Caractérisation de CCX2, un élément de la super-famille des antiports cationiques CaCA et de son rôle dans l’homéostasie minérale.<p><p>L'homéostasie des métaux est importante pour les fonctions cellulaires. Elle dépend de la régulation stricte des transports cellulaires d'ions métalliques et des espèces métalliques complexées. Nous rapportons ici l'analyse fonctionnelle chez Arabidopsis thaliana d'un élément de la superfamille CaCA, CCX2 (Calcium Cation eXchanger 2) qui n’est pas encore caractérisé dans les plantes. Nous avons pu observer en utilisant une fusion aves la protéine fluorescente GFP (Green Fluorescent Protein) que la protéine AtCCX2 était localisée dans le réticulum endoplasmique. L’expression de CCX2 est régulée par des traitements en métaux divers et par la carence en magnésium en particulier. De plus, l'expression du gène est régulée par la photopériode mais n’est probablement pas sous le contrôle de l'horloge circadienne. La caractérisation d'un mutant knock-out d’Arabidopsis a révélé que l’absence de l’activité CCX2 entrainait une meilleure croissance pendant la carence Mg (dans les conditions testées) mais pas de phénotype particulier sur les milieux aves excès de Zn ou de Cd ou induisant un stress osmotique. A ce stade, nous de pouvons apporter une explication au phénomène de tolérance pendant la carence Mg. Par ailleurs, le mutant ccx2 montre une réponse altérée à des hormones telles l’auxine et l’éthylène. Parce ce que le phénotype ccx2 mutant est relativement discret, des doubles mutants avec les gènes homologues les plus proches (CCX1 et CCX3) ont été créés. Alors que les mutants ccx1 et ccx3 sont plus résistants à la carence en Mg et ccx1 plus résistant à la déficience Zn, aucun effet additif de ces mutations avec la perte de fonction de CCX2 n’a été observé. Les profils en minéraux du mutant ccx2 ne permettent pas de confirmer des différences significatives dans les concentrations d’éléments minéraux mesurés. Des tendances pour le Ca2+ en particulier sont observées et devraient être confirmés par d’autres expériences. La surexpression hétérologue dans la levure ou dans une suspension de cellules BY2 de tabac, la surexpression dans la plante et la production de protéine pour des études d’activité de transport dans des vésicules n’ont pu être possibles pour la caractérisation de CCX2. L’expression de CCX2 semble toxique pour les bactéries, la levure et les cellules de plantes; en effet les organismes hôtes sont morts lors de l'induction de l'expression (testé au niveau de la levure). Cet effet pourrait être lié à la perturbation de l’homéostasie du Ca2+ qui joue un rôle très important comme messager secondaire lors de la perception d’un stimulus et en particulier lors de l’apoptose. L’Analyse AhCAX8/CCX2 AhCCX2 est constitutivement plus exprimé dans les racines de l’hyperaccumulatrice de Zn et Cd, Arabidopsis halleri (accession d’Auby) par rapport à sa parente proche non tolérante non accumulatrice A. lyrata ssp petraea. L'expression plus élevée pourrait être liée à l'adaptation aux hautes concentrations de zinc et de cadmium dans le sol. Nous avons pu observer qu’avec une protéine GFP, AhCCX2 est également localisée au niveau du réticulum endoplasmique comme son homologue AtCCX2. Puisque une haute expression de CCX2 est toxique pour les organismes, nous avons exprimé la protéine sous le contrôle de son propre promoteur dans A. thaliana. Cette expression faible et spécifique a pu être atteinte sans signe de toxicité. La caractérisation de A. thaliana exprimant AhCCX2 dans le type sauvage ou le mutant ccx2 a montré une meilleure croissance lors d’une déficience Mg et, dans les plantes ccx2 qui expriment AhCCX2, une moins bonne croissance lors d’une carence en Zn. Les analyses minérales des plantes exprimant AhCCX2 n’ont pas montré de différence au niveau des concentrations en minéraux. Cependant, certaines tendances ont été observées pour les concentrations en Ca, Fe et Zn qui doivent être confirmées. Nos données suggèrent pour AhCCX2 un rôle dans l'homéostasie du Zn. Un niveau d'expression élevé d’AhCCX2 a un impact négatif sur la croissance lors d’une carence en zinc et pourrait être une partie des adaptations à un approvisionnement en Zn élevé. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The absolute clarity of the lens of the eye is vital in the visual system. The unique structural and physiological properties of the lens are tightly integrated with highly ordered protein content to allow the lens to remain transparent. Consequently, any alteration or disturbance of these highly ordered proteins can affect the optical properties of the lens. In humans, cataracts are the major cause of blindness, yet the exact aetiology of cataract formation (cataractogenesis) is not fully understood. The purpose of the current research was to investigate whether deregulation of the Ca²⁺-dependent enzyme, calpains, following changes in lens Ca²⁺ homeostasis, is a key mechanism leading to undesired cleavage of a number of proteins that are linked with maintaining lens transparency and contributing to cataractogenesis. An ovine lens culture (in vitro) system and the heritable ovine cataract (in vivo) model were used to test the research hypothesis. The Ca²⁺ ionophore, ionomycin, was used to induce a Ca²⁺ overload and in vitro opacification during lens culture. Opacity in the lens was graded by a computer image analysis program. Protein profile (SDS-PAGE, 2-DE and Western detection), calpain activity (casein zymography), lens structure (microscopic view) and cytotoxicity level (LDH leakage assay) were analysed in Ca²⁺-induced opaque lenses. The involvement of calpain during opacification was further examined by applying synthetic exogenous calpain inhibitors to the in vitro system. Two novel exogenous calpain inhibitors were also assessed for their therapeutic potential in preventing the progression of cataracts in the in vivo cataract model by topical administration of the inhibitor direct to the sheep's eye over a 11 week period. HPLC was used to detect the penetration of these compounds into ocular tissues. Sustained Ca²⁺ influx into cultured lenses caused dense opacification. The opacity was characterised by formation of a turbid fraction and cell death in the outer cortex of the ovine lens. There was increased calpain autolysis associated with the progress of opacification, indicating increased calpain activity. Major degradation of the cytoskeletal proteins, spectrin and vimentin, was observed whilst there was limited degradation of the lens structural soluble proteins, crystallins, in response to a Ca²⁺ flux. Lens proteins were protected from degradation by adding synthetic calpain inhibitors to the culture medium. Topical administration of novel anti-calpain molecules failed to retard the progression of cataractogenesis in the ovine inherited cataract model. Further investigation of drug penetration showed that efficacy of inhibitory compounds was limited by permeability of these molecules across the cornea and the ability of the molecules to reach and penetrate into the lens. The ovine lens Ca²⁺-induced opacification (OLCO) model in this thesis has provided a model to understand the role of Ca²⁺ homeostasis in lens transparency. With sustained intracellular Ca²⁺ level, the degradation of cytoskeletal elements is highly correlated with calpain activity. Cataractogenesis is the pathological response to the loss of lens Ca²⁺ homeostasis in this model. The current results support the hypothesis that the deregulation of calpain activity is a trigger for a series of cascading events, leading to death of the cells in the lens.