Der Keratokonus ist eine Erkrankung, bei der sich die Hornhaut des Auges, auch als Cornea bezeichnet, fortschreitend ausdünnt. Dies führt zu einer Formveränderung und damit zu Einschränkungen des Sehvermögens. Bei den Betroffenen tritt häufig Kurzsichtigkeit auf, die aufgrund der unregelmäßigen Wölbung der Cornea nur schwer durch Sehhilfen ausgeglichen werden kann. In schweren Fällen ist eine Hornhauttransplantation erforderlich. Die Ursachen der Erkrankung sowie der Einfluss äußerer Faktoren auf den Krankheitsverlauf sind bislang nicht hinreichend erforscht, sodass eine Prognose schwierig ist. Quervernetzungen (Crosslinks) im Kollagen spielen eine entscheidende Rolle für die optischen und biomechanischen Eigenschaften der Cornea. Therapeutische Ansätze zielen darauf ab, zusätzliche Crosslinks zu erzeugen und damit das Gewebe zu stabilisieren. Die photochemische Vernetzung der Cornea (engl. Corneal Crosslinking, CXL) mit Riboflavin und UV-Licht wurde entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften der Cornea zu verbessern und dem Fortschreiten des Keratokonus entgegenzuwirken. Es wird angenommen, dass die UV-Bestrahlung Riboflavin aktiviert, welches daraufhin Sauerstoffmoleküle in der Cornea in hochreaktive Formen umwandelt. Diese reaktiven Sauerstoffspezies initiieren chemische Reaktionen, welche zur Bildung neuer Crosslinks zwischen den Kollagenfasern führen. Obgleich makroskopische Effekte wie eine erhöhte Gewebesteifigkeit, eine erhöhte Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau sowie Veränderungen in der Fibrillenarchitektur dokumentiert sind, existieren nur wenige Studien, welche die CXL auf molekularer Ebene untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit werden die molekularen Mechanismen der CXL in der Cornea mit schwingungsspektroskopischen Methoden wie Infrarot- (IR) und Raman-Spektroskopie untersucht. Diese Methoden bieten eine hohe Sensitivität gegenüber kleinsten molekularen Veränderungen und ermöglichen die Untersuchung von Gewebe in nahezu nativem Zustand. Die Experimente wurden an vom Schwein stammenden Corneae durchgeführt, da diese über eine große Ähnlichkeit mit der humanen Cornea verfügen. Zum Nachweis der kovalenten Bindungen wurden IR-Imaging-Messungen an Dünnschnittpräparaten und ATR-spektroskopische Experimente (engl. attenuated total reflection) durchgeführt. Letztere ermöglichten die oberflächennahe Detektion molekularer Veränderungen in situ, d. h. zeitgleich mit der UV-Bestrahlung. Die Messungen zeigen gemeinsame spektrale Veränderungen, insbesondere im Amid-I- und Amid-II-Bereich, sowie eine Zunahme der C–O-Schwingungen. Aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit gesammelten ATR-spektroskopischen Daten kann insgesamt davon ausgegangen werden, dass eine Kombination mehrerer Effekte zu einer Verstärkung der Biomechanik durch die CXL führt. Die ATR-Spektren liefern keine eindeutigen Hinweise für die Entstehung neuer kovalenter Bindungen, die durch einen einheitlichen Reaktionsmechanismus (z. B. Addition von Stickstoffbasen an Carbonylgruppen, Vernetzung via Histidinseitenketten) erklärt werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Raman-Spektroskopie als ergänzende Methode zur Untersuchung der CXL eingesetzt. Durch den zusätzlichen Einsatz der SERS-Messtechnik (engl. surface-enhanced Raman spectroscopy) sollten gezielt oberflächennahe Reaktionsprodukte, die durch die CXL gebildet werden, hervorgehoben werden. Da SERS spezielle Strukturen für die Oberflächenverstärkung benötigt, wurden Cornea-Proben nach der CXL-Behandlung mit Silber bedampft und anschließend untersucht. Die systematische Auswertung der Messungen zeigte vor allem Veränderungen in den Bereichen, die mit Prolin und Hydroxyprolin sowie CH2/CH3-Gruppen assoziiert sind. Darüber hinaus zeigen die Untersuchungen, dass Vernetzungssignale bereits ohne Bestrahlung auftreten, die Vernetzungsbehandlung jedoch nicht bei jeder individuellen Behandlung bzw. Cornea zu einem nachweisbaren Effekt führt. Die Ergebnisse werfen ein neues Licht auf die Funktionsweise der CXL und erfordern eine Neubewertung bisheriger Annahmen über mögliche Reaktionsmechanismen. Aufgrund fehlender Hinweise können kovalente Bindungen als primäre Quelle für die Erhöhung der Stabilität der Cornea ausgeschlossen werden. Die Stabilisierung der Cornea durch die CXL lässt sich vermutlich auf eine Kombination von physikalischen, chemischen und strukturellen Veränderungen zurückführen. Es ist davon auszugehen, dass nicht-kovalente Interaktionen wie Dipolwechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Kollagenmolekülen einen weitaus größeren Beitrag zur erhöhten biomechanischen Stabilität der Cornea leisten als bisher angenommen.:1. Einleitung 1.1 Hintergrund und Motivation 1.2 Zielsetzung 2. Cornea und Keratokonus 2.1 Aufbau und Funktion der Cornea 2.2 Zusammensetzung der Cornea 2.3 Molekularer Aufbau des Kollagens in der Cornea 2.4 Kollagen-Crosslinks 2.4.1 Enzymatische Crosslinks durch Lysyloxidase 2.4.2 Nicht-enzymatische Crosslinks durch Glykierung 2.5 Keratokonus 3. Therapie CXL 3.1 Die Funktion von Riboflavin, UV-Licht und Sauerstoff 3.2 Methoden zur Untersuchung der CXL 3.3 Stand der Forschung zur Untersuchung der CXL 4. Material und Methoden 4.1 Präparation der untersuchten Proben 4.1.1 Präparation der Cornea-Flaps 4.1.2 Präparation der Dünnschnittpräparate 4.2 CXL nach dem Dresden-Protokoll 4.3 Vernetzungsbehandlung mit Glutaraldehyd 4.4 Chemikalien 4.5 Transmissions-IR-Mikrospektroskopie 4.6 ATR-Spektroskopie 4.7 Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) 4.8 Konfokale Raman-Messungen 4.9 Datenvorbehandlung 5. Ergebnisse und Diskussion 5.1 IR-mikroskopisches Imaging der Cornea 5.2 ATR-spektroskopische Untersuchung der CXL 5.2.1 Messungen der CXL unter in-situ-äquivalenten Bedingungen 5.2.2 Entwicklung eines Aufbaus zur ATR-Messung mit Sauerstoffzufuhr 5.2.3 Ergebnisse der ATR-Messungen unter erhöhter Sauerstoffzufuhr 5.2.4 Fazit 5.3 Raman-spektroskopische Untersuchung der CXL 5.3.1 Raman-Spektrum der Cornea 5.3.2 Raman-Messungen der CXL an Cornea-Flaps 5.3.3 Raman-Messungen der CXL von ganzen Augen 5.3.4 Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie 5.3.5 Abscheidung der Silberschicht 5.3.6 Ergebnisse der SERS-Experimente 5.3.7 Raman-Messungen der Vernetzung mit Glutaraldehyd 5.3.8 Fazit 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang Veröffentlichungen Versicherung

Le cross-linking du collagène cornéen (CXL) est une cornéoplastie mini-invasive reposant surun concept biomécanique difficile à objectiver physiquement et dont les preuves del’efficacité thérapeutique sont d’interprétation complexe. Les principes, les nuances et lesrésultats du CXL sont colligés dans cette thèse afin de valider l’intérêt du modèleexpérimental choisi pour tester la pertinence de notre travail de recherche sur l’élastographiecornéenne par ondes de cisaillement.Notre cheminement expérimental a abouti au choix du modèle de CXL trans-épithélial (TCXL)assisté par iontophorèse (I-CXL), réalisé in vivo, sur oeil de lapin. Les mesuresélastographiques obtenues après euthanasie ont ainsi pu démontrer une modificationsignificative du profil d’élasticité de la cornée après CXL, testé successivement de manièredynamique et statique.Nos résultats confirment donc l’efficacité biomécanique instantanée du I-CXL et donnent uneidée plus précise de la valeur de la photo-polymérisation du tissu cornéen isolée desphénomènes liés à la cicatrisation. Les enjeux technologiques de l’élastographe cornéen paranalyse des ondes de cisaillement ont pu être définis afin de développer une stratégie de miseen oeuvre d’un système pertinent pour la pratique clinique. / Corneal collagen cross-linking (CXL) is a kind of minimaly invasive corneoplasty mainlybased on a biomechanical concept, which is very difficult to measure physically, and whichthe therapeutic efficacy understanding is complex.Principles, different protocols and resultsare summarized in this thesis in order to illustrate the usefulness of the experimental modelchosen in our experimentations about elastographic corneal shear wave imaging.The pathway of our experimental work have led to the choice of trans-epithelial CXL (TCXL)assisted by iontophoresis (I-CXL), performed in vivo, on rabbits eyes. Elastographicmeasurements we obtained after animals euthanasia have shown a significant change of thecorneal elasticity profile after CXL, successively tested in a dynamic and in a static fashion.Our results do confirm the biomechanical efficacy of the I-CXL procedure and give a moreprecise idea of the sole photo-polymerization effect by avoiding any confounding healingconcern. Technological issues for corneal elastography with shear wave imaging have beenraised in this thesis to develop a realistic strategy for the launch of a clinically useful device.

Les objectifs environnementaux (COP21) visant à réduire les émissions de gaz à effet de serre et l'impact de l'industrie sur la nature, font face au défi de la demande croissante d'énergie et de produits. Les procédés chimiques sont les premiers en cause lorsqu’ils mettent en œuvre des solvants. L'ingénierie des solvants est une solution innovante qui vise à trouver des milieux alternatifs bénins possédant les propriétés de solvant adaptés pour chaque étape du procédé.Dans cette perspective, nous avons étudié les Liquides expansés par un gaz (LEGs), qui sont desliquides dont le volume augmente sous l’effet d’un gaz dissous sous pression. En particulier, le CO2 peut être utilisé comme agent d'expansion pour obtenir des liquides expansés par du CO2(LECs), combinant les avantages du CO2 et du solvant. La phase expansée peut contenir des concentrations élevées de CO2, jusqu'à 80%, selon le solvant, ce qui conduit à une réduction du besoin du solvant organique, mais aussi à des changements des propriétés physicochimiques et de transport de la nouvelle phase expansée. On peut de plus moduler ces propriétés par la pression et la température, d'une manière réversible, et améliorer la séparation des produits. Dans cette étude, différents solvants biosourcés ont été utilisés pour obtenir des systèmes expansés par du CO2, tels que les acétates d'alkyle, les carbonates organiques, les méthoxybenzènes, etc.La connaissance des équilibres de phase, des propriétés de solvatation et de transport est essentielle pour concevoir des processus qui exploitent le comportement particulier de ces systèmes biphasiques. Deux approches principales ont été utilisées pour caractériser ces systèmes. Dans un premier temps, des mesures ont été effectuées dans une cellule à haute pression et à volume variable pour évaluer la polarité au travers du paramètre Kamlet-Taft (KT) *(dipolarité / polarisabilité) dans les solvants expansés par du CO2 sous des pressions allant jusqu'à 30 MPa. La technique utilisée a été la spectroscopie UV-Vis suivant le déplacement hypsochromique du Rouge de Nile, une sonde solvatochromique déjà utilisée pour obtenir les paramètres KT dans des solvants purs. De plus, des mesures d'équilibre vapeur-liquide (ELV) ont été effectuées pour obtenir la composition de la phase expansée à différentes pressions et températures afin de comprendre la solvatation du CO2 dans les solvants organiques et de fournir des informations manquantes dans la littérature. En deuxième lieu, dans une approche plus théorique, les données ELV ont été utilisées pour calculer numériquement d'autres propriétés telles que la densité et la viscosité. Des équations d'état et des simulations par dynamique moléculaire (DM) ont été utilisées ; ces dernières donnant de meilleurs résultats dans un mode prédictif de la masse volumique et permettant de suivre les positions moléculaires au cours du temps, qui peut être liée à de nombreuses propriétés, y compris la viscosité étudiée ici. Ces calculs ont été effectués en utilisant un champ de force de type Amber adapté. Les résultats obtenus dans l’ensemble complètent les données de la littérature existante et apportent de nouvelles informations sur les propriétés des LEGs. Par exemple, le comportement non linéaire de l'expansion volumétrique, vérifié après les déterminations de masse volumique sur les simulations DM à l'équilibre, est une clé dans la compréhension des interactions soluté-solvant ; ainsi que les valeurs KT * obtenues qui confirment la large gamme de polarité couverte par ces systèmes.Enfin, certains systèmes expansés par du CO2 ont été utilisés pour produire des nanoparticules de TiO2 pour panneaux solaires, améliorant leur surface spécifique et donc leur efficacité en tant que semi-conducteurs ; et d’autres ont été appliqués à un processus d'activation enzymatique entraînant une augmentation significative du taux de conversion / Over the last two decades, environmental goals (COP21) aiming to reduce Greenhouse Gasemissions and industry impact on nature, face the challenge of the increasing demand for energyand products. Chemical processes are in the center of the scene because of the use of solvents.Solvent engineering is the strategy to find alternative benign media for different applications, oreven to adapt solvent properties to respond each stage of a process, and represents aninteresting alternative to propose innovative solutions to industrial problems. With this perspective,Gas-expanded Liquids (GXLs), which are liquids whose volume is expanded by a pressurizeddissolved gas, represent a very promising tool yet to be implemented in the industry. CO2 can beused as the expansion agent to obtain CO2-expanded Liquids (CXLs), combining both the CO2and the solvent’s advantages. The expanded phase can contain high concentrations of CO2 (up to80%, depending on the solvent), which can lead not only to an effective reduction of the need foran organic solvent, but also to changes in the physicochemical and transport properties of the newexpanded phase, that can now be tuned by pressure and temperature in a reversible fashion, andimprove product separation. In this study, different bio-sourced solvents have been used to obtainCO2-expanded systems, such as alkyl acetates, organic carbonates, methoxybenzenes, etc.Knowledge of phase equilibria, solvation and transport properties are fundamental to designprocesses that exploit the peculiar behavior of these two-phase systems. Two main approacheshave been used to characterize these systems. At first, physical determinations were carried outin a high pressure, variable volume view cell, to measure polarity through Kamlet-Taft (KT) *parameter (dipolarity/polarizability) in the selected CO2-expanded solvents under pressures up to30 MPa. The technique used was UV-Vis spectroscopy following the hypsochromic shift of NileRed, a solvatochromic probe that has already been used to obtain KT parameters in neat solvents.Also, Vapour-Liquid Equilibria (VLE) measurements were performed to obtain the expanded phasecomposition at different pressures and temperatures as an attempt to understand CO2 solvation inorganic solvents and to provide missing information in literature. In second place, in a moretheoretical approach, VLE data was used to numerically calculate other properties such as densityand viscosity. Both Equations of State (EoS) and Molecular Dynamics (MD) simulations wereused, giving this last technique better results in a pure predictive mode like in the case of densitydeterminations; in addition to the ability to trace molecular positions over time, which can berelated to many properties, including the here studied viscosity. These calculations were carriedout using an Extended AMBER potential, which led to fairly good results compared to specific-usepotentials available in literature, with the advantage of the general-use possibility. From all thesedeterminations, different conclusions were drawn both agreeing with existing and providing newdata to the literature surrounding this promising subject. For instance, the generally non-linearbehavior of volumetric expansion, verified after density determinations on equilibrium MDsimulations, that is key to evaluate solute-solvent interactions; as well as the KT * values obtainedthat confirm the large range of polarity covered by these systems. Finally, some CO2-expandedsystems were used to produce TiO2 nanoparticles for solar panels improving their specific surfaceand therefore their efficiency as semiconductors; and some others applied to an enzyme activationprocess leading to significant enhancement in conversion rate