Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La placenta cumple funciones fundamentales para del desarrollo embrionario, entre ellas destaca el transporte transplacentario de solutos. La principal barrera para el intercambio de solutos entre la sangre materna y la fetal es el sinciciotrofoblasto placentario (STP), en el cual se distinguen dos membranas: una en el lado materno que recibe el nombre de membrana apical y la otra en el lado fetal, que recibe el nombre de membrana basal (Shennan y Boyd, 1987). El trofoblasto placentario se caracteriza por ser un sincicio, es decir, un epitelio sin rutas paracelulares, lo que implica que todos los solutos deben pasar directamente a través de sus dos membranas, ellas son la membrana apical (MVM) y la membrana basal (BM). Es por ello, que para desarrollar un modelo de transporte transplacentario, es necesario identificar las vías conductivas existentes en ambas membranas. Dentro de este contexto, nuestro laboratorio ha aportado numerosos estudios acerca del transporte a través de canales iónicos, para completar este modelo. El canal de potasio (K+) juega un rol esencial en los epitelios, así como también en el STP, sin embargo, no existían evidencias directas de la presencia de canales de K+ en las membranas del sincicio. En este trabajo se identificó y caracterizó las conductancias iónicas de K+ presentes en la membrana apical, en particular en una sub-fracción obtenida en la fase final del protocolo de purificación de membranas de sinciciotrofoblasto (Jiménez et al., 2004). Dicha fase consiste en una gradiente de sacarosa, que en su interfase 10/37%, contiene esta sub-fracción la cual se ha denominado LMVM o fracción de membrana apical liviana, que comparte similares características con la fracción conocida tradicionalmente como membrana apical pesada en enriquecimiento con fosfatasa alcalina, marcador de membrana apical. Sin embargo, tiene diferencias en los microdominios lipidicos presentes en ambas, en las proteínas del citoesqueleto asociadas a ellas y en la cantidad de colesterol (Godoy et al., 2008). Esto último nos sugiere que el canal de K+ podría estar presente en la LMVM, a pesar de no haber sido encontrada en la MVM. Las corrientes iónicas provenientes de LMVM fueron registradas mediante la técnica de patch clamp en un sistema lipídico artificial, los “liposomas gigantes”, a través de la modalidad de “parche escindido”. Los resultados obtenidos indican que existen corrientes iónicas de K+ en la LMVM, que fueron reguladas en forma específica por NaCl, reduciendo la intensidad de corriente en los sellos dependiendo de la concentración usada, pero independiente del potencial aplicado. A su vez también fueron probados bloqueadores de canales de K+ tales como el TEA y el Bario en forma independiente y luego de manera aditiva, los cuales redujeron la intensidad de corriente en los sellos en distintas magnitudes. Los resultados de esta memoria, constituyen un aporte al modelo de transporte transplacentario a través del STP, así como al entendimiento de los mecanismos de regulación del canal de K+ y el papel que puede cumplir en la modulación del transporte de este ión en la placenta, lo que en el futuro podría otorgar información sobre posibles patologías asociadas a este

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Durante décadas, la estructura de las membranas biológicas fue caracterizada como un Mosaico Fluido, pero posteriormente surgió evidencia de la presencia de Lipid Rafts o Microdominios Lipídicos, que son estructuras de membrana enriquecidas en esfingolípidos y colesterol que contienen diversas proteínas y cumplen roles específicos dentro de la membrana. Recientemente, se ha reportado la presencia de estas estructuras, además de una serie de canales iónicos, en las membranas del Sinciciotrofoblasto placentario humano (hSTB), epitelio sincicial responsable del intercambio materno-fetal en la gestación. Este tejido posee membrana basal y membrana apical, la cual se subdivide en dos subdominios; uno pesado o MVM y uno liviano o LMVM. Por otra parte, existen antecedentes de que la asociación de un canal de potasio a microdominios de membrana tiene implicancias en el funcionamiento del canal, por lo que, el objetivo del presente estudio es describir la segregación de los canales de potasio previamente identificado en placenta KV 2.1, KIR 2.1, TREK-1 y TASK-1 en dominios Rafts de MVM y LMVM del hSTB. A partir de placentas de término, se obtuvieron la membrana basal y los dos sub-dominios de membrana apical del hSTB. Luego, MVM y LMVM se solubilizaron con detergente Tritón-X-100 y se centrifugaron en una gradiente discontinua de sacarosa, la cual se alicuotó en once fracciones, donde las fracciones insolubles en detergente (1-5) fueron Rafts y el resto no-Rafts. Mediante Western Blot y Dot Blot, se probaron marcadores Rafts (Fosfatasa Alcalina Placentaria o PLAP y gangliósido GM1) y no-Rafts (Receptor de Transferrina Humano o hTf-R), como también los canales de potasio KV 2.1, KIR 2.1, TREK-1 y TASK-1 en las once fracciones. Los resultados indicaron que las fracciones Rafts son ricas en PLAP y GM1, mientras que las no-Rafts ricas en hTf-R, lo cual permite inferir que se lograron aislar los Lipid Rafts. En el caso de los canales de potasio, Kv 2.1 se ubicó en fracciones no-Rafts y KIR 2.1 en fracciones Rafts. La presencia de KIR 2.1 en Rafts además se confirma mediante un experimento con extracción de colesterol. Este es la primera evidencia de segregación de canales de potasio en dominios Rafts y no-Rafts realizado en el hSTB. Sabiendo que KV 2.1 se ubica en sitios no-Rafts y KIR 2.1 en sitios Rafts, resta investigar la implicancia funcional de dicha asociación en la membrana apical, ya sea en condiciones normales como en patologías de la gestación

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La gestación, en todas las especies, es apoyada por una estructura que permite que el nuevo ser pueda desarrollarse y crecer adecuadamente dentro del vientre materno: la placenta. El transporte de solutos a través de ella se realiza, específicamente, a través de una célula epitelial multinucleada: el sinciciotrofoblasto (hSTB). Al ser un epitelio continuo, todo soluto debe atravesar, obligatoriamente, tanto su membrana apical como su membrana basal (BM). La membrana apical del hSTB se divide en dos subdominios diferentes entre sí: membrana apical pesada (MVM) y membrana apical liviana (LMVM). Para desarrollar el modelo de transporte transplacentario, es necesario identificar las vías conductivas existentes en las membranas del hSTB. Existen numerosos estudios acerca de canales iónicos y transportadores en ellas, sin embargo, en particular, los canales de K+ (principal ión intracelular) han sido pobremente descritos. Un estudio preliminar demostró la existencia funcional de corrientes de K+ en LMVM de hSTB. El objetivo del presente estudio, fue caracterizar funcional y estructuralmente que tipo de canales de K+ son los que subyacen las corrientes identificadas previamente en LMVM de hSTB de placentas humanas normales. Experimentos de Inmunohistoquímica revelaron la presencia de TREK-1 en membrana apical del hSTB y de BKCa en el citoplasma del sinciciotrofoblasto. Adicionalmente, mediante Immunoblotting, se detectó la presencia de KIR2.1, KV2.1, TASK-1 y TREK-1 en ambos subdominios de membrana apical, mientras que la expresión de BKCa fue, principalmente, en BM. La detección funcional de los canales de K+ que demostraron estar presentes en LMVM (KIR2.1, KV2.1, TASK-1 y TREK-1) por Immunoblotting, fue realizada utilizando la técnica de Patch-Clamp en configuración parche escindido (116 sellos de 16 placentas independientes). Se utilizaron bloqueos diferenciales para poder disecar corrientes con diferentes características. Se obtuvieron corrientes de K+ muy sensibles al bloqueo por BaCl2 (69,82%) de manera reversible. Adicionalmente, se obtuvieron registros de corrientes con sensibilidad a MgCl2 y CsCl2 (29% y 25%, respectivamente). Estas corrientes son características del canal KIR2.1. Por otro lado, se obtuvieron corrientes que demostraron tener un gran sensibilidad al bloqueador TEA a concentraciones milimolares (79,86%), las que corresponderían al canal KV2.1. En contraste, se obtuvieron corrientes que no presentaron efectos a los bloqueadores mencionados y que sin embargo, mostraron diferentes respuestas a la acidificación del medio. Es así como, un canal que pudiese corresponder a TASK-1 se obtuvo al registrar corrientes bloqueadas a pH 6,1 (bloqueo de un 28,92%) y una corriente que mostró una fuerte activación a pH 6,6 (63,08% de aumento sobre la corriente inicial), cuyo candidato más probable es TREK-1. Estos experimentos demostraron, en base a su farmacología y respuesta a cambios del medio, la presencia de cuatro canales de K+ (KIR2.1, KV2.1, TASK-1 y TREK-1) en LMVM del hSTB lo que se correlaciona directamente con lo observado mediante Western blots