CD97, ein Mitglied der Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (adhesion-GPCR), wird auf hämatopoetischen, muskulären und epithelialen Zellen exprimiert. Humanes und murines CD97 zeigen ein vergleichbares Expressionsmuster. Funktionell ist CD97 an Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, der Kanzerogenese und der Migration von Tumorzellen beteiligt. Um die molekulare Regulation von CD97 zu untersuchen, wurde der murine (m)CD97 Promotor charakterisiert. Unter verschiedenen murinen Zelllinien zeigten RAW264.7 (Makrophage), C2C12 (Myoblast) und C3H10T1/2 (Fibroblast) eine starke CD97 Expression. Der Transkriptionsstartpunkt des murinen (m)Cd97 Gens wurde -46bp upstream des ATG Startcodons lokalisiert. Es wurden Promotorplasmide hergestellt, welche aus verschieden langen Fragmenten der 5’ untranslatierten Region (5‘ UTR) von mCd97 und dem Reportervektor pGL3-Basic (pGL3) bestehen. Nach transienter Transfektion in die Zelllinien wurde mit einem Luziferasereportergenassay die Luziferaseaktivität bestimmt und damit der Nukleotidbereich -78 bis +29 bp der 5‘ UTR als minimaler Promotor definiert. Die evolutionär konservierten Nukleotide CACTT (-93/-89) konnten mittels Mutationsanalyse in den Zelllinien RAW264.7, C2C12 und C3H10T1/2 als aktivierende Sequenz im mCD97 Promotor identifiziert werden. Mit Hilfe vergleichender Bioinformatik und electrophoretic mobility shift assay (EMSA) gelang es nicht, den hier bindenden Transkriptionsfaktor zu bestimmen. In C2C12 zeigte die Differenzierung vom Myoblasten zum Myozyten eine Regulation von mCD97. Durch EMSA wurde in vitro die Bindung des serum response factor (SRF) an ein CArG-Element innerhalb der 5‘ UTR nachgewiesen. Zusammengefasst wurde der mCD97 Promotor erstmalig beschrieben und der Einfluss von SRF auf die mCD97 Expression in C2C12 nachgewiesen.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

CD97 gehört zur Familie der Adhäsions-G-Protein gekoppelten Rezeptoren (aGPCR), die aus einem langen extrazellulären N-terminalen Fragment (NTF) und einem nicht-kovalent gekoppelten C-terminalen Fragment (CTF) mit der sieben-transmembranären (TM7) Region und dem intrazellulären Teil bestehen. CD97 wird in malignen Tumoren exprimiert. In der humanen Fibrosarkomzelllinie HT1080 steigert die stabile Überexpression von CD97 die ungerichtete zweidimensionale (2D) Migration einzelner Zellen. Eine Verkürzung von CD97 im CTF auf zwei transmembranäre (TM2) Domänen führt zu einer Suppression der 2D-Migration im Vergleich zu stabil mock-transfektierten HT1080 Kontrollzellen. Wahrscheinlich supprimiert CD97/TM2 die endogene CD97-Wirkung. Unbekannt ist, welche Signalwege durch CD97-Überexpression in HT1080 reguliert werden und welche Signalwege für die Migrationssteigerung von HT1080 verantwortlich sind. Die Klärung dieser Signalwege ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Die Phosphorylierung von Proteinkinasen ist eine posttranslationale Modifikation zur Regulation der Kinaseaktivität mit nachfolgender Aktivierung oder Inaktivierung eines Signalweges. Daher sind Expression und Phosphorylierung der Proteinkinasen zur Identifikation regulierter Signalwege interessant. Dazu wurden in Lysaten von CD97/TM7, CD97/TM2 und mock-transfektierten HT1080 mittels Kinetworks Phosphosite Screen KPSS 1.3 Profiling (Multi-Immunoblot™) 37 verschiedene Proteinphosphorylierungen untersucht und regulierte Signalwege identifiziert. An 25 Phosphorylierungsstellen erfolgt eine Regulation durch CD97. Anschließend wurden die Ergebnisse der interessantesten Proteine hinsichtlich ihrer Expression und Phosphorylierung im Western Blot verifiziert und um Proteine erweitert, die klassisch an der Regulation der Zellmigration beteiligt sind. Es zeigt sich eine Aktivierung des PI3-Kinase/Akt-Signalweges und eine Inhibierung von Src durch CD97. 2D-Migrationsversuche von HT1080 CD97/TM7, CD97/TM2 und mock mit spezifischen Inhibitoren gegen den PI3-Kinase/Akt-Signalweg und gegen Src bestätigen, dass diese Kinasen an der CD97-induzierten Steigerung der 2D-Migration beteiligt sind. Weiterhin finden sich Hinweise, dass in HT1080 CD97 die Apoptose hemmt und die Proliferation reguliert. Insgesamt wird in dieser Arbeit ein Überblick über die durch CD97 regulierten Signalwege gegeben. Die CD97-gesteigerte 2D-Migration von HT1080 wird durch eine Aktivierung des PI3-Kinase/ Akt-Signalweges und Inhibierung von Src vermittelt.

CD97, ein Mitglied der Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (adhesion-GPCR), wird auf hämatopoetischen, muskulären und epithelialen Zellen exprimiert. Humanes und murines CD97 zeigen ein vergleichbares Expressionsmuster. Funktionell ist CD97 an Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, der Kanzerogenese und der Migration von Tumorzellen beteiligt. Um die molekulare Regulation von CD97 zu untersuchen, wurde der murine (m)CD97 Promotor charakterisiert. Unter verschiedenen murinen Zelllinien zeigten RAW264.7 (Makrophage), C2C12 (Myoblast) und C3H10T1/2 (Fibroblast) eine starke CD97 Expression. Der Transkriptionsstartpunkt des murinen (m)Cd97 Gens wurde -46bp upstream des ATG Startcodons lokalisiert. Es wurden Promotorplasmide hergestellt, welche aus verschieden langen Fragmenten der 5’ untranslatierten Region (5‘ UTR) von mCd97 und dem Reportervektor pGL3-Basic (pGL3) bestehen. Nach transienter Transfektion in die Zelllinien wurde mit einem Luziferasereportergenassay die Luziferaseaktivität bestimmt und damit der Nukleotidbereich -78 bis +29 bp der 5‘ UTR als minimaler Promotor definiert. Die evolutionär konservierten Nukleotide CACTT (-93/-89) konnten mittels Mutationsanalyse in den Zelllinien RAW264.7, C2C12 und C3H10T1/2 als aktivierende Sequenz im mCD97 Promotor identifiziert werden. Mit Hilfe vergleichender Bioinformatik und electrophoretic mobility shift assay (EMSA) gelang es nicht, den hier bindenden Transkriptionsfaktor zu bestimmen. In C2C12 zeigte die Differenzierung vom Myoblasten zum Myozyten eine Regulation von mCD97. Durch EMSA wurde in vitro die Bindung des serum response factor (SRF) an ein CArG-Element innerhalb der 5‘ UTR nachgewiesen. Zusammengefasst wurde der mCD97 Promotor erstmalig beschrieben und der Einfluss von SRF auf die mCD97 Expression in C2C12 nachgewiesen.

CD97 gehört zur Familie der Adhäsions-G-Protein gekoppelten Rezeptoren (aGPCR), die aus einem langen extrazellulären N-terminalen Fragment (NTF) und einem nicht-kovalent gekoppelten C-terminalen Fragment (CTF) mit der sieben-transmembranären (TM7) Region und dem intrazellulären Teil bestehen. CD97 wird in malignen Tumoren exprimiert. In der humanen Fibrosarkomzelllinie HT1080 steigert die stabile Überexpression von CD97 die ungerichtete zweidimensionale (2D) Migration einzelner Zellen. Eine Verkürzung von CD97 im CTF auf zwei transmembranäre (TM2) Domänen führt zu einer Suppression der 2D-Migration im Vergleich zu stabil mock-transfektierten HT1080 Kontrollzellen. Wahrscheinlich supprimiert CD97/TM2 die endogene CD97-Wirkung. Unbekannt ist, welche Signalwege durch CD97-Überexpression in HT1080 reguliert werden und welche Signalwege für die Migrationssteigerung von HT1080 verantwortlich sind. Die Klärung dieser Signalwege ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Die Phosphorylierung von Proteinkinasen ist eine posttranslationale Modifikation zur Regulation der Kinaseaktivität mit nachfolgender Aktivierung oder Inaktivierung eines Signalweges. Daher sind Expression und Phosphorylierung der Proteinkinasen zur Identifikation regulierter Signalwege interessant. Dazu wurden in Lysaten von CD97/TM7, CD97/TM2 und mock-transfektierten HT1080 mittels Kinetworks Phosphosite Screen KPSS 1.3 Profiling (Multi-Immunoblot™) 37 verschiedene Proteinphosphorylierungen untersucht und regulierte Signalwege identifiziert. An 25 Phosphorylierungsstellen erfolgt eine Regulation durch CD97. Anschließend wurden die Ergebnisse der interessantesten Proteine hinsichtlich ihrer Expression und Phosphorylierung im Western Blot verifiziert und um Proteine erweitert, die klassisch an der Regulation der Zellmigration beteiligt sind. Es zeigt sich eine Aktivierung des PI3-Kinase/Akt-Signalweges und eine Inhibierung von Src durch CD97. 2D-Migrationsversuche von HT1080 CD97/TM7, CD97/TM2 und mock mit spezifischen Inhibitoren gegen den PI3-Kinase/Akt-Signalweg und gegen Src bestätigen, dass diese Kinasen an der CD97-induzierten Steigerung der 2D-Migration beteiligt sind. Weiterhin finden sich Hinweise, dass in HT1080 CD97 die Apoptose hemmt und die Proliferation reguliert. Insgesamt wird in dieser Arbeit ein Überblick über die durch CD97 regulierten Signalwege gegeben. Die CD97-gesteigerte 2D-Migration von HT1080 wird durch eine Aktivierung des PI3-Kinase/ Akt-Signalweges und Inhibierung von Src vermittelt.

CD97 ist ein G protein-coupled receptor der zu der Gruppe der Adhäsions-GPCRs zuzuordnen ist. CD97 ist im normalen humanen Darmepithel in lateralen Zellkontakten lokalisiert. In transgenen Mäusen, die CD97 selektiv in normalen intestinalen Epithelzellen überexprimieren, werden die adherens junctions durch Stabilisierung des nicht-phosphorylierten membran-gebundenen β-catenins verstärkt. Neben der Epithelzellverband-stabilisierenden Funktion von β-catenin in adherens junctions spielt β-catenin im Zellkern als Aktivator von Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle in der kolorektalen Karzinogenese. Diese unterschiedliche zelluläre Verteilung wird über den kanonischen Wnt-Signalweg reguliert. CD97 wird in kolorektalen Karzinomen hochreguliert. Steinert et al. beschrieben, dass insbesondere sogenannte scattered Tumorzellen an der Invasionsfront des kolorektalen Karzinoms CD97 im Vergleich zu Zellen im Tumorzentrum höher exprimieren. Dieses Phänomen geht mit einem höheren Tumorstadium und verstärkter Lymphgefäßinvasion einher. In diesen Zellen wird β-catenin verstärkt im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert. Die histologische Lokalisation von CD97 im kolorektalen Normal- und Karzinomgewebe ließ zunächst vermuten, dass CD97 ein direktes β-catenin/Tcf-Zielgen im fehlregulierten Wnt-Signalweg ist. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass CD97 kein Zielgen des kanonischen Wnt-Signalweges ist. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal eine immunhistochemische Studie durchgeführt, die die Lokalisation von CD97 und β-catenin in normalem und malignem kolorektalem Gewebe parallel vergleichend analysiert. Bisher konnte CD97 nur im Kryostat-Schnitt immunhistochemisch dargestellt werden. Die immunhistochemische Darstellung der nukleären Expression von β-catenin ist jedoch nur in Paraffin-eingebetteten Geweben möglich. Somit etablierten wir erstmals eine immunhistochemische Färbemethode, die es erlaubt CD97 in Paraffin-eingebetteten humanen kolorektalen Geweben darzustellen. CD97 wird in allen Schnitten des kolorektalen Normalgewebes exprimiert. Sowohl CD97 als auch β-catenin sind dabei vorwiegend in den lateralen Zellkontakten aber auch im Zytoplasma der Zellen lokalisiert. Die Färbescores von CD97 und β-catenin in den lateralen Zellkontakten der normalen Enterozyten korrelieren signifikant miteinander. In kolorektalen Karzinomen verschwinden dann beide Moleküle simultan aus diesen lateralen Zellkontakten. Während β-catenin daraufhin im Zytoplasma und den Zellkernen der Karzinomzellen erscheint, ist die neu auftretende verstärkte Expression von CD97 auf das Zytoplasma der Karzinomzellen beschränkt. Dieses simultane Auftreten von CD97 im Zytoplasma und von β-catenin im Zellkern maligner kolorektaler Zellen korreliert mit dem Auftreten von scattered Tumorzellen. Die scattered Tumorzellen, auch als tumor buds bezeichnet, besitzen hypo-proliferative und apoptotische Eigenschaften. Diese scattered Tumorzellen an der Invasionsfront der kolorektalen Karzinome unseres Kollektivs exprimieren CD97 jedoch nicht stärker als Zellen im Karzinomzentrum. β-catenin hingegen wird in diesen scattered Tumorzellen vermehrt im Zytoplasma und in den Zellkernen exprimiert. Die Unterschiede der Färbeergebnisse im Vergleich zur Arbeit von Steinert et al. sind zum einen auf die Verwendung von Paraffin- statt Kryostat-Schnitten in unserer Studie und zum anderen auf die Nutzung verschiedener Antikörper gegen CD97, die unterschiedliche Epitope erkennen, zurückzuführen. Wir konnten einen Expressionsgradienten von CD97 entlang der Krypt-Villus-Achse, mit starker Expression im Kryptenbereich und schwächerer Expression in apikalen Bereichen, zeigen. Passend dazu wird nicht-phosphoryliertes membrangebundenes β-catenin in Kryptengrund-nahen Enterozyten stärker exprimiert. Dies ist ein weiterer Hinweis auf eine wahrscheinliche Interaktion von CD97 und nicht-phosphoryliertem membrangebundenem β-catenin. Ebenfalls passend zum hier gezeigten Expressionsgradienten von CD97 entlang der Krypt-Villus-Achse und der Regeneration der Enterozyten aus Kryptengrund-nahen undifferenzierten intestinalen Stammzellen konnte zuletzt gezeigt werden, dass der Vorgang der Apoptose durch CD97 inhibiert wird. Hier konnten wir nachweisen, dass in weiter luminal gelegenen Enterozyten die Expression von CD97 abnimmt. Diese Beobachtung harmoniert mit der Tatsache, dass apoptotische Zelluntergänge, im Sinne der Homöostase der intestinalen Selbsterneuerung, in diesen Enterozyten zunehmen. Dieses apoptotische Verhalten von CD97 könnte eine wichtige Rolle beim Überleben von Tumorzellen spielen. Kürzlich konnten wir in unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass CD97 und β-catenin in den lateralen Zell-Zellkontakten miteinander interagieren. Passend dazu ko-immunpräzipitiert CD97 β-catenin in DLD-1-Zellen und transgenen (Tg-villin-CD97) Zellen und umgekehrt. Obwohl sich wie hier gezeigt die Expression von CD97 und β-catenin in den lateralen Zell-Zellkontakten simultan vermindert und es sich gleichzeitig eine parallele Zunahme der Expression von CD97 und β-catenin im Zytoplasma zeigt, kommt es zu keiner nachweisbaren Interaktion beider Moleküle im Zytoplasma. Passend dazu konnte auch nur in den lateralen Zellkontakten eine Kolokalisation beider Moleküle in der Immunfluoreszens gezeigt werden. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass CD97 weder die Lokalisation noch die Expression von β-catenin beeinflusst. Wie beschrieben stabilisiert CD97 die lateralen Zell-Zellkontakte im normalen Epithelgewebe. Im Gegensatz dazu steht die Funktion von CD97 in malignen Geweben. Die Expression von CD97 korreliert mit dem Vermögen von kolorektalen Tumorzelllinien zur Serum-induzierten Migration und Invasion. Die Serumkomponente Lysophosphatidsäure (LPS) induziert Zellmigration durch eine Dämpfung der LPS-Rezeptor Signaltransduktion über Gα12/13 und RhoA auf das Zytoskelett durch eine Interaktion mit CD97. Für diese durch CD97 verstärkte Zellmigration ist das vollständige CD97-Molekül notwendig. Wie unlängst gezeigt, verhindert die Verkürzung des CTF von CD97 ebenfalls die Interaktion von CD97 und β-catenin. Noch ist unklar, ob die beiden Funktionen von CD97, Zelladhäsion und Regulation der Migration von Tumorzellen, miteinander im Zusammenhang stehen. Die Reduktion von CD97 in den lateralen Zell-Zellkontakten führt zum Auftreten von CD97 im Zytoplasma. Interessanterweise konnte zuletzt in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass CD97 nach Zerstörung dieser Zell-Zellkontakte schneller im Zytoplasma erscheint als β-catenin. Dieser Fakt spricht mehr für eine Translokation als für eine Akkumulation bzw. Hinderung des Transports von CD97 zur Zellmembran in Tumorzellen. Es konnte gezeigt werden, dass nach dem Erscheinen von CD97 im Zytoplasma die Kolokalisation und somit auch die Interaktion mit β-catenin nicht mehr nachweisbar ist. Somit stimuliert CD97 nicht die β-catenin-abhängige TCF-vermittelte Aktivität von Transkriptionsfaktoren und es kommt nicht zur Aktivierung von Genen, die Proteine kodieren, welche u.a. die kolorektale Karzinogenese stimulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CD97 ein multifunktionales Protein ist, dass über eine Interaktion mit β-catenin in adherens junctions in normalen Epithelzellen die Zell-Zelladhäsion reguliert und andererseits über eine Interaktion mit dem LPS-Rezeptor eine wichtige Rolle in Signaltransduktionswegen in Karzinomzellen spielt.

Tumorigenesis is a multistep process, during which cells acquire a series of mutations that lead to unrestrained cell growth and proliferation, inhibition of cell differentiation, and evasion of cell death. Growing tumors stimulate angiogenesis, providing them with nutrients and oxygen. Ultimately, tumor cells invade the surrounding tissue and metastasize; a process responsible for about 90% of cancer-related deaths. Adhesion G protein-coupled receptors (aGPCRs) modulate the cellular processes closely related to tumor cell biology, such as adhesion and detachment, migration, polarity, and guidance. Soon after first being described, individual human aGPCRs were found to be involved in tumorigenesis. Twenty-five years ago, CD97/ADGRE5 was discovered to be induced in one of the most severe tumors, dedifferentiated anaplastic thyroid carcinoma. After decades of research, the time has come to review our knowledge of the presence and function of CD97 in cancer. In summary, CD97 is obviously induced or altered in many tumor entities; this has been shown consistently in nearly one hundred published studies. However, its high expression at circulating and tumor-infiltrating immune cells renders the systemic targeting of CD97 in tumors difficult.

Intestinal cylindrical growth peaks in mice a few weeks after birth, simultaneously with crypt fission activity. It nearly stops after weaning and cannot be reactivated later. Transgenic mice expressing Cd97/Adgre5 in the intestinal epithelium develop a mega-intestine with normal microscopic morphology in adult mice. Here, we demonstrate premature intestinal differentiation in Cd97/Adgre5 transgenic mice at both the cellular and molecular levels until postnatal day 14. Subsequently, the growth of the intestinal epithelium becomes activated and its maturation suppressed. These changes are paralleled by postnatal regulation of growth factors and by an increased expression of secretory cell markers, suggesting growth activation of non-epithelial tissue layers as the origin of enforced tissue growth. To understand postnatal intestinal growth mechanistically, we study epithelial fate decisions during this period with the use of a 3D individual cell-based computer model. In the model, the expansion of the intestinal stem cell (SC) population, a prerequisite for crypt fission, is largely independent of the tissue growth rate and is therefore not spontaneously adaptive. Accordingly, the model suggests that, besides the growth activation of non-epithelial tissue layers, the formation of a mega-intestine requires a released growth control in the epithelium, enabling accelerated SC expansion. The similar intestinal morphology in Cd97/Adgre5 transgenic and wild type mice indicates a synchronization of tissue growth and SC expansion, likely by a crypt density-controlled contact inhibition of growth of intestinal SC proliferation. The formation of a mega-intestine with normal microscopic morphology turns out to originate in changes of autonomous and conditional specification of the intestinal cell fate induced by the activation of Cd97/Adgre5.