published_or_final_version / Microbiology / Master / Master of Medical Sciences

published_or_final_version / Obstetrics and Gynaecology / Doctoral / Doctor of Philosophy

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La première étape de la réponse immune est réalisée par des cellules "sentinelles": les cellules dendritiques (DC). Elles ont à la fois un rôle de surveillance de l’organisme et une capacité unique à alerter les lymphocytes T naïfs. Leur efficacité à présenter des antigènes rencontrés en périphérie à des lymphocytes résidant dans les organes lymphoïdes résulte d’une spécialisation de fonction au cours du temps. A l’état immature, elles capturent et apprêtent les antigènes protéiques au niveau de divers organes, mais ont une faible capacité stimulatrice. Par contre, à l’état mature, elles perdent la capacité de capturer des antigènes, acquièrent celle de sensibiliser des lymphocytes T et migrent vers les organes lymphoïdes. Cependant, des DC immatures sont présentes dans les organes lymphoïdes en contact avec les cellules T laissant supposer qu’elles pourraient jouer d’autres rôles que celui de sentinelles. L’immunisation de souris par injection de DC immatures ou matures nous a permis de mettre en évidence un rôle potentiel des DC immatures. Ces dernières induisent en effet une prolifération des cellules T CD4 et leur différenciation en cellules de mémoire en absence de réponse primaire effectrice (absence d’IFN-) suite à une production d'IL-10. La différenciation de cellules de mémoire par des DC immatures pourrait être un mécanisme permettant d’alerter le système immunitaire lors d’infections limitées ou dans un contexte peu activateur (en présence d'IL-10) ne nécessitant pas l’induction de réponse immune immédiate. De plus, les DC spléniques immatures et matures semblent migrer des sites d’immunisation vers la zone des cellules T des ganglions drainants dans les mêmes proportions. La migration est un mécanisme impliquant les DC injectées mais aussi une activité physiologique des souris immunisées: aucune migration n’est observée chez des souris anesthésiées. En outre, les résultats obtenus au cours de cette étude suggèrent qu’un transfert de membranes pourrait avoir lieu entre les DC injectées et celles de l’organisme receveur. Ce mécanisme permettrait d’amplifier le signal antigénique exposé par les DC migrant de la périphérie.

Résumé Par leur capacité de moduler la réponse immune, les rayons ultraviolets (UV) ont trouvé des applications dans le traitement de diverses maladies immunes. Leurs mécanismes d’action sont encore incomplètement définis. L’un d’entre eux comporte l’induction de cytokines immunosuppressives et antiinflammatoires. Ce processus peut être provoqué par la phagocytose de corps apoptotiques, l’apoptose constituant une des lésions cellulaires élémentaires provoquée par les UV. Le but de notre travail a été de préciser les cytokines impliquées dans la réponse aux UV, de définir certains mécanismes de leur production et de la potentialiser par des agents pharmacologiques. Notre étude a comporté deux parties: (1) l’une in vivo chez des malades souffrant de GVH chronique résistante aux traitements conventionnels et traités par photochémothérapie extracorporelle, procédure dans laquelle les leucocytes du malades, prélevés par leucaphérèse puis traités par un psoralène et par UVA lui sont finalement réinjectés; (2) l’autre in vitro où des PBMC de volontaires sains ont été irradiés avec 10J/m2 de rayons UVC qui ne nécessitent pas de photosensibilisation par psoralène. Deux cytokines, l’IL-10 et l’IL-1Ra ont été évaluées par RT-PCR dans un système de coculture autologue entre PBMC et PBL rendus apoptotiques par irradiation. L’évolution du processus apoptotique déclenché par les UV a été mesurée par cytomètrie de flux. Celui-ci concernait essentiellement les lymphocytes, les monocytes/macrophages révélant une résistance relative à l’apoptose, il était progressif, culminant entre la 24ème et la 48ème heures. Lors des cocultures entre PBMC et PBL irradiés, un accroissement très significatif du nombre de copies d’ARNm, concernant les deux cytokines étudiées, l’IL-10 et l’IL-1Ra était observé. L’induction d’IL-1Ra était dépendante de l’IL-10. Une préactivation par du LPS était nécessaire pour la révélation du phénomène. Ensuite, nous avons évalué l’implication sur la synthèse de cytokines du processus de phagocytose de lymphocytes rendus apoptotiques par irradiation UV et divers moyens pharmacologiques pour la potentialiser. La préincubation du matériel irradié pendant une nuit (16h) à 37° dans le but d’accroître la proportion de cellules en voie d’apoptose avant mise en contact avec les PBMC a permis d’obtenir un accroissement très marqué sans nécessiter de LPS, portant essentiellement sur la production d’IL-1Ra tant sur l’ARNm que la protéine secrétée; l’induction d’IL-10 était cette fois négligeable. L’implication de la phagocytose dans le processus a été démontrée par deux agents bloquants (a) l’anticorps monoclonal anti-CD36 (corécepteur avec l’intégrine V3 de la thrombospondine) activant la production d’IL-1Ra et mimant par ce fait le processus phagocytaire et (b) la cytochalasine E la bloquant. Nous avons testé diverses substances pharmacologiques dont l’action activatrice de l’IL-1Ra est connue, en l’occurrence les immunoglobulines G à usage IV (IgIV) et le GM-CSF. L’adjonction d’IgIV (1mg/ml) ou GM-CSF (10 ng/ml) une heure après le début de la coculture exerce sur la sécrétion d’IL-1Ra un effet additif avec les UV. Selon la concentration utilisée, les IgIV peuvent agir par deux mécanismes. Outre l’effet d’activation macrophagique lié au récepteur Fc, nous avons démontré à haute concentration un mécanisme nouveau, du à la présence dans les IgIV d’anticorps naturels antiFas induisant l’apoptose des lymphocytes. Une incubation de 16h des lymphocytes avec 25 mg/ml d’IgIV avant mise en culture provoque outre une apoptose importante une augmentation significative de l’IL-1Ra. Dans ce cas, le processus est indépendant du fragment Fc, la fraction F(ab’)2 gardant la capacité d’induire l’apoptose et de provoquer la production d’IL-1Ra. En conclusion, nous avons mis en évidence un mécanisme nouveau d’induction d’IL-1Ra, non décrit auparavant et défini diverses modalités qui pourraient accroître sa production: - L’incubation de 16h du matériel irradié permet d’orienter le système en accroissant la production de l’IL-1Ra sans que la production de l’IL-10 soit modifiée et sans nécessiter de LPS. Nous attribuons cet effet à l’accroissement du processus apoptotique qui en résulte. - Nous avons potentialisé la production d’IL-1Ra par deux agents pharmacologiques, le GM-CSF et les IgIV. Les mécanismes d’action des IgIV dépendent de la concentration utilisée. 1. Aux concentrations de l’ordre de 1mg/ml, les IgIV exercent, avec les UV un effet additif sur l’induction d’IL-1Ra par une action dépendant du fragment Fc. 2. Aux concentrations élevées de 25mg/ml, un effet apoptotique attribuable à l’action d’anticorps anti-Fas agonistes est observé. Une préincubation de 16h de lymphocytes avec cette concentration d’ IgIV avant mise en culture avec les PBMC autologues provoque outre l’apoptose importante des lymphocytes un accroissement significatif de la production d’IL-1Ra. Le processus est indépendant du fragment Fc, la fraction F(ab’)2 gardant la capacité d’induire l’apoptose et la production d’IL-1Ra.

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