Erythropoietin is a glycoprotein which stimulates the erythropoiesis, clinically used for the treatment of renal anaemia. The biological and chromatographic methods for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products were validated in the present work. The normocythaemic mice bioassay was carried out in female BALB/c strain, with multiple injections schedule and reticulocytes counted by automated flow cytometry. The dose-response curve was linear (r2=0.9708) in the concentration range of 1 to 64 IU/mL. A reversed-phase liquid chromatography method (RP-LC) was developed and validated using a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase A consisted of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and mobile phase B consisted of 0.08% TFA:acetonitrile (30:70, v/v), run in linear gradient: 0.1-60 min, 0.1-100% of B at flow rate of 0.5 mL/min with detection at 280 nm. The chromatographic separation was obtained within 60 min and it was linear (r2=0.9997) in the concentration range of 10-150 μg/mL. The procedures were validated evaluating parameters such as, the specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, and limit of quantitation, as well as, the limit of detection evaluated in the validation of the chromatographic method. The methods were applied for the potency evaluation of the alfa and beta rhEPO in pharmaceutical products, which were analysed by the chromatographic method and compared to the bioassay showing mean differences between the estimated potencies of 11.2% higher for the RP-LC. The alternative established represents a contribution towards the replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Erythropoietin is a endogenous glycoprotein which stimulates the erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of renal anaemia. The chromatographic method for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products was validated in the present work. A size-exclusion liquid chromatography method (SE-LC) was validated using a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7,8 mm I.D.), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase consisted of 0.001 M monobasic potassium phosphate, 0.008 M dibasic sodium phosphate and 0.2 M sodium chloride buffer, pH 7.4, run isocratically at a flow rate of 0.5 mL/min with detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained within 30 min and it was linear in the concentration range of 5-150 μg/mL (r2=0.9991). Validation parameters were evaluated such as sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. The specificity was evaluated by the peak purity of the Recombinant Human Erythropoietin Biological Reference Preparation of European Pharmacopoeia (rhEPO-SBR) storage under stress conditions. The proposed method was applied for the analysis of erythropoietin in pharmaceutical products, evaluating also the dimmers and high-molecular-mass forms. Moreover, was performed the analysis of erythropoietin by reversedphase liquid chromatography (RP-LC), evaluating the sulphoxides and deamidates forms. The correlation with the methods was established, showing mean differences between the estimated potencies of 2.50% lower for the bioassay, and 9.29% higher for the RP-LC, compared with the sizeexclusion liquid chromatography method, with significative correlation, conform calculated for the Pearson s correlation coefficient (r=0,9629 e r=0,9422, respectively). The alternative established represents a contribution towards the reduction or replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / A eritropoietina é uma proteína endógena que estimula a eritropoiese. É clinicamente usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foi validado método cromatográfico por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos, empregando coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7,8 mm I.D.), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel foi composta de fosfato de potássio monobásico 0,001M, fosfato de potássio dibásico 0,008M e cloreto de sódio 0,2M, pH 7,4, eluída isocraticamente, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 30 min, sendo linear na faixa de concentração de 5-150 μg/mL (r2=0,9991). Avaliaram-se os parâmetros de sensibilidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Eritropoietina Humana Recombinante Substância Biológica de Referência da Farmacopéia Européia (rhEPO-SBR) submetida à degradação sob condições forçadas. O método proposto foi utilizado para análise de eritropoietina em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas diméricas e de alta massa molecular. Paralelamente, efetuaram-se análises por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), determinando-se as formas de sulfóxidos/desamidados. Estabeleceu-se correlação entre os métodos, demonstrando que os produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,50% menores pelo bioensaio, e 9,29% maiores para CL-FR, em relação ao método por cromatografia líquida por exclusão molecular, com correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de pearson (r=0,9629 e r=0,9422, respectivamente). Desse modo, pesquisou-se alternativa no contexto da redução ou substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a sialoglycoprotein which promotes the increase of erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of anaemia associated to chronic renal failure. Identification and separation of isoforms of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in biopharmaceuticals of different origins, was carried out by isoelectric focusing (IEF) western blotting and, also by lectin binding with Triticum vulgaris, showing 4-7 isoforms distributed in the isoeletric range of 4.4 to 5.2. N-acetylneuraminic acid content was quantified by reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection giving values higher than 108.74 ηg/μg. Biological activity was evaluated by the normocythaemic mice bioassay, and investigating the TF-1 cell line in vitro. The correlation of the results of both of the methods were significant, as calculated by the Pearson s coefficient (r = 0.9967). In addition, the content/potency of the biopharmaceutical products was assessed by validated reversed phase and size exclusion liquid chromatography methods, showing mean values 2.11% and 1.21% lower, respectively, related to the in vivo bioassay. Sample was degraded under UV light to generate deamidate/sulphoxide forms and treatment at 65ºC for 12 hours to produce dimeric and aggregated forms. The potencies were evaluated by the normocythaemic mice assay and the TF-1 cell culture assay giving mean reduction of 14.05% and 32.87%, respectively, related to the intact molecule. The alternative in vitro assay investigated in the context of the reduction or replacement of the animals, and the evaluation of the correlations between physicochemical and biological methods, represent improvements which can be applied to the production steps and for the quality control of rhEPO, contributing to ensure the batch-to-batch consistency of bulk and finished biological products. / A eritropoietina é uma sialoglicoproteína que promove o aumento da eritropoiese. Clinicamente é usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente realizou-se identificação e separação das isoformas de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos biofarmacêuticos de diferentes origens, por focalização isoelétrica (IEF), seguida de imunodetecção, e também por ligação à lectina Triticum vulgaris, demonstrando a presença de 4 a 7 isoformas, distribuídas na faixa de ponto isoelétrico de 4,4 a 5,2. Quantificou-se o conteúdo de ácido N-acetilneuramínico por cromatografia líquida por fase-reversa e detecção por fluorescência obtendo teores acima de 108,74 ηg/μg. Avaliou-se a atividade biológica pelo bioensaio em camundongos normocitêmicos e pesquisou-se o ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem celular TF-1 in vitro. Os resultados dos bioensaios apresentaram correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9967). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 2,11% e 1,21% menores, respectivamente, em relação ao bioensaio in vivo. Submeteu-se amostra à degradação por luz UV para obter as formas desamidadas/oxidadas e tratamento a 65°C por 12 horas para as diméricas e agregadas. Efetuou-se a avaliação pelo bioensaio in vivo e in vitro, que apresentaram redução média de 14,05% e 32,87% respectivamente, em relação à molécula intacta. Desse modo, o ensaio biológico alternativo in vitro, pesquisado no contexto da redução ou substituição do uso de animais, e as avaliações de correlação entre métodos físico-químicos e biológicos, representam aprimoramentos aplicáveis para as etapas do processo de produção e para o controle de qualidade de rhEPO, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produto biológicos acabados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a hematopoietic hormone and the main physiological function is the induction of erythropoiesis. Recombinant DNA technology enabled cloning and expression of rhEPO gene to produce recombinant human erythropoietin (rhEPO). It is a sialoglycoprotein composed of 165 amino acids chain and about 40% of the molecule consists of carbohydrates, important for biological activity due to the presence of sialic acid residues at the termini of chains affecting its half-life. In the present study an alternative in vitro cell culture-based assay using TF-1 cell line was validated, to be used in conjunction with a reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection (F-RP-LC) validated to determine the content of sialic acids. The values obtained for the sialic acids were higher than 126.83 ng/μg, and the biotechnology-derived products were subjected to the cell culture bioassay giving potencies 2.91% ± 0.85 lower related to the bioassay in normocythaemic mice, with significant correlation calculated by the Pearson coefficient (r = 0.9947). In parallel, it was determined the content/potency of the products by the validated reversed-phase and size-exclusion liquid chromatography methods that showed mean results 3.14% higher and 2.87% lower, respectively, compared to the in vitro bioassay. It was demonstrated that in vitro cell culture bioassay represent a valid alternative to the in vivo bioassay for the potency assessment of rhEPO, in the context of the reduction and/or replacement of animals. Likewise, correlation of the results obtained with the physicochemical methods, represents advances for the characterization of the biomolecule, which can be applied to the production steps and for the quality control, contributing to assure the batch-to-batch consistency of the bulk and the finished biological products of rhEPO. / A eritropoietina é um hormônio hematopoiético cuja principal função fisiológica é a indução da eritropoiese. Através da tecnologia do DNA recombinante foi possível a clonagem e expressão do gene para produzir a eritropoietina humana recombinante (rhEPO). É uma sialoglicoproteína composta por cadeia de 165 aminoácidos e, aproximadamente, 40% da molécula é constituída de carboidratos, importantes para a atividade biológica devido à presença de resíduos de ácidos siálicos nas extremidades das cadeias, que influenciam na meia-vida da biomolécula. No presente estudo foi validado ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem de células TF-1 in vitro, e método por cromatografia líquida por fase reversa com detecção por fluorescência para determinação de ácidos siálicos, para avaliação em conjunto da potência de rhEPO. Determinaram-se teores de ácidos siálicos acima de 126,83 ng/μg e os produtos biotecnológicos foram submetidos ao bioensaio por cultura de células fornecendo potências 2,91% ± 0,85 menores em relação ao ensaio biológico em camundongos normocitêmicos, com correlação significativa calculada pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9947). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 3,14% maior e 2,87% menor, respectivamente, em relação ao bioensaio in vitro. Demonstrou-se que o bioensaio por cultura de células in vitro, constitui-se em alternativa ao ensaio biológico in vivo para a avaliação de potência de rhEPO, no contexto da redução e/ou substituição do uso de animais. Do mesmo modo, a correlação com os resultados fornecidos pelos métodos físico-químicos, representa avanços para caracterização da biomolécula, que podem ser aplicados nas etapas do processo de produção e para o controle de qualidade, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produtos biológicos acabados de rhEPO.