Altersassoziiert entwickeln Hunde eine Erkrankung, die in vielen Aspekten der Alzheimer-Krankheit des Menschen ähnelt. Das canine kognitive Dysfunktionssyndrom äußert sich klinisch u.a. durch Desorientierung in vertrauter Umgebung, Vergessen von Kommandos und einen gestörten Schlaf-Wach-Rhythmus. Aus der Literatur ist bekannt, dass in den Gehirnen von alten Hunden regelmäßig Aβ- und selten Tauablagerungen zu beobachten sind. Allerdings erfolgte bisher kein Nachweis des hochgradig zytotoxischen und modifizierten pE3Aβ. Auch Veränderungen der mikroglialen Morphologie wurden bisher nicht beschrieben. Insgesamt lagen in dieser Studie 24 euthanasierte Rasse- und Mischlingshunde verschiedenen Alters vor. Fünf dieser Tiere besaßen ein durchschnittliches Alter von 2,1 Jahren und dienten als Kontrollgruppe. Die anderen 19 Hunde waren 8 bis 19 Jahre alt und wurden entsprechend ihrer Größe und des Gewichts in die drei Kategorien kleine (≤ 10 kg), mittelgroße (10 – 25 kg) und große Hunde (> 25 kg) unterteilt. Die Gehirne wurden aus den Schädeln präpariert und in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Anschließend erfolgte die Präparation des frontalen und entorhinalen Kortex sowie der Hippokampusformation, die in 30%iger Saccharoselösung vitrifiziert und mittels Methylbutan bei -80 °C eingefroren wurden. Von den Regionen wurden Kryoschnitte mit einer Dicke von 40 µm angefertigt und diese anhand immunhistologischer Färbungen auf das Vorhandensein von Ablagerungen, bestehend aus den Amyloidsubtypen Aβ8-17 und pE3Aβ, sowie aus hyperphosphorylierten Tau, untersucht. Die Morphologie und das Aktivitätsstadium der Mikroglia wurden mit Antikörpern gegen Iba1 und TAL.1B5 analysiert. Zusätzlich erfolgte eine Untersuchung anhand des Filament Tracer. Stereologische Analysemethoden wurden zur Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen und der Mikroglia angewandt. Disseminierte Plaques fanden sich bereits ab 9 Jahren. In den untersuchten Gehirnregionen von alten Hunden zeichnete sich ein progressiver Verlauf der Ablagerungen ab. Da insbesondere kleinere Hunde ein höheres Alter erreichten als mittelgroße und große Hunde konnten in dieser Kategorie vermehrt Plaques beobachtet werden. Den alten Tieren gemein war, dass in den untersuchten Gehirnregionen pE3Aβ-Plaques häufiger vorlagen als Plaques, die aus Aβ8-17 bestanden. Kleinere parenchymale und meningeale Gefäße des frontalen Kortex schienen besonders anfällig gegenüber pE3Aβ-Ablagerungen zu sein. Im entorhinalen Kortex von kleinen Hunden war die Menge an gefäßassoziierten Aβ8-17- und pE3Aβ-Ablagerungen annähernd gleich. Bei mittelgroßen und großen Hunden dominierte im entorhinalen Kortex und ventralen Hippokampus die Anzahl an gefäßassoziierten Aβ8-17-Ablagerungen. Bei kleinen Hunden existierten im ventralen Hippokampus signifikant mehr gefäßassoziierte Aβ8-17- als pE3Aβ-Ablagerungen. Hyperphosphoryliertes Tau fand sich in der Hippokampusformation von drei Hunden im Alter von 11 bzw. 15 Jahren. Der Schweregrad war unterschiedlich ausgeprägt, sodass nur ein Hund eine hochgradige Pathologie mit NFTs und neuritischen Plaques aufwies. Einhergehend mit dem Alter und einer assoziierten Proteinpathologie fanden sich Veränderungen der mikroglialen Morphologie. Neben ramifizierten Mikroglia lagen in den untersuchten Gehirnregionen aktivierte Mikroglia vor. Einige Mikroglia wiesen Zeichen einer Seneszenz auf und waren insbesondere in den Gehirnen von Hunden mit einer hochgradigen Aβ- bzw. Tau-Pathologie vorhanden. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dieser Studie eine nähere Charakterisierung des caninen kognitiven Dysfunktionssyndroms erfolgte. Die Befunde sind von hoher translationaler Bedeutung und fördern die Etablierung des Hundes als natürliches Modelltier zur Untersuchung von Alterungsprozessen des Gehirns und für die Erforschung des initialen Stadiums der Alzheimer-Krankheit. / Dogs develop an age-associated cognitive dysfunction syndrome with several aspects resembling Alzheimer\\\'s disease. Affected animals show signs of dis-orientation in their familiar surroundings, dementia, and a disturbed circadian rhythm. The underlying neurodegenerative disease is associated with patho-logic changes in the brain including regularly deposition of β-pleated amyloid and rarely hyperphosphorylated tau accumulation. However, there have been no reports of the highly cytotoxic and modified pE3Aβ in the canine brain. Equally, altered microglial morphology has not been documented so far. For this study 24 euthanized thoroughbred dogs and mongrels of different ages were available. Five of these animals had an average age of 2.1 years and served as control group. The remaining 19 dogs were 8 to 19 years old. Accor-ding to their height and weight these dogs were divided into 3 different categories including small (≤ 10 kg), medium (11 - 25 kg) and large dogs (> 25 kg). Brains were dissected from the skulls and fixed in 4 % paraformaldehyde. Afterwards the frontal and entorhinal cortex as well as the hippocampal for-mation were isolated, vitrificated in 30 % sucrose solution and frozen to -80 °C by methylbutane. These regions were sliced into 40 µm thick sections and subsequently stained by immunohistology in order to detect deposits of Aβ8-17, pE3Aβ and hyperphosphorylated tau, respectively. Antibodies against Iba1 and TAL.1B5 were used to analyze microglial morphology and activation status. Additionally further investigations were made with the Filament Tracer of Imaris software. Stereological analysis methods served for the quantification of Aβ depositions and microglia. Disseminated Aβ plaques were detected in dogs from 9 years on. Within the examined brain regions of elderly dogs a progressive course of Aβ depositions was observed. Especially small dogs had a longer lifespan than medium and large dogs with the result that more plaques were deposited in the brains of small dogs. Elderly dogs had in common that pE3Aβ-plaques where more often located in the examined brain regions than plaques containing Aβ8-17. Minor parenchymal and meningeal vessels seemed to be susceptible especially to pE3Aβ depositions. The amount of vessel-associated Aβ8-17 and pE3Aβ in the entorhinal cortex of small dogs was almost equal. Within the entorhinal cortex of medium and large dogs the amount of vessel-associated Aβ8-17 predominated. The ventral hippocampus of small dogs showed significantly more vessel-associated Aβ8-17 than pE3Aβ depositions. Hyperphosphorylated tau was present in the hippocampal formations of 3 dogs with an age of 11 and 15 years, respectively. The degree of severity varied with the result that only one dog showed a high-grade pathology with development of NFTs and neuritic plaques. Accompanied by age and associated protein pathology altered microglial morphology was detected. Alongside with ramified microglia, activated cells were identified in the examined brain regions. Several microglia showed signs of senescence and were present in the brains of dogs with severe Aβ and tau pathology. Summarizing, this study facilitated a further characterization of the canine cognitive dysfunction syndrome. The results are of highly translational importance and encourage the establishment of the dog as a natural animal model for studying age-associated processes and the initial stage of Alzheimer’s disease.

Altersassoziiert entwickeln Hunde eine Erkrankung, die in vielen Aspekten der Alzheimer-Krankheit des Menschen ähnelt. Das canine kognitive Dysfunktionssyndrom äußert sich klinisch u.a. durch Desorientierung in vertrauter Umgebung, Vergessen von Kommandos und einen gestörten Schlaf-Wach-Rhythmus. Aus der Literatur ist bekannt, dass in den Gehirnen von alten Hunden regelmäßig Aβ- und selten Tauablagerungen zu beobachten sind. Allerdings erfolgte bisher kein Nachweis des hochgradig zytotoxischen und modifizierten pE3Aβ. Auch Veränderungen der mikroglialen Morphologie wurden bisher nicht beschrieben. Insgesamt lagen in dieser Studie 24 euthanasierte Rasse- und Mischlingshunde verschiedenen Alters vor. Fünf dieser Tiere besaßen ein durchschnittliches Alter von 2,1 Jahren und dienten als Kontrollgruppe. Die anderen 19 Hunde waren 8 bis 19 Jahre alt und wurden entsprechend ihrer Größe und des Gewichts in die drei Kategorien kleine (≤ 10 kg), mittelgroße (10 – 25 kg) und große Hunde (> 25 kg) unterteilt. Die Gehirne wurden aus den Schädeln präpariert und in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Anschließend erfolgte die Präparation des frontalen und entorhinalen Kortex sowie der Hippokampusformation, die in 30%iger Saccharoselösung vitrifiziert und mittels Methylbutan bei -80 °C eingefroren wurden. Von den Regionen wurden Kryoschnitte mit einer Dicke von 40 µm angefertigt und diese anhand immunhistologischer Färbungen auf das Vorhandensein von Ablagerungen, bestehend aus den Amyloidsubtypen Aβ8-17 und pE3Aβ, sowie aus hyperphosphorylierten Tau, untersucht. Die Morphologie und das Aktivitätsstadium der Mikroglia wurden mit Antikörpern gegen Iba1 und TAL.1B5 analysiert. Zusätzlich erfolgte eine Untersuchung anhand des Filament Tracer. Stereologische Analysemethoden wurden zur Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen und der Mikroglia angewandt. Disseminierte Plaques fanden sich bereits ab 9 Jahren. In den untersuchten Gehirnregionen von alten Hunden zeichnete sich ein progressiver Verlauf der Ablagerungen ab. Da insbesondere kleinere Hunde ein höheres Alter erreichten als mittelgroße und große Hunde konnten in dieser Kategorie vermehrt Plaques beobachtet werden. Den alten Tieren gemein war, dass in den untersuchten Gehirnregionen pE3Aβ-Plaques häufiger vorlagen als Plaques, die aus Aβ8-17 bestanden. Kleinere parenchymale und meningeale Gefäße des frontalen Kortex schienen besonders anfällig gegenüber pE3Aβ-Ablagerungen zu sein. Im entorhinalen Kortex von kleinen Hunden war die Menge an gefäßassoziierten Aβ8-17- und pE3Aβ-Ablagerungen annähernd gleich. Bei mittelgroßen und großen Hunden dominierte im entorhinalen Kortex und ventralen Hippokampus die Anzahl an gefäßassoziierten Aβ8-17-Ablagerungen. Bei kleinen Hunden existierten im ventralen Hippokampus signifikant mehr gefäßassoziierte Aβ8-17- als pE3Aβ-Ablagerungen. Hyperphosphoryliertes Tau fand sich in der Hippokampusformation von drei Hunden im Alter von 11 bzw. 15 Jahren. Der Schweregrad war unterschiedlich ausgeprägt, sodass nur ein Hund eine hochgradige Pathologie mit NFTs und neuritischen Plaques aufwies. Einhergehend mit dem Alter und einer assoziierten Proteinpathologie fanden sich Veränderungen der mikroglialen Morphologie. Neben ramifizierten Mikroglia lagen in den untersuchten Gehirnregionen aktivierte Mikroglia vor. Einige Mikroglia wiesen Zeichen einer Seneszenz auf und waren insbesondere in den Gehirnen von Hunden mit einer hochgradigen Aβ- bzw. Tau-Pathologie vorhanden. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dieser Studie eine nähere Charakterisierung des caninen kognitiven Dysfunktionssyndroms erfolgte. Die Befunde sind von hoher translationaler Bedeutung und fördern die Etablierung des Hundes als natürliches Modelltier zur Untersuchung von Alterungsprozessen des Gehirns und für die Erforschung des initialen Stadiums der Alzheimer-Krankheit.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das canine kognitive Dysfunktionssyndrom 2.2 Pathogenese der Proteinablagerungen 2.2.1 Amyloid-Pathologie 2.2.2 Tau-Pathologie 2.3 Mikroglia 2.3.1 Ursprung und Formen 2.3.2 Die Rolle der Mikroglia beim Morbus Alzheimer 2.4 Assoziation des CCDS zum Morbus Alzheimer 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Hunde 3.2 Gehirnproben 3.2.1 Gewinnung und Kryofixierung der Gehirne 3.2.2 Makroskopische Untersuchung der Gehirne 3.2.3 Untersuchte Gehirnregionen 3.2.4 Histologische Färbungen 3.3 Immunohistochemische und Immunfluoreszenzfärbungen 3.3.1 Antikörper und Seren 3.3.2 Protokoll der ABC-Methode 3.3.3 Protokoll zur Immunfluoreszenz 3.3.4 Kontrollen 3.4 Auswertung der Färbungen 3.4.1 Deskriptive Analyse der Präparate 3.4.2 Quantitative Analyse der immunhistochemischen Befunde 3.4.3 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Anamnestische Merkmale der Hunde 4.1.1 Gruppeneinteilung in Größen- und Gewichtskategorien 4.1.2 Altersverteilung 4.1.3 Symptomatik 4.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 4.2.1 Altersabhängige pathologische Gehirnveränderungen 4.2.2 Anteil der grauen Substanz des frontalen Kortex 4.2.3 Pathologisch-histologische Charakterisierung ausgewählter Hirnareale 4.2.3.1 Kontrollgruppe 4.2.3.2 Gehirne der alten Hunde 4.2.3.3 Korrelation der altersassoziierten Neuropathologie mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.2.3.4 Statistische Auswertung 4.3 Detektion, Charakterisierung und Quantifizierung des Aβ-Proteins 4.3.1 Immunhistochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.1.1 Kontrollgruppe 4.3.1.2 Altersassoziierte Verteilung der Aβ-Ablagerungen 4.3.2 Morphologie der Aβ-Ablagerungen 4.3.3 Assoziation der Aβ-Ablagerungen mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.3.4 Histochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.5 Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen 4.4 Immunhistologische Darstellung von Tau-Pathologien 4.4.1 Kontrollgruppe 4.4.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5 Charakterisierung und Quantifizierung der Mikroglia 4.5.1 Darstellung der Mikroglia 4.5.1.1 Kontrollgruppe 4.5.1.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5.2 Assoziation der mikroglialen Morphologie zu den Größen- und Gewichtskategorien der untersuchten Hunde 4.5.3 Auswertung morphologischer Parameter mit dem Filament Tracer 4.5.4 Quantifizierung der Mikroglia 4.5.4.1 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zur Neuropathologie 4.5.4.2 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zu den Größen- und Gewichtskategorien 4.5.5 Nachweis HLA DR-positiver Mikroglia 4.5.5.1 Kontrollgruppe 4.5.5.2 Alte Versuchshunde 5 Diskussion 5.1 Hundepopulation 5.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 5.3 Aβ-Pathologie 5.3.1 Parenchymale Aβ-Plaques 5.3.2 Gefäßassoziiertes Aβ-Protein 5.4 Tau-Pathologie 5.4.1 Häufigkeit innerhalb der Hundepopulation und kritische Wertung der Färbemethodik 5.4.2 Zusammenhang der Tau-Pathologie mit den Aβ-Ablagerungen 5.5 Mikroglia 5.5.1 Unterschiede in der Anzahl der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.2 Unterschiede der Morphologie der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.3 Detektion von dystrophischen Mikroglia in den Gehirnen von alten Hunden 5.6 Schlussfolgerungen 5.7 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Tabellarische Übersichten zu den Studientieren 9.2 Protokoll der H&E-Färbung 9.3 Übersicht einzelner Ergebnisse des humanen Gewebes 9.4 Tabellarische Übersichten der verwendeten Materialien Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis / Dogs develop an age-associated cognitive dysfunction syndrome with several aspects resembling Alzheimer\\\''s disease. Affected animals show signs of dis-orientation in their familiar surroundings, dementia, and a disturbed circadian rhythm. The underlying neurodegenerative disease is associated with patho-logic changes in the brain including regularly deposition of β-pleated amyloid and rarely hyperphosphorylated tau accumulation. However, there have been no reports of the highly cytotoxic and modified pE3Aβ in the canine brain. Equally, altered microglial morphology has not been documented so far. For this study 24 euthanized thoroughbred dogs and mongrels of different ages were available. Five of these animals had an average age of 2.1 years and served as control group. The remaining 19 dogs were 8 to 19 years old. Accor-ding to their height and weight these dogs were divided into 3 different categories including small (≤ 10 kg), medium (11 - 25 kg) and large dogs (> 25 kg). Brains were dissected from the skulls and fixed in 4 % paraformaldehyde. Afterwards the frontal and entorhinal cortex as well as the hippocampal for-mation were isolated, vitrificated in 30 % sucrose solution and frozen to -80 °C by methylbutane. These regions were sliced into 40 µm thick sections and subsequently stained by immunohistology in order to detect deposits of Aβ8-17, pE3Aβ and hyperphosphorylated tau, respectively. Antibodies against Iba1 and TAL.1B5 were used to analyze microglial morphology and activation status. Additionally further investigations were made with the Filament Tracer of Imaris software. Stereological analysis methods served for the quantification of Aβ depositions and microglia. Disseminated Aβ plaques were detected in dogs from 9 years on. Within the examined brain regions of elderly dogs a progressive course of Aβ depositions was observed. Especially small dogs had a longer lifespan than medium and large dogs with the result that more plaques were deposited in the brains of small dogs. Elderly dogs had in common that pE3Aβ-plaques where more often located in the examined brain regions than plaques containing Aβ8-17. Minor parenchymal and meningeal vessels seemed to be susceptible especially to pE3Aβ depositions. The amount of vessel-associated Aβ8-17 and pE3Aβ in the entorhinal cortex of small dogs was almost equal. Within the entorhinal cortex of medium and large dogs the amount of vessel-associated Aβ8-17 predominated. The ventral hippocampus of small dogs showed significantly more vessel-associated Aβ8-17 than pE3Aβ depositions. Hyperphosphorylated tau was present in the hippocampal formations of 3 dogs with an age of 11 and 15 years, respectively. The degree of severity varied with the result that only one dog showed a high-grade pathology with development of NFTs and neuritic plaques. Accompanied by age and associated protein pathology altered microglial morphology was detected. Alongside with ramified microglia, activated cells were identified in the examined brain regions. Several microglia showed signs of senescence and were present in the brains of dogs with severe Aβ and tau pathology. Summarizing, this study facilitated a further characterization of the canine cognitive dysfunction syndrome. The results are of highly translational importance and encourage the establishment of the dog as a natural animal model for studying age-associated processes and the initial stage of Alzheimer’s disease.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das canine kognitive Dysfunktionssyndrom 2.2 Pathogenese der Proteinablagerungen 2.2.1 Amyloid-Pathologie 2.2.2 Tau-Pathologie 2.3 Mikroglia 2.3.1 Ursprung und Formen 2.3.2 Die Rolle der Mikroglia beim Morbus Alzheimer 2.4 Assoziation des CCDS zum Morbus Alzheimer 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Hunde 3.2 Gehirnproben 3.2.1 Gewinnung und Kryofixierung der Gehirne 3.2.2 Makroskopische Untersuchung der Gehirne 3.2.3 Untersuchte Gehirnregionen 3.2.4 Histologische Färbungen 3.3 Immunohistochemische und Immunfluoreszenzfärbungen 3.3.1 Antikörper und Seren 3.3.2 Protokoll der ABC-Methode 3.3.3 Protokoll zur Immunfluoreszenz 3.3.4 Kontrollen 3.4 Auswertung der Färbungen 3.4.1 Deskriptive Analyse der Präparate 3.4.2 Quantitative Analyse der immunhistochemischen Befunde 3.4.3 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Anamnestische Merkmale der Hunde 4.1.1 Gruppeneinteilung in Größen- und Gewichtskategorien 4.1.2 Altersverteilung 4.1.3 Symptomatik 4.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 4.2.1 Altersabhängige pathologische Gehirnveränderungen 4.2.2 Anteil der grauen Substanz des frontalen Kortex 4.2.3 Pathologisch-histologische Charakterisierung ausgewählter Hirnareale 4.2.3.1 Kontrollgruppe 4.2.3.2 Gehirne der alten Hunde 4.2.3.3 Korrelation der altersassoziierten Neuropathologie mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.2.3.4 Statistische Auswertung 4.3 Detektion, Charakterisierung und Quantifizierung des Aβ-Proteins 4.3.1 Immunhistochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.1.1 Kontrollgruppe 4.3.1.2 Altersassoziierte Verteilung der Aβ-Ablagerungen 4.3.2 Morphologie der Aβ-Ablagerungen 4.3.3 Assoziation der Aβ-Ablagerungen mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.3.4 Histochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.5 Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen 4.4 Immunhistologische Darstellung von Tau-Pathologien 4.4.1 Kontrollgruppe 4.4.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5 Charakterisierung und Quantifizierung der Mikroglia 4.5.1 Darstellung der Mikroglia 4.5.1.1 Kontrollgruppe 4.5.1.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5.2 Assoziation der mikroglialen Morphologie zu den Größen- und Gewichtskategorien der untersuchten Hunde 4.5.3 Auswertung morphologischer Parameter mit dem Filament Tracer 4.5.4 Quantifizierung der Mikroglia 4.5.4.1 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zur Neuropathologie 4.5.4.2 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zu den Größen- und Gewichtskategorien 4.5.5 Nachweis HLA DR-positiver Mikroglia 4.5.5.1 Kontrollgruppe 4.5.5.2 Alte Versuchshunde 5 Diskussion 5.1 Hundepopulation 5.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 5.3 Aβ-Pathologie 5.3.1 Parenchymale Aβ-Plaques 5.3.2 Gefäßassoziiertes Aβ-Protein 5.4 Tau-Pathologie 5.4.1 Häufigkeit innerhalb der Hundepopulation und kritische Wertung der Färbemethodik 5.4.2 Zusammenhang der Tau-Pathologie mit den Aβ-Ablagerungen 5.5 Mikroglia 5.5.1 Unterschiede in der Anzahl der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.2 Unterschiede der Morphologie der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.3 Detektion von dystrophischen Mikroglia in den Gehirnen von alten Hunden 5.6 Schlussfolgerungen 5.7 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Tabellarische Übersichten zu den Studientieren 9.2 Protokoll der H&E-Färbung 9.3 Übersicht einzelner Ergebnisse des humanen Gewebes 9.4 Tabellarische Übersichten der verwendeten Materialien Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis