage de la CP envers le H2O2. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, oxyde nitrique, stress oxydatif, cardiomyocyte, glutathion

Le fonctionnement du cerveau nécessite une organisation finement régulée des neurones. Cette organisation s'établit durant le développement et dépend de mécanismes tels que la neurogénèse, la neuromigration et la synaptogénèse. Ces mécanismes mettent à contribution plusieurs molécules, dont des facteurs de croissance, des protéases, des molécules d'adhésion cellulaire et de guidage ainsi que des composantes de la matrice extracellulaire. Une défaillance de ces mécanismes peut entraîner le développement de désordres neurologiques tels que la schizophrénie, l'épilepsie et le retard mental. La céruloplasmine (CP) pourrait être comptée parmi les molécules susceptibles de contribuer au développement du cerveau. La CP, une protéine à cuivre de 132 kDa (K), possède une activité ferroxydasique qui en fait un régulateur majeur du métabolisme du fer dans l'organisme. Elle est sécrétée dans la circulation par le foie. On la retrouve aussi dans le cerveau, sous une forme ancrée à la surface de cellules gliales par un groupement glycosylphosphatidylinositol. Des travaux publiés par les équipes des Drs Paquin et Mateescu ont montré que la CP peut induire l'agrégation de neurones nouvellement différenciés de cellules souches embryonnaires murines P19. Cette nouvelle action de la CP soulève l'hypothèse d'un rôle de cette protéine dans le développement du système nerveux, possiblement dans l'organisation spatiale des neurones. Les objectifs de cette thèse étaient d'investiguer les mécanismes de l'action agrégative de la CP sur les neurones P19 et une pertinence physiologique de la CP dans le développement. Pour guider notre travail, nous avons envisagé que la neuroagrégation pouvait avoir des mécanismes communs avec la migration neuronale qui se produit lors du développement et nous avons ainsi considéré deux types de protéines ayant un rôle dans ce processus : les protéases à sérine extracellulaires et la reeline. Des protéases à sérine ont en effet été rapportées comme modulateurs de la migration neuronale et la reeline a un rôle essentiel dans cette migration ainsi que dans le bon positionnement final des neurones. La reeline existe sous la forme du polypeptide pleine longueur de 400K et sous la forme de fragments de 300K et de 180K portant la terminaison NH2 native. Le profil d'expression et le rôle de ces fragments durant le développement ainsi que les mécanismes responsables de leur formation sont peu connus. La reeline se lie à ses récepteurs ApoER2 et VLDLr, ce qui stimule la phosphorylation de la protéine intracellulaire Dab-1 et, plus distalement, la phosphorylation de la cofiline, une protéine régulatrice de l'assemblage des filaments d'actine. D'autre part, l'AMPc et les kinases ERK.1/2 activées par des mitogènes sont des molécules signalisatrices capables de moduler la morphologie et la motilité cellulaires. Les résultats du premier volet de la recherche montrent que le traitement des neurones avec la CP non seulement induit leur agrégation mais stimule aussi la formation du fragment 300K de la reeline. La formation de ce fragment est postérieure à l'agrégation. L'ajout des inhibiteurs de protéases SBTI et aprotinine abolit l'agrégation des neurones et la formation de la reeline 300K, indiquant qu'une ou des protéases à sérine extracellulaires sont impliquées dans ces actions de la CP. Globalement, les résultats suggèrent deux modèles de relation entre la neuroagrégation et la génération de la reeline 300K : un modèle dans lequel la génération de la reeline 300K est une conséquence de la neuroagrégation et un modèle dans lequel les deux phénomènes sont indépendants l'un de l'autre. Comme indiqué plus bas, les études du troisième volet de la recherche favorisent le dernier modèle. Dans le deuxième volet, nous avons voulu déterminer si l'action de la CP sur la reeline dans des cultures de neurones naissants P19 pouvait exister in vivo. Nous avons comparé, par immunobuvardage, les profils d'expression ontogéniques de la CP, la reeline et la cofiline et ce, dans des cerveaux de souris de type sauvage et de souris déficientes en CP (CP-/-). Chez les souris de type sauvage, la CP est détectée dès le jour embryonnaire 12.5, ses niveaux augmentent jusqu'à la naissance et demeurent soutenus jusqu'à l'âge adulte. L'expression globale de la reeline suit à peu près celle de la CP mais les niveaux du fragment 300K sont plus élevés durant la période embryonnaire qu'après la naissance. La cofiline est fortement phosphorylée au cours de la première semaine postnatale. Par comparaison, chez les souris CP-/-, la reeline 300K est peu détectée avant la naissance et la déphosphorylation postnatale de la cofiline survient plus tôt. La CP a donc un impact sur l'expression de la reeline et de la cofiline durant le développement du cerveau. L'expression accrue de la reeline 300K dans les cerveaux embryonnaires de type sauvage par rapport aux cerveaux déficients en CP valide les résultats obtenus avec les neurones P19. Enfin, les études du troisième volet de la recherche, basées sur l'utilisation d'agents pharmacologiques, ont montré que l'action agrégative de la CP et l'influence de la protéine sur la reeline peuvent se produire indépendamment l'une de l'autre. Ainsi, l'AMPc a inhibé l'action neuroagrégative de la CP sans empêcher la génération de la reeline 300K et des inhibiteurs de la signalisation d'ERK1/2 ont diminué le taux de formation de la reeline 300K sans affecter la neuroagrégation. En conclusion, l'ensemble des résultats obtenus ex vivo et in vivo appuie l'hypothèse d'un rôle possible de la CP dans le développement du système nerveux. La définition de ce rôle demande des investigations supplémentaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, Reeline, Protéases à sérine, Cofiline, AMPc, PKA, ERK, Neurones P19, Développement du système nerveux, Immunobuvardage