Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Sur la p. de t. "v" est en indice. Bibliogr.: f. 77-93. Publié aussi en version électronique.

Les canaux sodiques voltages dépendants sont responsables de la phase ascendante du potentiel d'action et jouent un rôle important dans l'initiation du potentiel d'action et de sa propagation dans les cellules excitables. Les canaux sodiques sont constitués d'une sous-unité a formant le pore, associée à plusieurs sous-unités p auxiliaire. La sous-unité a est formée de quatre domaines homologues (I-IV), chacun d'eux étant composé de six segments hydrophobiques (S1-S6). Seule la principale sous-unité a est nécessaire à l'expression fonctionnelle, mais les sous-unités p ont une action modulatrice sur la localisation et les propriétés fonctionnelles de la sous-unité a. Suite à des lésions du nerf, les neurones de ganglions dorsaux deviennent hyperexcitables. Les ganglions dorsaux expriment une combinaison de canaux sodiques de cinétique rapide sensibles à la TTX et de canaux de cinétique lente résistants à la TTX. Ces canaux jouent un rôle important dans la douleur chronique. Deux canaux sodiques distincts ont été clones à partir des ganglions dorsaux, Navl .7 et Nav1.8. Ils codent respectivement pour les canaux sensibles et résistants à la TTX. Même si Nav1.8 exprime bien dans les ovocytes de Xenopus laevis, les essais dans les lignées cellulaires de mammifères n'ont pas abouti. Matériels et Méthodes: Dans cette étude, nous avons recherché les déterminants de Nav1.8 dans les cellules de mammifères en utilisant une combinaison d'immunobuvardage et d'électrophysiologie. Résultats: Notre étude révèle que l'expression faible de Nav1.8 dans les cellules de mammifère est reliée à un défaut de trafficking qui emprisonne la protéine canal dans le réticulum endoplasmique. Si on incube les cellules tsA201 avec l'anesthésique local lidocaine, l'expression de Nav1.8 est considérablement augmentée. Les propriétés biophysiques du courant Nav1.8 exprimé dans un système d'expression hétérologue reproduisent celles de la composante du courant Na+ résistant à la TTX mesuré dans les neurones des ganglions dorsaux de rat. Conclusion: Nos résultats indiquent que la lidocaine, un bloqueur du canal sodique, agit comme un chaperon chimique qui stabilise le canal Nav1.8 dans sa conformation native et augmente donc le niveau d'expression de Nav1.8. / Voltage-gated sodium channels are responsible for the rising phase of action potentials. They play an important role in the initiation and propagation of action potential in excitable cells. Sodium channels consist of a pore-forming a subunit, associated with auxiliary p subunit. One a subunit consists of four homologous domains (I-IV), each composed of six hydrophobic segments (S1-S6). Dorsal root ganglion (DRG) neurons express a combination of rapidly gating TTX-sensitive and slowly gating TTX-resistant Na current. Two distinct Na channels have been cloned from the DRG that appear to account for the majority of this Na current. The Nav1.7 and Nav1.8 channels encode for rapidly inactivating TTX-sensitive and slowly inactivating TTX-resistant Na currents respectively. These two channels contribute significantly in pain pathways. Nav1.7 has a highly significant role in determining inflammatory pain thresholds, and Nav1.8 is the decisive role in maintaining the hypersensitivity of primary afferent neurons following nerve injuries. Although the cloned Nav1.8 expresses well in Xenopus oocytes, attempts the express the Nav1.8 channel in mammalian expression Systems have been met with limited success even in the presence of known sodium channel accessory p subunits. Methods: In this study we investigated the important determinants of Nav1.8 expression in mammalian cells using a combination of immunochemistry and patch-clamp technique. Results: Our study revealed that the low expression of Nav1.8 in mammalian cells is related to a trafficking defect that traps the channel protein in the endoplasmic reticulum. Incubating the tsA201 cells with the local anesthetic lidocaine dramatically enhances Nav1.8 expression. The biophysical properties of the heterologously expressed Nav1.8 current accurately reproduce those of the TTX-resistant component of Na current recorded from native DRG neurons. Conclusion: Our data indicates that lidocaine, a sodium channel blocker, can act as a chemical chaperone that stabilizes Nav1.8 channels in its native conformation therefore increases the expression of Nav1.8.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Les canaux sodiques permettent la génération de potentiels d'action. Ceux-ci sont nécessaires à l'excitabilité cellulaire. Ainsi, les canaux sodiques permettent la génération et la propagation de l'influx nerveux. Ils permettent aussi la contraction des muscles squelettiques et du muscle cardiaque. Un dysfonctionnement dans ces canaux peut être à l'origine d'un vaste spectre de phénotypes pathologiques neuronaux tels que l'épilepsie, la douleur chronique, l'incapacité à ressentir la douleur, neuromusculaires tel la paramyotonie congénitale ou cardiaques tels certaines arythmies cardiaques ou la cardiomyopathie dilatée. L'étude des altérations des propriétés biophysiques des canaux sodiques permet de fournir un point de départ dans l'étude des mécanismes menant aux phénotypes pathologiques en plus d'orienter les traitements. Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur une mutation permettant la création d'un pore alternatif dans le canal sodique. Nous avons caractérisé les propriétés du pore et les régions de la protéine où il est possible de créer un tel pore.

Une majorité de neurones du noyau préoptique médian (MnPO) chez le rat sont sensibles aux variations de la concentration extracellulaire de sodium (Na⁺). L'objectif de cette étude était de déterminer le mécanisme cellulaire impliqué dans la détection du Na⁺ dans le MnPO. Pour étudier ce mécanisme, des enregistrements électrophysiologiques ont été réalisés sur des neurones dissociés et des neurones présents dans une tranche de l'hypothalamus. On a d'abord démontré la présence de "senseurs" de Na⁺ dans les neurones du MnPO. Ensuite, on a déterminé que la détection du Na⁺ extracellulaire était spécifiquement attribuée à un flux d'ions Na⁺ à travers un canal de fuite bloqué par le rubidium. Les propriétés de ce canal étaient similaires à celles d'un canal sodique. Même si cela reste à confirmer, la présence d'ARNm codant pour le canal Nax dans le MnPO fait de ce canal un candidat potentiel.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 79-87. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017. / Les canaux sodiques dépendants du voltage (NaV) participent à la genèse et la transmission de l'influx nerveux via l'initiation du potentiel d'action. Chez l'insecte, ces protéines sont la cible de nombreux insecticides neurotoxiques. Étant donné le déclin des populations d'insectes pollinisateurs observé récemment, il devient désormais important d'avoir des méthodes permettant le développement d'insecticides qui ne ciblent pas les pollinisateurs. L'objectif général de ma thèse a donc été de mettre au point des méthodes in-vitro et insilico pouvant être appliquées à grande échelle dans le but d'évaluer le risque potentiel que certains insecticides pourraient représenter pour l'abeille. Pour ce faire, nous avons procédé à la caractérisation biophysique et pharmacologique des canaux sodiques NaV1 et NaV2 d'abeille. Nous avons aussi créé un modèle moléculaire du canal NaV1 d'abeille permettant la conception rationnelle d'insecticides. De plus, nous avons caractérisé le canal NaV1 de Varroa destructor, un parasite important de l'abeille. Les études insérées dans cette thèse ont permis de démontrer que le canal NaV2 n'est pas une cible secondaire des insecticides pyréthroïdes. De plus, nous avons pu mesurer les effets et l'affinité d'insecticides sur leur cible moléculaire chez l'abeille suite à l'expression du canal NaV1 d'abeille en ovocyte de grenouille. Cela permet le criblage de composé à haut débit afin de sélectionner des composés représentant un faible risque pour l'abeille. De même, l'expression du canal NaV1 de Varroa destructor en système d'expression hétérologue permettrait l'utilisation de la méthode de criblage de composés à haut débit dans le but d'identifier des insecticides qui représentent un risque important pour cette peste. D'ailleurs, nous avons déterminé que le fluvalinate, un insecticide pyréthroïde utilisé pour contrôler les populations de Varroa destructor dans les ruches d'abeille, a une affinité différente pour le canal NaV1 d'abeille que pour celui de Varroa destructor. Cela indique une différence dans les sites de liaisons du composé qui pourrait éventuellement être exploitée. Mes travaux ouvrent donc la voie au développement de composés ciblant davantage des animaux nuisibles comme le Varroa destructor que des animaux utiles comme l'abeille. De plus, les caractérisations effectuées pourraient être utiles pour des études centrées sur les rôles et l'évolution des canaux ioniques appartenant aux familles NaV et CaV. / Voltage-gated sodium channels (NaV) are implicated in the genesis and transmission of action potentials. In insects, these proteins are the target of a number of neurotoxic insecticides. In the background of the pollinator decline observed recently, it has become necessary to develop insecticides which do not target beneficial insects such as bees. The main objective of my thesis was to develop in-vitro and in-silico methods which could be used on a large scale to evaluate the risk associated with the use of certain compounds for bees. To do so, we assessed the biophysical and pharmacological properties of the honeybee's NaV1 and NaV2 channels. We also created a molecular model for the NaV1 channel which enables the rational design of insecticides. Furthermore, we have characterized the Varroa destructor NaV1 channels. The investigations featured in this thesis demonstrate that the NaV2 channel is not a secondary target of pyrethroïd insecticides. However, following expression in frog oocytes, it is possible to quantify the effects and affinity of those insecticides for their molecular target in the honeybee, the NaV1 channel. This makes possible the use of high throughput screening technologies for the selection of insecticides which would represent a small risk for bees. Moreover, the expression of Varroa destructor NaV1 channels in frog oocytes enables the use of medium throughput screening technologies to identify compounds which could be deleterious for this pest. Indeed, we determined that fluvalinate, a pyrethroïd insecticide used to control Varroa population in honeybee hives, has an affinity for the honeybee NaV1 channel that is different than that for the Varroa channel. This indicates that the binding site of this compound on the Varroa channel would differ from the binding site on the bee channel. This difference could be exploited to improve the specificity of fluvalinate. The work presented here represents a first step in the development of methods which could be used to decrease the toxicity of insecticides for bees while increasing their specificity of against pests such as Varroa destructor. Furthermore, the characterizations performed provide new insights on topics such as the roles and the evolution of NaV et CaV channels.

Les canaux sodiques cardiaques (NaV1.5), responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action cardiaque, Sont codés par le gène SCN5A. Des phénotypes d'arythmies variés et de gravité variable ont été associés jusqu'à présent aux mutations hétérozygotes de SCN5A, allant de modifications électrocardiographiques asymptomatiques (pouvant indiquer un phénotype léger) à des arythmies symptomatiques pouvant entraîner une syncope, un arrêt cardiaque et la mort subite. Les facteurs de risque pour la plupart des mutations de SCN5A sont encore à établir. L'objectif de la présente étude consiste à caractériser les propriétés biophysiques de la mutation du canal NaV1.5/A1148T en présence du polymorphisme Cav-3/G56S chez un patient ayant subi une mort subite cardiaque avortée. Pour évaluer le rôle de Cav-3 sur la fonction du canal NaV1.5, les canaux NaV1.5/WT et NaV1.5/A1148T ont été co-transfectés dans des cellules tsA201 avec Cav-3/WT ou Cav-3/G56S avec la sous-unité régulatrice β1. Les courants Na+ ont été enregistrés à l'aide de la technique de patch-clamp en configuration cellule entière et caractérisés biochimiquement et physiologiquement. Les cellules iPSCs provenant du patient ont été différenciées en cardiomyocytes et caractérisées biophysiquement. La co-expression de NaV1.5/A1148T avec Cav-3/WT ou Cav-3/G56S a entraîné des réductions significatives de la densité de courant, allant d'un cinquième de la valeur normative à une suppression complète de la densité de courant dans ces cellules. Les enregistrements des courants sodiques provenant des iPSC-CM ont confirmé la réduction de la densité de courant. Ces résultats suggèrent que la mutation A1148T pourrait être à l'origine de la pathologie même si le mécanisme moléculaire précis n'est pas encore élucidé. Notre découverte selon laquelle Cav-3 régule négativement la fonction du canal NaV1.5 en réduisant la densité de courant du canal a été confirmée à l'aide de deux lignées cellulaires différentes (tsA201 et HEK-293). / The cardiac Na⁺ channels (NaV1.5), responsible for initiation and propagation of cardiac action potentials, are encoded by the SCN5A gene. Various arrhythmia phenotypes of increasing severities have been associated to date with heterozygous SCN5A mutations, from asymptomatic electrocardiographic changes (which may indicate a mild phenotype) to symptomatic arrhythmias resulting in syncope, cardiac arrest, and sudden cardiac death. Risk factors for most of SCN5A mutations have yet to be established. The objective of the present study entails a characterization of the biophysical properties of the NaV1.5/A1148T channel mutation in the presence of the polymorphism Cav-3/G56S found in a patient with aborted sudden cardiac death. To investigate the role of Cav-3 on NaV1.5 channel function, NaV1.5/WT and NaV1.5/A1148T were co-transfected in tsA201 cells with either Cav-3/WT or the Cav-3/G56S along with β1 regulatory subunit. Na⁺ currents were recorded using the patch-clamp technique in whole-cell configuration and biochemically and physiologically characterized. Patient-specific iPSCs were differentiated into cardiomyocytes and biophysically characterized. Co-expression of NaV1.5/A1148T with Cav-3/WT or Cav-3/G56S resulted in significant reductions in current density, which ranged from one-fifth of the normative value to complete abolishment of current density in transfected cells. Na⁺ current recordings from iPSC-CMs confirmed the reduced current density. Those results suggest that the mutation, A1148T could cause the pathology even if the precise molecular mechanism is not unravelled yet. Our finding that Cav-3 negatively regulates NaV1.5 channel function by reducing Na channel current density were confirmed using two different cell lines (tsA201and HEK293).

Les canaux sodiques dépendants du voltage (Nav) sont des protéines transmembranaires largement exprimées au sein de l’organisme. Ils sont responsables de l’initiation des potentiels d’action au niveau des cellules excitables et régissent ainsi de nombreuses fonctions physiologiques telles que les fonctions cognitives et sensorielles, les fonctions motrices et la fonction cardiaque. Au niveau du coeur, le sous-type Nav1.5 est majoritairement exprimé à la surface des cardiomyocytes. Leurs dysfonctions sont traditionnellement associées à de nombreux troubles électriques cardiaques. Des mutations de ces canaux ont récemment été reliées au développement d’un phénotype clinique complexe associant diverses arythmies et la cardiomyopathie dilatée (DCM), une atteinte morphologique. L’objectif de mon doctorat a donc été l’identification mais aussi la caractérisation d’un potentiel défaut biophysique commun à l’ensemble des mutations Nav1.5 associées au développement de ce phénotype clinique atypique. Premièrement, nous nous sommes intéressés à deux mutations des canaux Nav1.5 retrouvées chez des patients atteints de DCM, et dont les altérations biophysiques ont été décrites comme divergentes. L'étude parallèle de ces deux mutants nous a amenés à identifier une caractéristique commune : la création d’une nouvelle voie de perméation alternative au sein des canaux Nav1.5, le pore oméga. Dans un second temps, nous avons souhaité consolider l’association entre la création du pore oméga et le développement pathologique. Cette seconde étude portant sur deux autres mutants Nav1.5 a permis de confirmer l’apparition d’un pore oméga et ainsi d’accroître la suspicion du caractère délétère de ce pore oméga. Finalement, à l’aide d’une cinquième mutation des canaux Nav1.5, nous avons investigué les conséquences physiopathologiques de la création d’un pore oméga. Cette étude, a clairement démontré les conséquences néfastes d'un tel pore au niveau de l’homéostasie ionique cellulaire. Ces perturbations se répercutent par la suite sur les signaux électriques, les propriétés morphologiques mais aussi fonctionnelles des cardiomyocytes. Les études menées lors de mon doctorat ont ainsi abouti à l'identification du pore oméga comme étant une caractéristique biophysique commune aux mutations des canaux Nav1.5 associées au développement des arythmies et de la dilatation cardiaque. / Voltage gated sodium channels (Nav) are broadly expressed in the human body. They are responsible for the initiation of action potentials (AP) in excitable cells. They underlie several physiological processes such as the cognitive, the sensitive, the motor and the cardiac functions. Nav1.5 channel is the main Nav expressed in the heart. Their dysfunctions are usually associated to the development of pure electrical disorders. However, mutations of Nav1.5 have recently been linked to the development of an atypical clinical phenotype combining complex arrhythmias and dilated cardiomyopathy (DCM). The main objective of my thesis has been to identify and characterize a common biophysical defect for all Nav1.5 mutations located in the channel’s voltage sensitive domains (VSDs) and associated with the atypical clinical phenotype. We were first interested in the case of two families of patients who displayed the same clinical phenotype although they carried two different Nav1.5 mutations, which have been reported to induce divergent biophysical defects. We identified a new alternative permeation pathway (called omega pore or gating pore) in the VSD of mutant Nav1.5 channels. This omega pore might constitute a common biophysical defect for all Nav1.5 mutations located in the channel’s VSDs. The second axe consisted in strengthening the association between mutations in the VSD of Nav1.5 and the creation of a gating pore. This research, based on the study of two other Nav1.5 mutations, confirmed the creation of an omega pore and increased the suspicion of the cardiovascular pathogenic potential of such an alternative permeation pathway. Finally, we studied a fifth Nav1.5 mutation. We used this mutation to characterize the pathological consequences of the creation of an omega pore. This study revealed that the creation of an omega pore disrupts the ionic homeostasis of cardiomyocytes. This homeostatic imbalance then affects electrical signals, cell morphology and also the function of cardiac myocytes. The studies of my thesis permitted to identify the omega pore as a potential common biophysical defect of Nav1.5 mutations located in the channel’s VSDs and associated to the arrhythmias and DCM. Furthermore, we also identified the pathological mechanism linking these mutations and the observed atypical clinical phenotype.

Les canaux sodiques sont des protéines membranaires d'une importance primordiale. Ils sont impliqués dans le déclenchement des potentiels d'action et sont nécessaires à l'excitabilité des cellules. Ils participent à la contraction des muscles striés squelettiques, cardiaques et lisses. Des dysfonctionnements de ces canaux, dûs à des mutations, peuvent engendrer de graves pathologies et atteintes cardiaques telles que le syndrome du QT long, le syndrome de Brugada, ou la cardiomyopathie dilatée. L'étude de ces mutations constitue un enjeu essentiel dans la compréhension des mécanismes de ces canaux et du développement des pathologies associées. Plus les connaissances avancent et plus il devient alors possible d'envisager des études précises sur le développement des traitements appropriés. Cette étude se concentre sur l'analyse de deux nouvelles mutations du gène SCN5A codant pour le canal Nav1.5, et a permis de mettre en évidence les caractéristiques biophysiques dysfonctionnelles de ces mutants et de confirmer le diagnostic médical. / Sodium channels are important transmembrane proteins. They are involved in the upstroke of action potential and they are necessary for the cardiac cell excitability. Their dysfunctions caused by mutations can lead to serious pathologies and cardiac impairments such as long QT syndrome, Brugada syndrome, dilated cardiomyopathy and even sudden death. The study of these mutations is a key step toward the comprehension of the pathophysiological mechanisms involved. The knowledge progress allows to lead accurate studies on drug development. This study focused on the analysis of two novel SCN5A mutations and allowed to highlight the dysfunctional biophysic characteristics of these mutants and to confirm the medical diagnosis.