Bien que la compréhension des régulateurs du cycle cellulaire s'est considérablement améliorée ces dernières années, la régulation du cycle cellulaire en réponse à des signaux environnementaux tels que les reste peu connue. Un stress au niveau de l'ADN est un stress ubiquitaire pour tous les organismes. Celui-ci peut-être causé soit par une source exogène soit par une source interne comme lors de la séparation des chromatides ou bien celle des brins d'ADN pendant la réplication. La régulation post-traductionnelle des kinases de type cdk1 au travers de la phosphorylation inhibitrice des kinases de type Wee1 sur le résidu Tyr15, ou à des positions analogues, de la boucle appelée P-loop a été dommages à l'ADN décrite comme étant le mécanisme pivot conduisant à l'arrêt du cycle cellulaire après un dommage à l'ADN chez la levure et les animaux. Cependant, il semblerait que ce mécanisme ne soit pas conservé chez les plantes comme le suggère l'hypersensibilité des dephospho-mutants de CDKA;1. La première partie de cette étude se concentre sur la possible régulation de CDKA;1 au travers de la phosphorylation de la T-loop en réponse à un stress lié à la réplication chez Arabidopsis. La phosphorylation du résidu T161 et de ses analogues agit positivement sur la boucle appelée T-loop de la kinase, ce qui est nécessaire pour avoir une activité CDK complète, et sert dans la reconnaissance du substrat. De manière remarquable, un mutant qui imite la phosphorylation de la T-loop est quasiment résistant à 100% à l'hydroxyurée (HU) et peut partiellement compenser l'hypersensibilité des mutants wee1 à l'HU. La phosphorylation de la T-loop est catalysée par les kinases activatrices des CDK (CAKs) qui sont elles-mêmes des CDKs comportant des régions P- et T-loop particulières. La preuve a été obtenue que WEE1 inhibe les Cyclin Dependent Kinases de type D ce qui va résulter en une activité réduite de CDKA;1 et ainsi déclencher l'arrêt du cycle cellulaire après un dommage causé à l'ADN. Il a été démontré que les mutants qui imitent la déphosphorylation de CDKD2 et 3, ne pouvant pas être inhibés par WEE1 montrent une hypersensibilité à l'HU mais pas à la bléomycine. Cela suggère donc de leur implication dans l'arrêt du cycle cellulaire spécifiquement après un stress de réplication. L'hypersensibilité du double mutant cdk2cdk3 aux stress de réplication permet de penser qu'une activation de CDKA;1 par l'intermédiaire de CDKD;1 et de manière indépendante de WEE1 est possible. L'hypothèse d'un rôle essentiel desCDKDs dans la stabilisation de l'activité kinase de CDKA;1 pendant le développement des gamètes a été émise. En effet, des défauts, observés chez les mutants cdka;1VFcdkd pendant la méiose mais pas chez les mutants cdka;1VF souligne l'importance de la phosphorylation de la T-loop de CDKA;1 dans le bon déroulement de la division méiotique. Dans la seconde partie de cette étude, l'interaction entre le cycle cellulaire et le cercle circadien a été étudiée. Il a été suggéré qu'une boucle rétroactive existait, et dans laquelle le cycle cellulaire pouvait réguler le cercle circadien. En effet, on a montré grâce à une expérience de microarray réalisée sur des mutants holomorphiques CDKA;1, que de nombreux gènes circadiens sont dérégulés. Ainsi, dans le cadre de l'étude du cercle circadien, la division cellulaire de mutants cdka;1 ainsi que de plantes sauvages a été étudiée en conditions de croissance diurnes. Le temps de division altéré observé chez les mutants supporte l'idée que la régulation du cycle cellulaire se fait également d'une manière dépendante du temps. Les profils d'expression de gènes du cycle circadien chez les mutants cdka;1 ont été analysés par essai luciférase. La période et l'intensité d'expression observées chez ce mutant en comparaison du sauvage étant altérée, ceci suggère que l'activité de CDKA;1 a un effet direct ou indirect sur ces gènes. / Even though the understanding of cell-cycle regulators in plants has tremendously increased over the last years, still little is known about cell-cycle regulation in response to environmental signals like DNA damage. A ubiquitous stress for any organism is DNA stress that can either be caused by exogenous sources or internal processes like chromatid separation or DNA strands separation during replication. The posttranslational regulation of Cdk1-type kinases through inhibitory phosphorylation through Wee1-type kinases in the so-called P-loop at the residue Tyr15 or the analogous positions has been found to be of pivotal importance for the arrest of the cell cycle after DNA damage in yeast and animals. But this mechanism is apparently not conserved in plants, as suggested by the hypersensitivity analysis of CDKA;1 dephospho-mutants. The first half of this study focus on possible regulation of CDKA;1 through T-loop phosphorylation upon replication stress in Arabidopsis. The positively acting phosphorylation on T161 and analogous residues in the so-called T-loop of the kinase that is required for full CDK activity and serves in substrate recognition. Remarkably, a T-loop phospho-mimicry mutant of CDKA;1, was almost 100% resistant to hydroxyurea (HU) and can partially rescue the hypersensitivity of wee1 to HU. T-loop phosphorylation is catalyzed by CDK activating kinases (CAKs) that are themselves CDKs with typical P- and T-loop regions. Evidence is obtained that WEE1 might inhibit CDKDs (Cdk-activating kinases) that would subsequently result in reduced CDKA;1 activity, and thus, cell-cycle arrest upon DNA damage. It is revealed that dephospho-mimicry mutants of CDKD;2 and 3, which can not be inhibited through WEE1 showed hypersensitivity to HU and not to bleomycin, suggesting their involvement in cell-cycle arrest specifically upon replication stress. Hypersensitivity of cdkd;2cdkd;3 to replication stress suggested possible activation of CDKA;1 through CDKD;1 independent of WEE1. An essential role of CDKDs in stabilizing CDKA;1 kinase activity during gamete development has been suggested. Defects observed in cdka;1VFcdkd mutants during meiosis but not in cdka;1VF mutants emphasize on importance of CDKA;1 T-loop phosphorylation for appropriate meiotic division.In second part of this study interaction between cell-cycle and circadian has been studied. A feedback loop in which the cell cycle could potentially regulate the circadian clock was suggested as a number of circadian genes were found to be deregulated in a microarray experiment with holomorphic CDKA;1 mutants. Thus the circadian gating of cell division of wildtype and cdka;1 mutants was studied under diurnal growth conditions. The altered time of division observed in cell-cycle mutants supported the idea of cell-cycle regulation in a time dependent manner. Expression profile of clock genes were analyzed in cdka;1 mutants through luciferase assay system. An altered period and intensity of expression observed in these mutants compared to wild type plants suggested a direct or indirect effect of CDKA;1 activity on clock gene expression.

Dans ce travail, j'ai utilisé les trichomes (poils foliaires) d'Arabidopsis comme modèle pour étudier la différenciation cellulaire et l'endoréplication. Mon travail a révélé que les cycles d’endoréplication chez Arabidopsis étaient contrôlés par les protéines inhibitrices CYCLIN DEPENDENT KINASE (CDK), elles-mêmes contrôlées par dégradation via l'action de complexes SKP-CULLIN-F-BOX (SCF). Ceci crée vraisemblablement des niveaux variables d'activité de CDK, qui sont nécessaires pour la progression répétée au travers des phases de synthèse d'ADN dans les cellules entrées en endoréplication. Cependant, la sur-expression des inhibiteurs des CDK ne bloque pas seulement l'endoréplication mais résulte aussi dans la dédifférenciation des cellules précurseurs des trichomes. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des allèles faibles de perte de fonction pour CDKA;1, la principale CDK chez Arabidopsis, laissant émerger la notion que l'endoréplication est nécessaire à la maintenance du devenir des cellules. De manière surprenante, la dédifférenciation peut être au moins partiellement réprimée quand RBR1, l'homologue chez Arabidopsis de la protéine animale suppresseur de tumeur RETINOBLASTOMA (Rb), est mutée de manière concomitante. De même, une mutation de la methyltransferase CURLY LEAF, composante du complexe PRC2, rétablit le défaut de maintenance des trichomes chez les mutants faibles pour CDKA;1. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que le complexe PRC2 et la protéine RBR1 établissent, au niveau tissulaire, un seuil pour la différenciation cellulaire au cours du développement de l'épiderme chez Arabidopsis. / Cell differentiation is often linked with a switch from a mitotic to an endoreplication cycle, in which cells re-replicate their DNA without cell division. The molecular regulation of endoreplication and its biological fonction are only poorly understood. Here, I have used trichomes (leaf hairs) of Arabidopsis as a model to study cell differentiation and endoreplication. My work revealed that endoreplication cycles in Arabidopsis are controlled by cyclin dependent kinase (CDK) inhibitor proteins, which in turn are subject to protein degradation mediated by the action of SKP-CULLIN-F-BOX (SCF) complexes. This presumably creates oscillating levels of CDK activity, which are needed for repeated progression through DNA synthesis phases in endoreplicating cells. However, overexpression of CDK inhibitors did not only block endoreplication but also resulted in the dedifferentiation of trichome precursor cells. Similar observations were made with weak- loss-of-function alleles for the major CDK in Arabidopsis, CDKA;1, giving rise to the notion that endoreplication is required for cell fate maintenance. Trichome dedifferentiation was enhanced when trichome fate regulators were mutated. Surprisingly, the dedifferentiation could be at least partially repressed when RBR1, the Arabidopsis homolog of the animal tumor suppressor protein Retinoblastoma (Rb), was concomitantly mutated. Similarly, a mutation in PRCZ-methyltransfcrase CURLY LEAF (CLF) rescued the trichome maintenance defect of weak CDKA;1 mutants. Taken together, this suggests that PRC2 and RBR1 set a dynamic tissue threshold for cell differentiation during epidermis development in Arabidopsis.

Even though the understanding of cell-cycle regulators in plants has tremendously increased over the last years, still little is known about cell-cycle regulation in response to environmental signals like DNA damage. A ubiquitous stress for any organism is DNA stress that can either be caused by exogenous sources or internal processes like chromatid separation or DNA strands separation during replication. The posttranslational regulation of Cdk1-type kinases through inhibitory phosphorylation through Wee1-type kinases in the so-called P-loop at the residue Tyr15 or the analogous positions has been found to be of pivotal importance for the arrest of the cell cycle after DNA damage in yeast and animals. But this mechanism is apparently not conserved in plants, as suggested by the hypersensitivity analysis of CDKA;1 dephospho-mutants. The first half of this study focus on possible regulation of CDKA;1 through T-loop phosphorylation upon replication stress in Arabidopsis. The positively acting phosphorylation on T161 and analogous residues in the so-called T-loop of the kinase that is required for full CDK activity and serves in substrate recognition. Remarkably, a T-loop phospho-mimicry mutant of CDKA;1, was almost 100% resistant to hydroxyurea (HU) and can partially rescue the hypersensitivity of wee1 to HU. T-loop phosphorylation is catalyzed by CDK activating kinases (CAKs) that are themselves CDKs with typical P- and T-loop regions. Evidence is obtained that WEE1 might inhibit CDKDs (Cdk-activating kinases) that would subsequently result in reduced CDKA;1 activity, and thus, cell-cycle arrest upon DNA damage. It is revealed that dephospho-mimicry mutants of CDKD;2 and 3, which can not be inhibited through WEE1 showed hypersensitivity to HU and not to bleomycin, suggesting their involvement in cell-cycle arrest specifically upon replication stress. Hypersensitivity of cdkd;2cdkd;3 to replication stress suggested possible activation of CDKA;1 through CDKD;1 independent of WEE1. An essential role of CDKDs in stabilizing CDKA;1 kinase activity during gamete development has been suggested. Defects observed in cdka;1VFcdkd mutants during meiosis but not in cdka;1VF mutants emphasize on importance of CDKA;1 T-loop phosphorylation for appropriate meiotic division.In second part of this study interaction between cell-cycle and circadian has been studied. A feedback loop in which the cell cycle could potentially regulate the circadian clock was suggested as a number of circadian genes were found to be deregulated in a microarray experiment with holomorphic CDKA;1 mutants. Thus the circadian gating of cell division of wildtype and cdka;1 mutants was studied under diurnal growth conditions. The altered time of division observed in cell-cycle mutants supported the idea of cell-cycle regulation in a time dependent manner. Expression profile of clock genes were analyzed in cdka;1 mutants through luciferase assay system. An altered period and intensity of expression observed in these mutants compared to wild type plants suggested a direct or indirect effect of CDKA;1 activity on clock gene expression.