Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas distribuídas em plantas, fungos e bactérias. As duas isoformas de ureases de Canavalia ensiformis (canatoxina - CNTX e urease do feijão de porco - JBU) são altamente tóxicas para insetos de diferentes ordens. A toxicidade dessas proteínas é dependente da liberação de um fragmento de cerca de 10 kDa a partir da proteína nativa. Essa liberação se dá por ação das enzimas digestivas cisteínicas e aspárticas (tipo catepsina B e D) presentes no trato digestivo de algumas ordens de insetos. Ureases não são tóxicas para insetos com digestão baseada em enzimas serínicas (tipo tripsina). Esse peptídeo de 10 kDa foi isolado e caracterizado, recebendo o nome de Pepcanatox. Um peptídeo recombinante, equivalente ao Pepcanatox, foi expresso em Escherichia coli e chamado Jaburetox 2Ec. Jaburetox 2Ec é tóxico, por via oral, para ninfas de Dysdercus peruvianus e, por injeção toráxica, para ninfas de Rhodnius prolixus e ninfas e adultos de Triatoma infestans. CNTX e JBU, dados por via oral, são tóxicos para ninfas de D. peruvianus e R. prolixus, mas não são tóxicas para as formas adultas desses insetos.O processamento de CNTX e JBU por enzimas de ninfas e adultos de D. peruvianus mostraram um perfil distinto, podendo ser esse diferencial o responsável pela falta de efeito tóxico observado em adultos. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. A purificação parcial das enzimas de C. maculatus por gel-filtração resultou em uma fração (Pico B) capaz de liberar um peptídeo de aproximadamente 10 kDa a partir de CNTX e JBU. A atividade proteolítica do Pico B é completamente inibida por Pep-A e parcialmente inibida por E-64, indicando a presença de aspártico (majoritária) e cisteíno proteases. Observamos que tanto E-64 (inibidor de cisteíno proteinases) quanto Pepstatina-A (inibidor de aspártico proteinases) diminuem a formação do peptídeo entomotóxico pelo Pico B, sugerindo que cisteíno e aspártico proteases estão envolvidas nesse processo.O mecanismo de ação em insetos das ureases, assim como dos peptídeos derivados, ainda não é conhecido. Um efeito observado in vivo é a diminuição da taxa de perda de peso de R. prolixus após a alimentação com ureases, indicando uma possível alteração no sistema excretório. Para avaliar o efeito das ureases e de Jaburetox 2Ec na secreção de R. prolixus, realizamos ensaios de secreção de fluídos pelos túbulos de Malpighi isolados, assim como ensaios de contrações dos intestinos anterior e posterior e vaso dorsal. JBU e Jaburetox 2Ec inibem a secreção de fluídos por túbulos de Malpighi isolados, de maneira dose dependente. CNTX também tem efeito antidiurético, enquando a urease de Helicobacter pylori (HPU) não causa nenhuma alteração na secreção dos túbulos de Malpighi. Jaburetox 2Ec, mas não JBU, causa um aumento dos níveis de GMPc nos túbulos sendo esse o segundo mensageiro de sua ação.Metabólitos de eicosanóides e cálcio (intra e extracelular) influenciam a ação de JBU, mas não de Jaburetox 2Ec. Ensaios de potencial transepitelial realizados com túbulos de Malpighi indicaram que Jaburetox 2Ec, mas não JBU, alteram a ação de uma H+-ATPase presente na membrana dos túbulos, causando um desequilíbrio no transporte iônico e, como consequência, alteração na secreção de fluídos. Os dados obtidos não mostram que JBU e Jaburetox 2Ec desencadeiam rotas distintas nos túbulos de Malpighi, ambos culminando em antidiurese. Assim como nos túbulos de Malpighi, JBU diminui o transporte de fluídos pelo epitélio do estômago de R. prolixus. Jaburetox 2Ec e JBU causam um aumento na frequência de contrações do estômago estimuladas por serotonina. No intestino posterior, observamos que JBU também causa um aumento na frequência e amplitude das contrações, e mudança no tônus basal do tecido. No vaso dorsal, nenhuma alteração significativa nas contrações foram observadas. Também avaliamos por microscopia o efeito da alimentação com JBU na liberação de serotonina, hormônio envolvido em diversos processos fisiológicos. Não observamos nenhuma alteração significativa na liberação desse hormônio a partir das células do sistema nervoso, assim como nos órgãos controlados por serotonina. A liberação de fragmento(s) entomotóxico(s) a partir de ureases vegetais, assim como o mecanismo de ação dessas ureases e fragmentos, são processosbastante complexos. Nessa tese tivemos êxito em caracterizar várias etapas desses processos, esclarecendo pontos chaves e levantando evidências para guiar trabalhos futuros. / Ureases (E.C. 3.5.1.5) are metalloenzymes widespread in plants, fungi and bacteria. Two isoforms of Canavalia ensiformis urease, (canatoxin - CNTX and jack bean urease – JBU), are toxic to insects from different orders. The toxicity of these proteins is due to the release of a 10 kDa peptide from the native protein. This release is due to the action of acidic digestive enzymes present in the insect digestive tract. Ureases are not toxic to insects with digestion relying on trypsin-like enzymes. The entomotoxic peptide, called Pepcanatox, was isolated and characterized and a recombinant peptide, equivalent to Pepcanatox was expressed in Escherichia coli. Jaburetox 2Ec, the recombinant peptide, is toxic by oral route to nymphs of Dysdercus peruvianus and by injection to nymphs of Rhodnius prolixus and nymphs and adults of Triatoma infestans. CNTX and JBU, administered by oral route, are toxic to nymphs of D. peruvianus and R. prolixus, but are innocuous to adults of these insects. Proteolytic processing of JBU and CNTX by digestive enzymes from D. peruvianus nymphs and adults showed a distinct profile. This differential processing could be related to the lack of toxic effect of the proteins in adults.Using Callosobruchus maculatus as a model, the digestive enzymes involved in urease’s processing were investigated. The partial purification of C. maculatus enzymes resulted in a protein fraction (Pool B) capable of releasing a 10kDa peptide from JBU and CNTX. The proteolytic activity of Pool B was completely abolished by Pep-A and partially inhibited by E-64, indicating the presence of aspartic (majoritary) and cysteine proteinases. Both E-64 and Pep-A decrease the formation of the entomotoxic peptide, suggesting that both classes of enzymes may be involved in this process. The purification of the enzymes present on Pool B will clarify the role of each of these enzymes on urease processing and release of the entomotoxic peptide. The mechanisms of action of ureases as well as urease-derived peptides in insects is still poorly characterized. A lower rate of weight loss in R. prolixus fed on a urease-containing meal was observed in vivo, indicating a possible alteration on theexcretory system. To evaluate the effect of ureases and Jaburetox 2Ec on R. prolixus excretion, we performed fluid secretion assays on isolated Malpighian tubules, as well as fore- and hindgut contractions assays. JBU and Jaburetox 2Ec inhibit Malpighian tubules fluid secretion in a dose dependent fashion. CNTX is also antidiuretic, while Helicobacter pylori urease (HPU) does not alter the secretion rate. Jaburetox 2Ec, but not JBU, increases tubules levels of cGMP. No changes in AMPc was seen with either polypeptide. Eicosanoid metabolites and calcium (intra- and extracellular) modulate the antidiuretic effect of JBU, but not that of Jaburetox 2Ec. Measurements of the transepithelial potential in Malpighian tubules indicated that Jaburetox 2Ec, but not JBU, disrupts the activity of a H+-ATPase present on tubules’ membranes, causing changes in fluid secretion due to an imbalance of ions transport. The data obtained show that JBU and Jaburetox 2Ec are acting on Malpighian tubules through different pathways, both leading to antidiuresis. As seen in Malpighian tubules, JBU also decrease the fluid transport across the crop epithelium of R. prolixus. Jaburetox 2Ec and JBU cause an increase of the frequency of crop contractions stimulated with serotonin. In the hindgut, JBU increases the frequency and amplitude of contractions, and alters the muscle basal tonus. In the dorsal vessel, no significant alterations were observed. Using microscopy, we also evaluated the effect of JBU feeding in the release of serotonin, a hormone involved in several physiological processes. There is no alteration in the release of this hormone from nervous system cells, as well as in tissues regulated by serotonin. All these data indicate that JBU and its derived peptide cause major alterations of post feeding physiological process in R. prolixus that contribute to, or can be the cause of the entomotoxic effect. The release of entomotoxic fragment(s) from plant ureases and their mechanism of action are complex processes. Here, we were successful in characterizing several steps of these processes, clarifying crucial points and providing leads for future work in this field.

Urease, uma enzima encontrada em diversas espécies de plantas, catalisa a hidrólise de uréia, formando amônia e dióxido de carbono. Esta enzima é encontrada também em bactérias, fungos e alguns invertebrados e apresenta três domínios: alfa, beta e gama. Em Canavalia ensiformis, foram descritas mais de uma isoforma de urease: a urease clássica JBU (Jack bean urease - cDNA e proteína), o cDNA jbure-II e a proteína canatoxina. A sequência jbure-II, obtida previamente, codificava uma proteína hipotética incompleta nos domínios alfa e gama (correspondentes as regiões terminais 5´ e 3´ do cDNA). Neste trabalho, demonstramos a clonagem de um cDNA denominado jbure-IIB, que codifica uma proteína predita com os domínios completos. Análises filogenéticas e modelagem molecular da proteína predita foram realizadas. A estrutura proposta para a proteína hipotética JBURE-IIB possui uma forma similar às das ureases bacterianas, exceto pela presença de duas regiões de ligação, que conectam os três domínios das ureases, ausentes nas ureases bacterianas. Todos os resíduos críticos para a atividade ureásica foram detectados. Em seguida, o cDNA completo de jbure-IIB foi obtido através de sobreposição dos fragmentos clonados (5’, interno e 3’), utilizando uma técnica de “PCR overlap” modificada. O cDNA foi clonado no vetor pET101, a proteína heteróloga foi produzida em Escherichia coli e sua presença confirmada por análises de Western blot. A atividade da urease recombinante foi observada em placas das colônias transformadas induzidas, na presença de uréia e níquel. A proteína canatoxina apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos. Sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) pelas catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Baseado na seqüência N-terminal e tamanho de pepcanatox, projetamos oligonucleotideos para amplificar um fragmento de 270 pb, usando o cDNA jbure-II como molde. Este fragmento, denominado jaburetox-2 (“Jack bean urease toxin 2”) foi clonado em vetor pET101 e expresso em E. coli. O peptídeo recombinante foi denominado jaburetox-2Ec (“Jack bean urease toxin 2” expresso em células de E. coli, contendo uma metionina inicial e acrescido, na região Cxiii terminal, do epitopo V-5 e seis resíduos de Histidina). Sua atividade inseticida foi testada contra ninfas de Dysdercus peruvianus e larvas de Spodoptera frugiperda, obtendo-se 100% de mortalidade. Em seguida, cultivou-se a bactéria recombinante em biorreatores para obtenção de grandes quantidades de peptídeo, que foi purificado e testado contra Rhodnius prolixus (4º instars) e Triatoma infestans (5º instars e adultos). A injeção de jaburetox-2Ec (1 μg/mg de peso vivo do inseto) resultou em 100% de mortalidade. Em contraste, altas doses do peptídeo foram inócuas quando injetadas ou ingeridas por ratos neonatos e camundongos. Corroborando com estes resultados, a modelagem molecular “ab initio” de jaburetox-2Ec revelou um motivo de “grampo beta” consistente com atividade inseticida, possivelmente baseada em neurotoxicidade ou alteração de permeabilidade celular. Adicionalmente, plantas de tabaco foram transformadas com o vetor pCAMBIA contendo o fragmento de cDNA jaburetox-2 (acrescido de um códon de iniciação e um códon de terminação da tradução) e as plantas transformadas, PCR positivas, foram testadas contra S. frugiperda. Realizou-se alimentação direta com as folhas de tabaco e observaram-se diferentes níveis de mortalidade (50-100%), provocadas por diferentes plantas, após 15-30 dias. O conjunto de dados desta tese demonstra o potencial uso de jaburetox-2 como um transgene para construção de plantas resistentes a insetos e contribui para elucidação do mecanismo de ação da atividade inseticida de ureases, bem como seu possível papel na defesa da planta. / Urease, an ubiquitous enzyme in plants, catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Urease is also found in bacteria, fungi and some invertebrates. In Canavalia ensiformis there are more than one isoform of urease: the classic JBU (the major isoform), JBURE-II and the protein Canatoxin. In a previous study, a partial sequence of jbure-II was obtained that putatively codify for an enzyme incomplete at the alfa and gamma domains. In this work, we report the cloning of a cDNA named jbure-IIB, encoding a complete urease protein with the expected 90 kDa size. Phylogenetic studies of the urease sequence and the molecular modeling of the putative protein are also presented. Its modeled structure has an overall shape similar to that of related bacterial ureases except for the presence of two linking regions that connect the three domains of ureases. All critical residues for urease activity are present. The complete cDNA was obtained by overlapping the three parts of cloned cDNA (5’, middle part and 3’) using a modified PCR overlap technique. The cDNA was cloned into PET101 vector and the heterologous protein was produced in Escherichia coli cells and confirmed by Western blot analyses. The activity of the recombinant urease was observed in a urea segregation agar containing urea and nickel. Canatoxin displays insecticidal activity against different insect species. The entomotoxicity relies on an internal 10 kDa peptide (pepcanatox), released by hydrolysis of Canatoxin by cathepsins in the digestive system of susceptible insects. Here, based on the N-terminal sequence of pepcanatox, we designed primers to amplify by PCR a 270-bp fragment corresponding to pepcanatox using jbure-II cDNA as a template. This amplicon named jaburetox-2 (“jack bean urease toxin 2”) was cloned into pET101 vector and expressed in E. coli. The recombinant peptide was named jaburetox-2Ec and its insecticidal effect was demonstrated against Dysdercus peruvianus and Spodoptera frugiperda larvaes, in which it induced 100% mortality. Bacterial cultivation in bioreactors was carried out with lactose as inducer to obtain large amounts of recombinant peptide. It was tested against Rhodnius prolixus (4th instars) and Triatoma infestans (5th instars and xv adults) by injection and 1 μg/mg insect body weight resulted in 100% mortality. In contrast, high doses of jaburetox-2Ec were innocuous when injected or ingested by mice and neonate rats. Modeling of jaburetox-2Ec, and comparison with other peptide structures, revealed a prominent β-hairpin motif consistent with an insecticidal activity based on either neurotoxicity or alteration of cell permeability. Finally, tobacco plants were transformed with pCAMBIA vector containing the jaburetox-2 fragment (with a start and a stop codon) and the transformed plants were tested against S. frugiperda. Mortality varying from 50-100% of the insects feeding on different transformed plants was observed after 15-30 days. Our results showed the potential use of jaburetox-2 as transgene to engineering insect resistance into plant and contribute to elucidation of mechanisms of action of urease insecticidal activity, as well as its possible role in plant defense.

Ureases são enzimas altamente homólogas, encontradas em plantas, bactérias e fungos. A urease de feijão de porco, Canavalia ensiformis, foi a primeira enzima a ser cristalizada e também a primeira cuja presença de níquel foi demonstrada. Canatoxina, uma isoforma da urease de C. ensiformis, apresenta diversas atividades biológicas, além de sua atividade ureolítica: 1) atividade inseticida; 2) efeito secretagogo e pró-agregante em plaquetas de coelho; 3) ligação a glicoconjugados que contém ácido siálico; 4) atividade pró-inflamatória. Esses efeitos são independentes de sua atividade hidrolítica sobre a uréia, e envolvem ativação do metabolismo de eicosanóides e canais de cálcio. Outras ureases compartilham algumas atividades biológicas da canatoxina, como indução de agregação plaquetária por ureases de vegetais e de Bacillus pasteurii, e efeito inseticida, uma propriedade só encontrada para as ureases de plantas. Ureases microbianas contribuem para a patogênese de cálculos urinários, pielonefrites, incrustação de cateter, úlcera péptica e, possivelmente, tumores gástricos. Helicobacter pylori, uma bactéria Gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica, causa úlcera péptica e carcinoma gástrico distal por um mecanismo ainda não completamente elucidado até o momento. Neste trabalho ureases de bactérias são estudadas, objetivando investigar se elas apresentam alguns dos efeitos biológicos descritos para a canatoxina. Foi demonstrado que as ureases recombinante de H. pylori e nativa de B. pasteurii induzem agregação de plaquetas de coelho por um mecanismo, similar ao da canatoxina, mediado por eicosanóides derivados da via da lipoxigenase. Os efeitos pró-inflamatórios da urease de H. pylori são também similares ao apresentado pela canatoxina e mediados pelo mesmo mecanismo de sinalização. Esses resultados contribuem para o entendimento da fisiopatologia de distúrbios causados por organismos produtores de urease. / Ureases are highly homologous enzymes found in plants, bacteria and fungi. Urease of the jackbean, Canavalia ensiformis, was the first enzyme ever crystallized and also the first enzyme shown to contain nickel. Canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents several other biological effects besides its ureolytic property: 1) insecticidal effect; 2) pro-aggregating activity in rabbit platelets; 3) binding to sialic acid-containing glycoconjugates; 4) pro-inflammatory activity. These effects are independent of urea hydrolysis and require activation of the eicosanoid metabolism and calcium channels. Other ureases have some of biological activities described for canatoxin, such as induction of platelet aggregation by jackbean and soybean ureases, and also Bacillus pasteurii urease, while insecticidal effects were seen only for plant-derived ureases. Microbial ureases play a role in the pathogenesis of urinary stones, pyelonephritis, urinary catheter incrustation, peptic ulceration and possibly in gastric tumors. Helicobacter pylori, a Gram-negative bacterium that colonizes the human stomach mucosa, causes gastric ulcers and cancer through a mechanism not yet fully elucidated. In this work we studied bacterial ureases to find out if they present some of the biological properties described for canatoxin. We demonstrate that a recombinant Helicobacter pylori urease and a native Bacillus pasteurii urease induce aggregation of rabbit platelets by a mechanism similar to that recruited by canatoxin, involving mediation by lipoxygenase-derived eicosanoids. H. pylori urease also induces pro-inflammatory effects similar to those presented by canatoxin and are mediated by the same signalling pathway. These findings may contribute to the enlightening of physiopathology of diseases promoted by ureaseproducing bacteria.

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas distribuídas em plantas, fungos e bactérias. As duas isoformas de ureases de Canavalia ensiformis (canatoxina - CNTX e urease do feijão de porco - JBU) são altamente tóxicas para insetos de diferentes ordens. A toxicidade dessas proteínas é dependente da liberação de um fragmento de cerca de 10 kDa a partir da proteína nativa. Essa liberação se dá por ação das enzimas digestivas cisteínicas e aspárticas (tipo catepsina B e D) presentes no trato digestivo de algumas ordens de insetos. Ureases não são tóxicas para insetos com digestão baseada em enzimas serínicas (tipo tripsina). Esse peptídeo de 10 kDa foi isolado e caracterizado, recebendo o nome de Pepcanatox. Um peptídeo recombinante, equivalente ao Pepcanatox, foi expresso em Escherichia coli e chamado Jaburetox 2Ec. Jaburetox 2Ec é tóxico, por via oral, para ninfas de Dysdercus peruvianus e, por injeção toráxica, para ninfas de Rhodnius prolixus e ninfas e adultos de Triatoma infestans. CNTX e JBU, dados por via oral, são tóxicos para ninfas de D. peruvianus e R. prolixus, mas não são tóxicas para as formas adultas desses insetos.O processamento de CNTX e JBU por enzimas de ninfas e adultos de D. peruvianus mostraram um perfil distinto, podendo ser esse diferencial o responsável pela falta de efeito tóxico observado em adultos. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. A purificação parcial das enzimas de C. maculatus por gel-filtração resultou em uma fração (Pico B) capaz de liberar um peptídeo de aproximadamente 10 kDa a partir de CNTX e JBU. A atividade proteolítica do Pico B é completamente inibida por Pep-A e parcialmente inibida por E-64, indicando a presença de aspártico (majoritária) e cisteíno proteases. Observamos que tanto E-64 (inibidor de cisteíno proteinases) quanto Pepstatina-A (inibidor de aspártico proteinases) diminuem a formação do peptídeo entomotóxico pelo Pico B, sugerindo que cisteíno e aspártico proteases estão envolvidas nesse processo.O mecanismo de ação em insetos das ureases, assim como dos peptídeos derivados, ainda não é conhecido. Um efeito observado in vivo é a diminuição da taxa de perda de peso de R. prolixus após a alimentação com ureases, indicando uma possível alteração no sistema excretório. Para avaliar o efeito das ureases e de Jaburetox 2Ec na secreção de R. prolixus, realizamos ensaios de secreção de fluídos pelos túbulos de Malpighi isolados, assim como ensaios de contrações dos intestinos anterior e posterior e vaso dorsal. JBU e Jaburetox 2Ec inibem a secreção de fluídos por túbulos de Malpighi isolados, de maneira dose dependente. CNTX também tem efeito antidiurético, enquando a urease de Helicobacter pylori (HPU) não causa nenhuma alteração na secreção dos túbulos de Malpighi. Jaburetox 2Ec, mas não JBU, causa um aumento dos níveis de GMPc nos túbulos sendo esse o segundo mensageiro de sua ação.Metabólitos de eicosanóides e cálcio (intra e extracelular) influenciam a ação de JBU, mas não de Jaburetox 2Ec. Ensaios de potencial transepitelial realizados com túbulos de Malpighi indicaram que Jaburetox 2Ec, mas não JBU, alteram a ação de uma H+-ATPase presente na membrana dos túbulos, causando um desequilíbrio no transporte iônico e, como consequência, alteração na secreção de fluídos. Os dados obtidos não mostram que JBU e Jaburetox 2Ec desencadeiam rotas distintas nos túbulos de Malpighi, ambos culminando em antidiurese. Assim como nos túbulos de Malpighi, JBU diminui o transporte de fluídos pelo epitélio do estômago de R. prolixus. Jaburetox 2Ec e JBU causam um aumento na frequência de contrações do estômago estimuladas por serotonina. No intestino posterior, observamos que JBU também causa um aumento na frequência e amplitude das contrações, e mudança no tônus basal do tecido. No vaso dorsal, nenhuma alteração significativa nas contrações foram observadas. Também avaliamos por microscopia o efeito da alimentação com JBU na liberação de serotonina, hormônio envolvido em diversos processos fisiológicos. Não observamos nenhuma alteração significativa na liberação desse hormônio a partir das células do sistema nervoso, assim como nos órgãos controlados por serotonina. A liberação de fragmento(s) entomotóxico(s) a partir de ureases vegetais, assim como o mecanismo de ação dessas ureases e fragmentos, são processosbastante complexos. Nessa tese tivemos êxito em caracterizar várias etapas desses processos, esclarecendo pontos chaves e levantando evidências para guiar trabalhos futuros. / Ureases (E.C. 3.5.1.5) are metalloenzymes widespread in plants, fungi and bacteria. Two isoforms of Canavalia ensiformis urease, (canatoxin - CNTX and jack bean urease – JBU), are toxic to insects from different orders. The toxicity of these proteins is due to the release of a 10 kDa peptide from the native protein. This release is due to the action of acidic digestive enzymes present in the insect digestive tract. Ureases are not toxic to insects with digestion relying on trypsin-like enzymes. The entomotoxic peptide, called Pepcanatox, was isolated and characterized and a recombinant peptide, equivalent to Pepcanatox was expressed in Escherichia coli. Jaburetox 2Ec, the recombinant peptide, is toxic by oral route to nymphs of Dysdercus peruvianus and by injection to nymphs of Rhodnius prolixus and nymphs and adults of Triatoma infestans. CNTX and JBU, administered by oral route, are toxic to nymphs of D. peruvianus and R. prolixus, but are innocuous to adults of these insects. Proteolytic processing of JBU and CNTX by digestive enzymes from D. peruvianus nymphs and adults showed a distinct profile. This differential processing could be related to the lack of toxic effect of the proteins in adults.Using Callosobruchus maculatus as a model, the digestive enzymes involved in urease’s processing were investigated. The partial purification of C. maculatus enzymes resulted in a protein fraction (Pool B) capable of releasing a 10kDa peptide from JBU and CNTX. The proteolytic activity of Pool B was completely abolished by Pep-A and partially inhibited by E-64, indicating the presence of aspartic (majoritary) and cysteine proteinases. Both E-64 and Pep-A decrease the formation of the entomotoxic peptide, suggesting that both classes of enzymes may be involved in this process. The purification of the enzymes present on Pool B will clarify the role of each of these enzymes on urease processing and release of the entomotoxic peptide. The mechanisms of action of ureases as well as urease-derived peptides in insects is still poorly characterized. A lower rate of weight loss in R. prolixus fed on a urease-containing meal was observed in vivo, indicating a possible alteration on theexcretory system. To evaluate the effect of ureases and Jaburetox 2Ec on R. prolixus excretion, we performed fluid secretion assays on isolated Malpighian tubules, as well as fore- and hindgut contractions assays. JBU and Jaburetox 2Ec inhibit Malpighian tubules fluid secretion in a dose dependent fashion. CNTX is also antidiuretic, while Helicobacter pylori urease (HPU) does not alter the secretion rate. Jaburetox 2Ec, but not JBU, increases tubules levels of cGMP. No changes in AMPc was seen with either polypeptide. Eicosanoid metabolites and calcium (intra- and extracellular) modulate the antidiuretic effect of JBU, but not that of Jaburetox 2Ec. Measurements of the transepithelial potential in Malpighian tubules indicated that Jaburetox 2Ec, but not JBU, disrupts the activity of a H+-ATPase present on tubules’ membranes, causing changes in fluid secretion due to an imbalance of ions transport. The data obtained show that JBU and Jaburetox 2Ec are acting on Malpighian tubules through different pathways, both leading to antidiuresis. As seen in Malpighian tubules, JBU also decrease the fluid transport across the crop epithelium of R. prolixus. Jaburetox 2Ec and JBU cause an increase of the frequency of crop contractions stimulated with serotonin. In the hindgut, JBU increases the frequency and amplitude of contractions, and alters the muscle basal tonus. In the dorsal vessel, no significant alterations were observed. Using microscopy, we also evaluated the effect of JBU feeding in the release of serotonin, a hormone involved in several physiological processes. There is no alteration in the release of this hormone from nervous system cells, as well as in tissues regulated by serotonin. All these data indicate that JBU and its derived peptide cause major alterations of post feeding physiological process in R. prolixus that contribute to, or can be the cause of the entomotoxic effect. The release of entomotoxic fragment(s) from plant ureases and their mechanism of action are complex processes. Here, we were successful in characterizing several steps of these processes, clarifying crucial points and providing leads for future work in this field.

Urease, uma enzima encontrada em diversas espécies de plantas, catalisa a hidrólise de uréia, formando amônia e dióxido de carbono. Esta enzima é encontrada também em bactérias, fungos e alguns invertebrados e apresenta três domínios: alfa, beta e gama. Em Canavalia ensiformis, foram descritas mais de uma isoforma de urease: a urease clássica JBU (Jack bean urease - cDNA e proteína), o cDNA jbure-II e a proteína canatoxina. A sequência jbure-II, obtida previamente, codificava uma proteína hipotética incompleta nos domínios alfa e gama (correspondentes as regiões terminais 5´ e 3´ do cDNA). Neste trabalho, demonstramos a clonagem de um cDNA denominado jbure-IIB, que codifica uma proteína predita com os domínios completos. Análises filogenéticas e modelagem molecular da proteína predita foram realizadas. A estrutura proposta para a proteína hipotética JBURE-IIB possui uma forma similar às das ureases bacterianas, exceto pela presença de duas regiões de ligação, que conectam os três domínios das ureases, ausentes nas ureases bacterianas. Todos os resíduos críticos para a atividade ureásica foram detectados. Em seguida, o cDNA completo de jbure-IIB foi obtido através de sobreposição dos fragmentos clonados (5’, interno e 3’), utilizando uma técnica de “PCR overlap” modificada. O cDNA foi clonado no vetor pET101, a proteína heteróloga foi produzida em Escherichia coli e sua presença confirmada por análises de Western blot. A atividade da urease recombinante foi observada em placas das colônias transformadas induzidas, na presença de uréia e níquel. A proteína canatoxina apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos. Sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) pelas catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Baseado na seqüência N-terminal e tamanho de pepcanatox, projetamos oligonucleotideos para amplificar um fragmento de 270 pb, usando o cDNA jbure-II como molde. Este fragmento, denominado jaburetox-2 (“Jack bean urease toxin 2”) foi clonado em vetor pET101 e expresso em E. coli. O peptídeo recombinante foi denominado jaburetox-2Ec (“Jack bean urease toxin 2” expresso em células de E. coli, contendo uma metionina inicial e acrescido, na região Cxiii terminal, do epitopo V-5 e seis resíduos de Histidina). Sua atividade inseticida foi testada contra ninfas de Dysdercus peruvianus e larvas de Spodoptera frugiperda, obtendo-se 100% de mortalidade. Em seguida, cultivou-se a bactéria recombinante em biorreatores para obtenção de grandes quantidades de peptídeo, que foi purificado e testado contra Rhodnius prolixus (4º instars) e Triatoma infestans (5º instars e adultos). A injeção de jaburetox-2Ec (1 μg/mg de peso vivo do inseto) resultou em 100% de mortalidade. Em contraste, altas doses do peptídeo foram inócuas quando injetadas ou ingeridas por ratos neonatos e camundongos. Corroborando com estes resultados, a modelagem molecular “ab initio” de jaburetox-2Ec revelou um motivo de “grampo beta” consistente com atividade inseticida, possivelmente baseada em neurotoxicidade ou alteração de permeabilidade celular. Adicionalmente, plantas de tabaco foram transformadas com o vetor pCAMBIA contendo o fragmento de cDNA jaburetox-2 (acrescido de um códon de iniciação e um códon de terminação da tradução) e as plantas transformadas, PCR positivas, foram testadas contra S. frugiperda. Realizou-se alimentação direta com as folhas de tabaco e observaram-se diferentes níveis de mortalidade (50-100%), provocadas por diferentes plantas, após 15-30 dias. O conjunto de dados desta tese demonstra o potencial uso de jaburetox-2 como um transgene para construção de plantas resistentes a insetos e contribui para elucidação do mecanismo de ação da atividade inseticida de ureases, bem como seu possível papel na defesa da planta. / Urease, an ubiquitous enzyme in plants, catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Urease is also found in bacteria, fungi and some invertebrates. In Canavalia ensiformis there are more than one isoform of urease: the classic JBU (the major isoform), JBURE-II and the protein Canatoxin. In a previous study, a partial sequence of jbure-II was obtained that putatively codify for an enzyme incomplete at the alfa and gamma domains. In this work, we report the cloning of a cDNA named jbure-IIB, encoding a complete urease protein with the expected 90 kDa size. Phylogenetic studies of the urease sequence and the molecular modeling of the putative protein are also presented. Its modeled structure has an overall shape similar to that of related bacterial ureases except for the presence of two linking regions that connect the three domains of ureases. All critical residues for urease activity are present. The complete cDNA was obtained by overlapping the three parts of cloned cDNA (5’, middle part and 3’) using a modified PCR overlap technique. The cDNA was cloned into PET101 vector and the heterologous protein was produced in Escherichia coli cells and confirmed by Western blot analyses. The activity of the recombinant urease was observed in a urea segregation agar containing urea and nickel. Canatoxin displays insecticidal activity against different insect species. The entomotoxicity relies on an internal 10 kDa peptide (pepcanatox), released by hydrolysis of Canatoxin by cathepsins in the digestive system of susceptible insects. Here, based on the N-terminal sequence of pepcanatox, we designed primers to amplify by PCR a 270-bp fragment corresponding to pepcanatox using jbure-II cDNA as a template. This amplicon named jaburetox-2 (“jack bean urease toxin 2”) was cloned into pET101 vector and expressed in E. coli. The recombinant peptide was named jaburetox-2Ec and its insecticidal effect was demonstrated against Dysdercus peruvianus and Spodoptera frugiperda larvaes, in which it induced 100% mortality. Bacterial cultivation in bioreactors was carried out with lactose as inducer to obtain large amounts of recombinant peptide. It was tested against Rhodnius prolixus (4th instars) and Triatoma infestans (5th instars and xv adults) by injection and 1 μg/mg insect body weight resulted in 100% mortality. In contrast, high doses of jaburetox-2Ec were innocuous when injected or ingested by mice and neonate rats. Modeling of jaburetox-2Ec, and comparison with other peptide structures, revealed a prominent β-hairpin motif consistent with an insecticidal activity based on either neurotoxicity or alteration of cell permeability. Finally, tobacco plants were transformed with pCAMBIA vector containing the jaburetox-2 fragment (with a start and a stop codon) and the transformed plants were tested against S. frugiperda. Mortality varying from 50-100% of the insects feeding on different transformed plants was observed after 15-30 days. Our results showed the potential use of jaburetox-2 as transgene to engineering insect resistance into plant and contribute to elucidation of mechanisms of action of urease insecticidal activity, as well as its possible role in plant defense.

Ureases são enzimas altamente homólogas, encontradas em plantas, bactérias e fungos. A urease de feijão de porco, Canavalia ensiformis, foi a primeira enzima a ser cristalizada e também a primeira cuja presença de níquel foi demonstrada. Canatoxina, uma isoforma da urease de C. ensiformis, apresenta diversas atividades biológicas, além de sua atividade ureolítica: 1) atividade inseticida; 2) efeito secretagogo e pró-agregante em plaquetas de coelho; 3) ligação a glicoconjugados que contém ácido siálico; 4) atividade pró-inflamatória. Esses efeitos são independentes de sua atividade hidrolítica sobre a uréia, e envolvem ativação do metabolismo de eicosanóides e canais de cálcio. Outras ureases compartilham algumas atividades biológicas da canatoxina, como indução de agregação plaquetária por ureases de vegetais e de Bacillus pasteurii, e efeito inseticida, uma propriedade só encontrada para as ureases de plantas. Ureases microbianas contribuem para a patogênese de cálculos urinários, pielonefrites, incrustação de cateter, úlcera péptica e, possivelmente, tumores gástricos. Helicobacter pylori, uma bactéria Gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica, causa úlcera péptica e carcinoma gástrico distal por um mecanismo ainda não completamente elucidado até o momento. Neste trabalho ureases de bactérias são estudadas, objetivando investigar se elas apresentam alguns dos efeitos biológicos descritos para a canatoxina. Foi demonstrado que as ureases recombinante de H. pylori e nativa de B. pasteurii induzem agregação de plaquetas de coelho por um mecanismo, similar ao da canatoxina, mediado por eicosanóides derivados da via da lipoxigenase. Os efeitos pró-inflamatórios da urease de H. pylori são também similares ao apresentado pela canatoxina e mediados pelo mesmo mecanismo de sinalização. Esses resultados contribuem para o entendimento da fisiopatologia de distúrbios causados por organismos produtores de urease. / Ureases are highly homologous enzymes found in plants, bacteria and fungi. Urease of the jackbean, Canavalia ensiformis, was the first enzyme ever crystallized and also the first enzyme shown to contain nickel. Canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents several other biological effects besides its ureolytic property: 1) insecticidal effect; 2) pro-aggregating activity in rabbit platelets; 3) binding to sialic acid-containing glycoconjugates; 4) pro-inflammatory activity. These effects are independent of urea hydrolysis and require activation of the eicosanoid metabolism and calcium channels. Other ureases have some of biological activities described for canatoxin, such as induction of platelet aggregation by jackbean and soybean ureases, and also Bacillus pasteurii urease, while insecticidal effects were seen only for plant-derived ureases. Microbial ureases play a role in the pathogenesis of urinary stones, pyelonephritis, urinary catheter incrustation, peptic ulceration and possibly in gastric tumors. Helicobacter pylori, a Gram-negative bacterium that colonizes the human stomach mucosa, causes gastric ulcers and cancer through a mechanism not yet fully elucidated. In this work we studied bacterial ureases to find out if they present some of the biological properties described for canatoxin. We demonstrate that a recombinant Helicobacter pylori urease and a native Bacillus pasteurii urease induce aggregation of rabbit platelets by a mechanism similar to that recruited by canatoxin, involving mediation by lipoxygenase-derived eicosanoids. H. pylori urease also induces pro-inflammatory effects similar to those presented by canatoxin and are mediated by the same signalling pathway. These findings may contribute to the enlightening of physiopathology of diseases promoted by ureaseproducing bacteria.

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas distribuídas em plantas, fungos e bactérias. As duas isoformas de ureases de Canavalia ensiformis (canatoxina - CNTX e urease do feijão de porco - JBU) são altamente tóxicas para insetos de diferentes ordens. A toxicidade dessas proteínas é dependente da liberação de um fragmento de cerca de 10 kDa a partir da proteína nativa. Essa liberação se dá por ação das enzimas digestivas cisteínicas e aspárticas (tipo catepsina B e D) presentes no trato digestivo de algumas ordens de insetos. Ureases não são tóxicas para insetos com digestão baseada em enzimas serínicas (tipo tripsina). Esse peptídeo de 10 kDa foi isolado e caracterizado, recebendo o nome de Pepcanatox. Um peptídeo recombinante, equivalente ao Pepcanatox, foi expresso em Escherichia coli e chamado Jaburetox 2Ec. Jaburetox 2Ec é tóxico, por via oral, para ninfas de Dysdercus peruvianus e, por injeção toráxica, para ninfas de Rhodnius prolixus e ninfas e adultos de Triatoma infestans. CNTX e JBU, dados por via oral, são tóxicos para ninfas de D. peruvianus e R. prolixus, mas não são tóxicas para as formas adultas desses insetos.O processamento de CNTX e JBU por enzimas de ninfas e adultos de D. peruvianus mostraram um perfil distinto, podendo ser esse diferencial o responsável pela falta de efeito tóxico observado em adultos. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. A purificação parcial das enzimas de C. maculatus por gel-filtração resultou em uma fração (Pico B) capaz de liberar um peptídeo de aproximadamente 10 kDa a partir de CNTX e JBU. A atividade proteolítica do Pico B é completamente inibida por Pep-A e parcialmente inibida por E-64, indicando a presença de aspártico (majoritária) e cisteíno proteases. Observamos que tanto E-64 (inibidor de cisteíno proteinases) quanto Pepstatina-A (inibidor de aspártico proteinases) diminuem a formação do peptídeo entomotóxico pelo Pico B, sugerindo que cisteíno e aspártico proteases estão envolvidas nesse processo.O mecanismo de ação em insetos das ureases, assim como dos peptídeos derivados, ainda não é conhecido. Um efeito observado in vivo é a diminuição da taxa de perda de peso de R. prolixus após a alimentação com ureases, indicando uma possível alteração no sistema excretório. Para avaliar o efeito das ureases e de Jaburetox 2Ec na secreção de R. prolixus, realizamos ensaios de secreção de fluídos pelos túbulos de Malpighi isolados, assim como ensaios de contrações dos intestinos anterior e posterior e vaso dorsal. JBU e Jaburetox 2Ec inibem a secreção de fluídos por túbulos de Malpighi isolados, de maneira dose dependente. CNTX também tem efeito antidiurético, enquando a urease de Helicobacter pylori (HPU) não causa nenhuma alteração na secreção dos túbulos de Malpighi. Jaburetox 2Ec, mas não JBU, causa um aumento dos níveis de GMPc nos túbulos sendo esse o segundo mensageiro de sua ação.Metabólitos de eicosanóides e cálcio (intra e extracelular) influenciam a ação de JBU, mas não de Jaburetox 2Ec. Ensaios de potencial transepitelial realizados com túbulos de Malpighi indicaram que Jaburetox 2Ec, mas não JBU, alteram a ação de uma H+-ATPase presente na membrana dos túbulos, causando um desequilíbrio no transporte iônico e, como consequência, alteração na secreção de fluídos. Os dados obtidos não mostram que JBU e Jaburetox 2Ec desencadeiam rotas distintas nos túbulos de Malpighi, ambos culminando em antidiurese. Assim como nos túbulos de Malpighi, JBU diminui o transporte de fluídos pelo epitélio do estômago de R. prolixus. Jaburetox 2Ec e JBU causam um aumento na frequência de contrações do estômago estimuladas por serotonina. No intestino posterior, observamos que JBU também causa um aumento na frequência e amplitude das contrações, e mudança no tônus basal do tecido. No vaso dorsal, nenhuma alteração significativa nas contrações foram observadas. Também avaliamos por microscopia o efeito da alimentação com JBU na liberação de serotonina, hormônio envolvido em diversos processos fisiológicos. Não observamos nenhuma alteração significativa na liberação desse hormônio a partir das células do sistema nervoso, assim como nos órgãos controlados por serotonina. A liberação de fragmento(s) entomotóxico(s) a partir de ureases vegetais, assim como o mecanismo de ação dessas ureases e fragmentos, são processosbastante complexos. Nessa tese tivemos êxito em caracterizar várias etapas desses processos, esclarecendo pontos chaves e levantando evidências para guiar trabalhos futuros. / Ureases (E.C. 3.5.1.5) are metalloenzymes widespread in plants, fungi and bacteria. Two isoforms of Canavalia ensiformis urease, (canatoxin - CNTX and jack bean urease – JBU), are toxic to insects from different orders. The toxicity of these proteins is due to the release of a 10 kDa peptide from the native protein. This release is due to the action of acidic digestive enzymes present in the insect digestive tract. Ureases are not toxic to insects with digestion relying on trypsin-like enzymes. The entomotoxic peptide, called Pepcanatox, was isolated and characterized and a recombinant peptide, equivalent to Pepcanatox was expressed in Escherichia coli. Jaburetox 2Ec, the recombinant peptide, is toxic by oral route to nymphs of Dysdercus peruvianus and by injection to nymphs of Rhodnius prolixus and nymphs and adults of Triatoma infestans. CNTX and JBU, administered by oral route, are toxic to nymphs of D. peruvianus and R. prolixus, but are innocuous to adults of these insects. Proteolytic processing of JBU and CNTX by digestive enzymes from D. peruvianus nymphs and adults showed a distinct profile. This differential processing could be related to the lack of toxic effect of the proteins in adults.Using Callosobruchus maculatus as a model, the digestive enzymes involved in urease’s processing were investigated. The partial purification of C. maculatus enzymes resulted in a protein fraction (Pool B) capable of releasing a 10kDa peptide from JBU and CNTX. The proteolytic activity of Pool B was completely abolished by Pep-A and partially inhibited by E-64, indicating the presence of aspartic (majoritary) and cysteine proteinases. Both E-64 and Pep-A decrease the formation of the entomotoxic peptide, suggesting that both classes of enzymes may be involved in this process. The purification of the enzymes present on Pool B will clarify the role of each of these enzymes on urease processing and release of the entomotoxic peptide. The mechanisms of action of ureases as well as urease-derived peptides in insects is still poorly characterized. A lower rate of weight loss in R. prolixus fed on a urease-containing meal was observed in vivo, indicating a possible alteration on theexcretory system. To evaluate the effect of ureases and Jaburetox 2Ec on R. prolixus excretion, we performed fluid secretion assays on isolated Malpighian tubules, as well as fore- and hindgut contractions assays. JBU and Jaburetox 2Ec inhibit Malpighian tubules fluid secretion in a dose dependent fashion. CNTX is also antidiuretic, while Helicobacter pylori urease (HPU) does not alter the secretion rate. Jaburetox 2Ec, but not JBU, increases tubules levels of cGMP. No changes in AMPc was seen with either polypeptide. Eicosanoid metabolites and calcium (intra- and extracellular) modulate the antidiuretic effect of JBU, but not that of Jaburetox 2Ec. Measurements of the transepithelial potential in Malpighian tubules indicated that Jaburetox 2Ec, but not JBU, disrupts the activity of a H+-ATPase present on tubules’ membranes, causing changes in fluid secretion due to an imbalance of ions transport. The data obtained show that JBU and Jaburetox 2Ec are acting on Malpighian tubules through different pathways, both leading to antidiuresis. As seen in Malpighian tubules, JBU also decrease the fluid transport across the crop epithelium of R. prolixus. Jaburetox 2Ec and JBU cause an increase of the frequency of crop contractions stimulated with serotonin. In the hindgut, JBU increases the frequency and amplitude of contractions, and alters the muscle basal tonus. In the dorsal vessel, no significant alterations were observed. Using microscopy, we also evaluated the effect of JBU feeding in the release of serotonin, a hormone involved in several physiological processes. There is no alteration in the release of this hormone from nervous system cells, as well as in tissues regulated by serotonin. All these data indicate that JBU and its derived peptide cause major alterations of post feeding physiological process in R. prolixus that contribute to, or can be the cause of the entomotoxic effect. The release of entomotoxic fragment(s) from plant ureases and their mechanism of action are complex processes. Here, we were successful in characterizing several steps of these processes, clarifying crucial points and providing leads for future work in this field.

Urease, uma enzima encontrada em diversas espécies de plantas, catalisa a hidrólise de uréia, formando amônia e dióxido de carbono. Esta enzima é encontrada também em bactérias, fungos e alguns invertebrados e apresenta três domínios: alfa, beta e gama. Em Canavalia ensiformis, foram descritas mais de uma isoforma de urease: a urease clássica JBU (Jack bean urease - cDNA e proteína), o cDNA jbure-II e a proteína canatoxina. A sequência jbure-II, obtida previamente, codificava uma proteína hipotética incompleta nos domínios alfa e gama (correspondentes as regiões terminais 5´ e 3´ do cDNA). Neste trabalho, demonstramos a clonagem de um cDNA denominado jbure-IIB, que codifica uma proteína predita com os domínios completos. Análises filogenéticas e modelagem molecular da proteína predita foram realizadas. A estrutura proposta para a proteína hipotética JBURE-IIB possui uma forma similar às das ureases bacterianas, exceto pela presença de duas regiões de ligação, que conectam os três domínios das ureases, ausentes nas ureases bacterianas. Todos os resíduos críticos para a atividade ureásica foram detectados. Em seguida, o cDNA completo de jbure-IIB foi obtido através de sobreposição dos fragmentos clonados (5’, interno e 3’), utilizando uma técnica de “PCR overlap” modificada. O cDNA foi clonado no vetor pET101, a proteína heteróloga foi produzida em Escherichia coli e sua presença confirmada por análises de Western blot. A atividade da urease recombinante foi observada em placas das colônias transformadas induzidas, na presença de uréia e níquel. A proteína canatoxina apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos. Sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) pelas catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Baseado na seqüência N-terminal e tamanho de pepcanatox, projetamos oligonucleotideos para amplificar um fragmento de 270 pb, usando o cDNA jbure-II como molde. Este fragmento, denominado jaburetox-2 (“Jack bean urease toxin 2”) foi clonado em vetor pET101 e expresso em E. coli. O peptídeo recombinante foi denominado jaburetox-2Ec (“Jack bean urease toxin 2” expresso em células de E. coli, contendo uma metionina inicial e acrescido, na região Cxiii terminal, do epitopo V-5 e seis resíduos de Histidina). Sua atividade inseticida foi testada contra ninfas de Dysdercus peruvianus e larvas de Spodoptera frugiperda, obtendo-se 100% de mortalidade. Em seguida, cultivou-se a bactéria recombinante em biorreatores para obtenção de grandes quantidades de peptídeo, que foi purificado e testado contra Rhodnius prolixus (4º instars) e Triatoma infestans (5º instars e adultos). A injeção de jaburetox-2Ec (1 μg/mg de peso vivo do inseto) resultou em 100% de mortalidade. Em contraste, altas doses do peptídeo foram inócuas quando injetadas ou ingeridas por ratos neonatos e camundongos. Corroborando com estes resultados, a modelagem molecular “ab initio” de jaburetox-2Ec revelou um motivo de “grampo beta” consistente com atividade inseticida, possivelmente baseada em neurotoxicidade ou alteração de permeabilidade celular. Adicionalmente, plantas de tabaco foram transformadas com o vetor pCAMBIA contendo o fragmento de cDNA jaburetox-2 (acrescido de um códon de iniciação e um códon de terminação da tradução) e as plantas transformadas, PCR positivas, foram testadas contra S. frugiperda. Realizou-se alimentação direta com as folhas de tabaco e observaram-se diferentes níveis de mortalidade (50-100%), provocadas por diferentes plantas, após 15-30 dias. O conjunto de dados desta tese demonstra o potencial uso de jaburetox-2 como um transgene para construção de plantas resistentes a insetos e contribui para elucidação do mecanismo de ação da atividade inseticida de ureases, bem como seu possível papel na defesa da planta. / Urease, an ubiquitous enzyme in plants, catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Urease is also found in bacteria, fungi and some invertebrates. In Canavalia ensiformis there are more than one isoform of urease: the classic JBU (the major isoform), JBURE-II and the protein Canatoxin. In a previous study, a partial sequence of jbure-II was obtained that putatively codify for an enzyme incomplete at the alfa and gamma domains. In this work, we report the cloning of a cDNA named jbure-IIB, encoding a complete urease protein with the expected 90 kDa size. Phylogenetic studies of the urease sequence and the molecular modeling of the putative protein are also presented. Its modeled structure has an overall shape similar to that of related bacterial ureases except for the presence of two linking regions that connect the three domains of ureases. All critical residues for urease activity are present. The complete cDNA was obtained by overlapping the three parts of cloned cDNA (5’, middle part and 3’) using a modified PCR overlap technique. The cDNA was cloned into PET101 vector and the heterologous protein was produced in Escherichia coli cells and confirmed by Western blot analyses. The activity of the recombinant urease was observed in a urea segregation agar containing urea and nickel. Canatoxin displays insecticidal activity against different insect species. The entomotoxicity relies on an internal 10 kDa peptide (pepcanatox), released by hydrolysis of Canatoxin by cathepsins in the digestive system of susceptible insects. Here, based on the N-terminal sequence of pepcanatox, we designed primers to amplify by PCR a 270-bp fragment corresponding to pepcanatox using jbure-II cDNA as a template. This amplicon named jaburetox-2 (“jack bean urease toxin 2”) was cloned into pET101 vector and expressed in E. coli. The recombinant peptide was named jaburetox-2Ec and its insecticidal effect was demonstrated against Dysdercus peruvianus and Spodoptera frugiperda larvaes, in which it induced 100% mortality. Bacterial cultivation in bioreactors was carried out with lactose as inducer to obtain large amounts of recombinant peptide. It was tested against Rhodnius prolixus (4th instars) and Triatoma infestans (5th instars and xv adults) by injection and 1 μg/mg insect body weight resulted in 100% mortality. In contrast, high doses of jaburetox-2Ec were innocuous when injected or ingested by mice and neonate rats. Modeling of jaburetox-2Ec, and comparison with other peptide structures, revealed a prominent β-hairpin motif consistent with an insecticidal activity based on either neurotoxicity or alteration of cell permeability. Finally, tobacco plants were transformed with pCAMBIA vector containing the jaburetox-2 fragment (with a start and a stop codon) and the transformed plants were tested against S. frugiperda. Mortality varying from 50-100% of the insects feeding on different transformed plants was observed after 15-30 days. Our results showed the potential use of jaburetox-2 as transgene to engineering insect resistance into plant and contribute to elucidation of mechanisms of action of urease insecticidal activity, as well as its possible role in plant defense.

Ureases são enzimas altamente homólogas, encontradas em plantas, bactérias e fungos. A urease de feijão de porco, Canavalia ensiformis, foi a primeira enzima a ser cristalizada e também a primeira cuja presença de níquel foi demonstrada. Canatoxina, uma isoforma da urease de C. ensiformis, apresenta diversas atividades biológicas, além de sua atividade ureolítica: 1) atividade inseticida; 2) efeito secretagogo e pró-agregante em plaquetas de coelho; 3) ligação a glicoconjugados que contém ácido siálico; 4) atividade pró-inflamatória. Esses efeitos são independentes de sua atividade hidrolítica sobre a uréia, e envolvem ativação do metabolismo de eicosanóides e canais de cálcio. Outras ureases compartilham algumas atividades biológicas da canatoxina, como indução de agregação plaquetária por ureases de vegetais e de Bacillus pasteurii, e efeito inseticida, uma propriedade só encontrada para as ureases de plantas. Ureases microbianas contribuem para a patogênese de cálculos urinários, pielonefrites, incrustação de cateter, úlcera péptica e, possivelmente, tumores gástricos. Helicobacter pylori, uma bactéria Gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica, causa úlcera péptica e carcinoma gástrico distal por um mecanismo ainda não completamente elucidado até o momento. Neste trabalho ureases de bactérias são estudadas, objetivando investigar se elas apresentam alguns dos efeitos biológicos descritos para a canatoxina. Foi demonstrado que as ureases recombinante de H. pylori e nativa de B. pasteurii induzem agregação de plaquetas de coelho por um mecanismo, similar ao da canatoxina, mediado por eicosanóides derivados da via da lipoxigenase. Os efeitos pró-inflamatórios da urease de H. pylori são também similares ao apresentado pela canatoxina e mediados pelo mesmo mecanismo de sinalização. Esses resultados contribuem para o entendimento da fisiopatologia de distúrbios causados por organismos produtores de urease. / Ureases are highly homologous enzymes found in plants, bacteria and fungi. Urease of the jackbean, Canavalia ensiformis, was the first enzyme ever crystallized and also the first enzyme shown to contain nickel. Canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents several other biological effects besides its ureolytic property: 1) insecticidal effect; 2) pro-aggregating activity in rabbit platelets; 3) binding to sialic acid-containing glycoconjugates; 4) pro-inflammatory activity. These effects are independent of urea hydrolysis and require activation of the eicosanoid metabolism and calcium channels. Other ureases have some of biological activities described for canatoxin, such as induction of platelet aggregation by jackbean and soybean ureases, and also Bacillus pasteurii urease, while insecticidal effects were seen only for plant-derived ureases. Microbial ureases play a role in the pathogenesis of urinary stones, pyelonephritis, urinary catheter incrustation, peptic ulceration and possibly in gastric tumors. Helicobacter pylori, a Gram-negative bacterium that colonizes the human stomach mucosa, causes gastric ulcers and cancer through a mechanism not yet fully elucidated. In this work we studied bacterial ureases to find out if they present some of the biological properties described for canatoxin. We demonstrate that a recombinant Helicobacter pylori urease and a native Bacillus pasteurii urease induce aggregation of rabbit platelets by a mechanism similar to that recruited by canatoxin, involving mediation by lipoxygenase-derived eicosanoids. H. pylori urease also induces pro-inflammatory effects similar to those presented by canatoxin and are mediated by the same signalling pathway. These findings may contribute to the enlightening of physiopathology of diseases promoted by ureaseproducing bacteria.

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