O coronavírus canino (CCoV) causa gastroenterite em cães jovens, podendo ser letal, sobretudo quando há coinfecção com parvovírus canino (CPV). Os objetivos do presente projeto foram investigar a presença de CCoV e CPV em amostras fecais de cães jovens; estudar a diversidade molecular das amostras de CCoV com base em sequenciamento parcial dos genes M, S, 3b e N, incluindo amostras vacinais, e estudar a evolução in vitro de CCoV em células A72 de fibroma canino. Foram detectados 40,17% (47/117) animais positivos para CCoV e 13,68% (16/117) para CPV. Estudos filogenéticos demonstraram que oito amostras foram classificadas como CCoV-II, vinte e cinco como CCoV-I. Análises para o gene M destacaram alta identidade de CCoV-I com amostras de coronavírus da peritonite infecciosa felina (PIF) e uma possível amostra pantrópica foi demonstrada pela análise do gene S. O gene do nucleocapsídeo de CCoV é altamente conservado entre os tipos I e tipo II, com uma resolução mais baixa em relação a árvores para os genes M e S. Amostras dos tipos I e II apresentam um polimorfismo baixo para o gene 3b, sem marcadores estáveis para diferenciação dos tipos de CCoV. Uma amostra de CCoV-II putativamente pantrópica foi isolada em células A72, resultando em efeito citopático no 5o dia da 5a passagem. No estudo evolutivo, a amostra vacinal CCV 1-71 e nove passagens desta em células A72 foram submetidas a amplificação parcial e clonagem molecular do gene S seguida de sequenciamento de DNA. Os resultados mostraram mutações não silenciosas, silenciosas e três deleções de aminoácidos, mas nenhuma mutação compartilhada entre as diversas passagens. Amostras vacinais de CCoV-II adaptadas em células podem ser altamente geneticamente estáveis após passagens em série em uma mesma linhagem celular, acumulando substituições de nucleotídeos principalmente sinônimas no gene S devido a relação célula - hospedeiro estável. Estes resultados de epidemiologia molecular e processos evolutivos de CCoV podem servir para uma melhor compreensão da virologia básica e ser base de dados para estudos em outros coronavírus / Canine coronavirus (CCoV) causes gastroenteritis in young dogs and can be lethal, especially when there is co-infection with canine parvovirus (CPV). The objectives of this project were to investigate the presence of CCoV and CPV in stool samples from young dogs, the molecular diversity of CCoV strains based on partial sequencing of genes M, S, N and 3b, and the in vitro evolution of CCoV in A72 canine fibroma. Of the fecal samples studied, 40.17% animals (47/117) were positive for CCoV and 13.68% (16/117) for CPV. Phylogenetic studies have shown that eight strains were CCoV-II and twenty five CCoV-I. Phylogenetic analysis for the M gene highlighted the high identity of CCoV-I strains with a feline coronavirus strain (FCoV) that causes feline infectious peritonitis (FIP). Further analysis based on the spike gene showed a putative pantropic CCoV strain (CCoV-II/dog50). CCoV nucleocapsid gene is highly conserved among type I and type II, with a lower resolution relative to trees based on M and S genes. CCoV Types I and II had a low polymorphism for 3b gene, without any stable markers to differentiate thee types. Regarding the virus isolation trial, a putative pantropic CCoV-II strain was successfully isolated in A72 cells from, resulting in cytopathic effect on the 5th day of the 5th passage. In the evolutionary study, the vaccine strain CCV 1-71 and nine passages of this strain in A72 were submitted to partial S gene amplification and molecular cloning followed by DNA sequencing. Missense, silent, and three amino acids deletions were found amongst diverse clones of each passage, but no mutation was repeatedly found among passages. Cell culture-adapted CCoV-II vaccine strains can be highly genetically stable upon serial passage in a same cell line, accumulating primarily synonymous nucleotide substitutions in the S gene due to a stable cell-host relationship. In short, all data gathering herein on molecular epidemiology and evolutionary processes of CCoV can serve for a better understanding of basic virology and as a basis for studies on other coronaviruses

O coronavírus canino (CCoV) causa gastroenterite em cães jovens, podendo ser letal, sobretudo quando há coinfecção com parvovírus canino (CPV). Os objetivos do presente projeto foram investigar a presença de CCoV e CPV em amostras fecais de cães jovens; estudar a diversidade molecular das amostras de CCoV com base em sequenciamento parcial dos genes M, S, 3b e N, incluindo amostras vacinais, e estudar a evolução in vitro de CCoV em células A72 de fibroma canino. Foram detectados 40,17% (47/117) animais positivos para CCoV e 13,68% (16/117) para CPV. Estudos filogenéticos demonstraram que oito amostras foram classificadas como CCoV-II, vinte e cinco como CCoV-I. Análises para o gene M destacaram alta identidade de CCoV-I com amostras de coronavírus da peritonite infecciosa felina (PIF) e uma possível amostra pantrópica foi demonstrada pela análise do gene S. O gene do nucleocapsídeo de CCoV é altamente conservado entre os tipos I e tipo II, com uma resolução mais baixa em relação a árvores para os genes M e S. Amostras dos tipos I e II apresentam um polimorfismo baixo para o gene 3b, sem marcadores estáveis para diferenciação dos tipos de CCoV. Uma amostra de CCoV-II putativamente pantrópica foi isolada em células A72, resultando em efeito citopático no 5o dia da 5a passagem. No estudo evolutivo, a amostra vacinal CCV 1-71 e nove passagens desta em células A72 foram submetidas a amplificação parcial e clonagem molecular do gene S seguida de sequenciamento de DNA. Os resultados mostraram mutações não silenciosas, silenciosas e três deleções de aminoácidos, mas nenhuma mutação compartilhada entre as diversas passagens. Amostras vacinais de CCoV-II adaptadas em células podem ser altamente geneticamente estáveis após passagens em série em uma mesma linhagem celular, acumulando substituições de nucleotídeos principalmente sinônimas no gene S devido a relação célula - hospedeiro estável. Estes resultados de epidemiologia molecular e processos evolutivos de CCoV podem servir para uma melhor compreensão da virologia básica e ser base de dados para estudos em outros coronavírus / Canine coronavirus (CCoV) causes gastroenteritis in young dogs and can be lethal, especially when there is co-infection with canine parvovirus (CPV). The objectives of this project were to investigate the presence of CCoV and CPV in stool samples from young dogs, the molecular diversity of CCoV strains based on partial sequencing of genes M, S, N and 3b, and the in vitro evolution of CCoV in A72 canine fibroma. Of the fecal samples studied, 40.17% animals (47/117) were positive for CCoV and 13.68% (16/117) for CPV. Phylogenetic studies have shown that eight strains were CCoV-II and twenty five CCoV-I. Phylogenetic analysis for the M gene highlighted the high identity of CCoV-I strains with a feline coronavirus strain (FCoV) that causes feline infectious peritonitis (FIP). Further analysis based on the spike gene showed a putative pantropic CCoV strain (CCoV-II/dog50). CCoV nucleocapsid gene is highly conserved among type I and type II, with a lower resolution relative to trees based on M and S genes. CCoV Types I and II had a low polymorphism for 3b gene, without any stable markers to differentiate thee types. Regarding the virus isolation trial, a putative pantropic CCoV-II strain was successfully isolated in A72 cells from, resulting in cytopathic effect on the 5th day of the 5th passage. In the evolutionary study, the vaccine strain CCV 1-71 and nine passages of this strain in A72 were submitted to partial S gene amplification and molecular cloning followed by DNA sequencing. Missense, silent, and three amino acids deletions were found amongst diverse clones of each passage, but no mutation was repeatedly found among passages. Cell culture-adapted CCoV-II vaccine strains can be highly genetically stable upon serial passage in a same cell line, accumulating primarily synonymous nucleotide substitutions in the S gene due to a stable cell-host relationship. In short, all data gathering herein on molecular epidemiology and evolutionary processes of CCoV can serve for a better understanding of basic virology and as a basis for studies on other coronaviruses

O parvovírus canino (CPV-2) e o coronavírus canino (CCoV-II) são considerados os principais patógenos responsáveis pela gastroenterite viral aguda em cães filhotes, causando, em alguns casos a alta morbidade e mortalidade, sobretudo em função da capacidade de potencializar infecções por outros agentes. Esses vírus estão distribuídos mundialmente na população canina, sendo responsáveis por diversos surtos em muitos países, sobretudo onde ocorre grande concentração de animais, como em abrigos e canis. O CPV-2 e o CCoV-II foram identificados a partir da década de 1970 e desde então, têm sido detectados em animais clinicamente saudáveis, assim como em cães que apresentam vômitos e diarreia severa. A presente tese tem como objetivo a identificação desses agentes na população canina do Brasil, sendo constituída de dois capítulos distintos: Capítulo 1- Caracterização de cepas de parvovírus canino circulantes no Brasil entre 2008 e 2010 e o Capítulo 2 - Caracterização do coronavírus canino pantrópico no Brasil. No Capítulo 1, foram analisadas amostras de fezes de 144 cães pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para CPV-2, 29,2% (42/144) das amostras foram positivos. Das 42 amostras positivas, 71,4% (30) dos cães tinham sinais de gastroenterite hemorrágica. O sequenciamento de 583 pb do gene VP2 das amostras positivas, identificaram 78,6% (33/42) como CPV-2c, 19% (8/42) como CPV-2b e 2,4% (1/42) como tipo de 2a. A análise filogenética dos CPV-2 encontrados nas amostras brasileiras mostrou que elas são muito semelhantes às de outros países e o CPV-2c tornou-se predominante no Brasil. No Capítulo 2, foram analisadas amostras de órgãos de cinco cães jovens pela transcrição reversa (RT-PCR) para os genes M e S de CCoV-II, sendo que três cães foram positivos para CCoV-II e CPV-2, um foi positivo apenas para CCoV-II e um para o CPV-2 e o outro foi negativo para todos os agentes pesquisados. O sequenciamento dos produtos de amplificação identificou que eles eram CPV-2c e CCoV-IIa. A análise filogenética dos CCoV-IIa circulantes na população canina da região Sul do Brasil mostrou que são semelhantes aos encontrados em outros países. No entanto, os espécimes brasileiros tendem a agrupar-se em um único clado, sugerindo um ancestral comum. Os sinais clínicos e lesões causados pela nova variante de CPV-2 e do subtipo pantrópico CCoV-II foram muito semelhantes entre si, sendo de grande importância a inclusão do diagnóstico diferencial entre esses dois agente virais. Esta foi a primeira caracterização do subtipo CCoV-IIa em cães no Brasil. A detecção e caracterização do CPV-2 e do CCoV-II, que estão circulando atualmente, são essenciais para o entendimento da evolução viral e para o desenvolvimento de medidas de controle e prevenção. / Canine parvovirus (CPV-2) and canine coronavirus (CCoV-II) are considered the major pathogens causing acute viral gastroenteritis in puppies, in some cases with high morbidity and mortality, especially in terms of ability to potentiate infections by other agents. These viruses are distributed worldwide being responsible for outbreaks in many countries, especially where there is high concentration of animals, such as shelters and kennels. The CPV-2 and CCoV-II were identified from the late 1970 and since then have been detected in clinically healthy animals, as well as in dogs with vomiting and severe diarrhea. This work aims the identification of these agents in the canine population of Brazil, comprised by two distinct chapters: Chapter 1- Typing of canine parvovirus strains circulating in Brazil between 2008 and 2010, and Chapter 2- Characterization of pantropic canine coronavirus in Brazil. In chapter 1, stool samples of 144 dogs were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for CPV-2, 29,2% (42/144) of them were positive. Of the 42 positive samples, 7,4% (30) of the dogs had signs of hemorrhagic gastroenteritis. The sequencing of 583 bp VP2 gene of the positive samples identified 78,6% (33/42) as CPV-2c, 19% (8/42) as CPV-2b and 2,4% (1/42) as type 2a. Phylogenetic analysis of CPV-2 found in the canine population of Brazil, has shown that they are very similar to those of other countries and CPV-2c has become prevalent in Brazil. In Chapter 2 organ samples of five puppies were analyzed by reverse transcription (RT-PCR) for CCoV-II M and S genes, of wich three dogs were positive to CCoV-II and CPV-2, one was positive only to CCoV-II and one for CPV-2 and the other was negative for all the agents searched. The sequencing of the amplification products identified that they were CPV-2c and CCoV-IIa. Phylogenetic analysis of circulating CCoV-IIa in canine population in southern Brazil showed that they are similar to those found in other countries. However, the Brazilian specimens tend to group together in a single clade, suggesting a common ancestor. Clinical signs and injuries caused by the new CPV-2 variant and of pantropic subtype of CCoV-II are very similar to each other, being of great importance for the diagnosis including the differential diagnosis of these two viral agents. This was the first characterization of subtype CCoV-IIa in dogs in Brazil. The detection and characterization of CPV-2 and CCoV-II, that are currently circulating, are essential to understanding the viral evolution and to the development of more effective control and prevention measures.

O parvovírus canino (CPV-2) e o coronavírus canino (CCoV-II) são considerados os principais patógenos responsáveis pela gastroenterite viral aguda em cães filhotes, causando, em alguns casos a alta morbidade e mortalidade, sobretudo em função da capacidade de potencializar infecções por outros agentes. Esses vírus estão distribuídos mundialmente na população canina, sendo responsáveis por diversos surtos em muitos países, sobretudo onde ocorre grande concentração de animais, como em abrigos e canis. O CPV-2 e o CCoV-II foram identificados a partir da década de 1970 e desde então, têm sido detectados em animais clinicamente saudáveis, assim como em cães que apresentam vômitos e diarreia severa. A presente tese tem como objetivo a identificação desses agentes na população canina do Brasil, sendo constituída de dois capítulos distintos: Capítulo 1- Caracterização de cepas de parvovírus canino circulantes no Brasil entre 2008 e 2010 e o Capítulo 2 - Caracterização do coronavírus canino pantrópico no Brasil. No Capítulo 1, foram analisadas amostras de fezes de 144 cães pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para CPV-2, 29,2% (42/144) das amostras foram positivos. Das 42 amostras positivas, 71,4% (30) dos cães tinham sinais de gastroenterite hemorrágica. O sequenciamento de 583 pb do gene VP2 das amostras positivas, identificaram 78,6% (33/42) como CPV-2c, 19% (8/42) como CPV-2b e 2,4% (1/42) como tipo de 2a. A análise filogenética dos CPV-2 encontrados nas amostras brasileiras mostrou que elas são muito semelhantes às de outros países e o CPV-2c tornou-se predominante no Brasil. No Capítulo 2, foram analisadas amostras de órgãos de cinco cães jovens pela transcrição reversa (RT-PCR) para os genes M e S de CCoV-II, sendo que três cães foram positivos para CCoV-II e CPV-2, um foi positivo apenas para CCoV-II e um para o CPV-2 e o outro foi negativo para todos os agentes pesquisados. O sequenciamento dos produtos de amplificação identificou que eles eram CPV-2c e CCoV-IIa. A análise filogenética dos CCoV-IIa circulantes na população canina da região Sul do Brasil mostrou que são semelhantes aos encontrados em outros países. No entanto, os espécimes brasileiros tendem a agrupar-se em um único clado, sugerindo um ancestral comum. Os sinais clínicos e lesões causados pela nova variante de CPV-2 e do subtipo pantrópico CCoV-II foram muito semelhantes entre si, sendo de grande importância a inclusão do diagnóstico diferencial entre esses dois agente virais. Esta foi a primeira caracterização do subtipo CCoV-IIa em cães no Brasil. A detecção e caracterização do CPV-2 e do CCoV-II, que estão circulando atualmente, são essenciais para o entendimento da evolução viral e para o desenvolvimento de medidas de controle e prevenção. / Canine parvovirus (CPV-2) and canine coronavirus (CCoV-II) are considered the major pathogens causing acute viral gastroenteritis in puppies, in some cases with high morbidity and mortality, especially in terms of ability to potentiate infections by other agents. These viruses are distributed worldwide being responsible for outbreaks in many countries, especially where there is high concentration of animals, such as shelters and kennels. The CPV-2 and CCoV-II were identified from the late 1970 and since then have been detected in clinically healthy animals, as well as in dogs with vomiting and severe diarrhea. This work aims the identification of these agents in the canine population of Brazil, comprised by two distinct chapters: Chapter 1- Typing of canine parvovirus strains circulating in Brazil between 2008 and 2010, and Chapter 2- Characterization of pantropic canine coronavirus in Brazil. In chapter 1, stool samples of 144 dogs were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for CPV-2, 29,2% (42/144) of them were positive. Of the 42 positive samples, 7,4% (30) of the dogs had signs of hemorrhagic gastroenteritis. The sequencing of 583 bp VP2 gene of the positive samples identified 78,6% (33/42) as CPV-2c, 19% (8/42) as CPV-2b and 2,4% (1/42) as type 2a. Phylogenetic analysis of CPV-2 found in the canine population of Brazil, has shown that they are very similar to those of other countries and CPV-2c has become prevalent in Brazil. In Chapter 2 organ samples of five puppies were analyzed by reverse transcription (RT-PCR) for CCoV-II M and S genes, of wich three dogs were positive to CCoV-II and CPV-2, one was positive only to CCoV-II and one for CPV-2 and the other was negative for all the agents searched. The sequencing of the amplification products identified that they were CPV-2c and CCoV-IIa. Phylogenetic analysis of circulating CCoV-IIa in canine population in southern Brazil showed that they are similar to those found in other countries. However, the Brazilian specimens tend to group together in a single clade, suggesting a common ancestor. Clinical signs and injuries caused by the new CPV-2 variant and of pantropic subtype of CCoV-II are very similar to each other, being of great importance for the diagnosis including the differential diagnosis of these two viral agents. This was the first characterization of subtype CCoV-IIa in dogs in Brazil. The detection and characterization of CPV-2 and CCoV-II, that are currently circulating, are essential to understanding the viral evolution and to the development of more effective control and prevention measures.

O parvovírus canino (CPV-2) e o coronavírus canino (CCoV-II) são considerados os principais patógenos responsáveis pela gastroenterite viral aguda em cães filhotes, causando, em alguns casos a alta morbidade e mortalidade, sobretudo em função da capacidade de potencializar infecções por outros agentes. Esses vírus estão distribuídos mundialmente na população canina, sendo responsáveis por diversos surtos em muitos países, sobretudo onde ocorre grande concentração de animais, como em abrigos e canis. O CPV-2 e o CCoV-II foram identificados a partir da década de 1970 e desde então, têm sido detectados em animais clinicamente saudáveis, assim como em cães que apresentam vômitos e diarreia severa. A presente tese tem como objetivo a identificação desses agentes na população canina do Brasil, sendo constituída de dois capítulos distintos: Capítulo 1- Caracterização de cepas de parvovírus canino circulantes no Brasil entre 2008 e 2010 e o Capítulo 2 - Caracterização do coronavírus canino pantrópico no Brasil. No Capítulo 1, foram analisadas amostras de fezes de 144 cães pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para CPV-2, 29,2% (42/144) das amostras foram positivos. Das 42 amostras positivas, 71,4% (30) dos cães tinham sinais de gastroenterite hemorrágica. O sequenciamento de 583 pb do gene VP2 das amostras positivas, identificaram 78,6% (33/42) como CPV-2c, 19% (8/42) como CPV-2b e 2,4% (1/42) como tipo de 2a. A análise filogenética dos CPV-2 encontrados nas amostras brasileiras mostrou que elas são muito semelhantes às de outros países e o CPV-2c tornou-se predominante no Brasil. No Capítulo 2, foram analisadas amostras de órgãos de cinco cães jovens pela transcrição reversa (RT-PCR) para os genes M e S de CCoV-II, sendo que três cães foram positivos para CCoV-II e CPV-2, um foi positivo apenas para CCoV-II e um para o CPV-2 e o outro foi negativo para todos os agentes pesquisados. O sequenciamento dos produtos de amplificação identificou que eles eram CPV-2c e CCoV-IIa. A análise filogenética dos CCoV-IIa circulantes na população canina da região Sul do Brasil mostrou que são semelhantes aos encontrados em outros países. No entanto, os espécimes brasileiros tendem a agrupar-se em um único clado, sugerindo um ancestral comum. Os sinais clínicos e lesões causados pela nova variante de CPV-2 e do subtipo pantrópico CCoV-II foram muito semelhantes entre si, sendo de grande importância a inclusão do diagnóstico diferencial entre esses dois agente virais. Esta foi a primeira caracterização do subtipo CCoV-IIa em cães no Brasil. A detecção e caracterização do CPV-2 e do CCoV-II, que estão circulando atualmente, são essenciais para o entendimento da evolução viral e para o desenvolvimento de medidas de controle e prevenção. / Canine parvovirus (CPV-2) and canine coronavirus (CCoV-II) are considered the major pathogens causing acute viral gastroenteritis in puppies, in some cases with high morbidity and mortality, especially in terms of ability to potentiate infections by other agents. These viruses are distributed worldwide being responsible for outbreaks in many countries, especially where there is high concentration of animals, such as shelters and kennels. The CPV-2 and CCoV-II were identified from the late 1970 and since then have been detected in clinically healthy animals, as well as in dogs with vomiting and severe diarrhea. This work aims the identification of these agents in the canine population of Brazil, comprised by two distinct chapters: Chapter 1- Typing of canine parvovirus strains circulating in Brazil between 2008 and 2010, and Chapter 2- Characterization of pantropic canine coronavirus in Brazil. In chapter 1, stool samples of 144 dogs were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for CPV-2, 29,2% (42/144) of them were positive. Of the 42 positive samples, 7,4% (30) of the dogs had signs of hemorrhagic gastroenteritis. The sequencing of 583 bp VP2 gene of the positive samples identified 78,6% (33/42) as CPV-2c, 19% (8/42) as CPV-2b and 2,4% (1/42) as type 2a. Phylogenetic analysis of CPV-2 found in the canine population of Brazil, has shown that they are very similar to those of other countries and CPV-2c has become prevalent in Brazil. In Chapter 2 organ samples of five puppies were analyzed by reverse transcription (RT-PCR) for CCoV-II M and S genes, of wich three dogs were positive to CCoV-II and CPV-2, one was positive only to CCoV-II and one for CPV-2 and the other was negative for all the agents searched. The sequencing of the amplification products identified that they were CPV-2c and CCoV-IIa. Phylogenetic analysis of circulating CCoV-IIa in canine population in southern Brazil showed that they are similar to those found in other countries. However, the Brazilian specimens tend to group together in a single clade, suggesting a common ancestor. Clinical signs and injuries caused by the new CPV-2 variant and of pantropic subtype of CCoV-II are very similar to each other, being of great importance for the diagnosis including the differential diagnosis of these two viral agents. This was the first characterization of subtype CCoV-IIa in dogs in Brazil. The detection and characterization of CPV-2 and CCoV-II, that are currently circulating, are essential to understanding the viral evolution and to the development of more effective control and prevention measures.