A produção de fumo na região sul do Brasil, mais precisamente no Estado do Rio Grande do Sul (RS), exerce grande importância na atividade econômica e social. Na área econômica, o fumo é responsável pela arrecadação de grandes somas em impostos. No campo social, a atividade fumageira é grande geradora de empregos diretos e indiretos. Os agricultores que trabalham nas lavouras de fumo estão em constante contato com a planta. Consequentemente, estes trabalhadores se expõem tanto aos compostos orgânicos e inorgânicos presentes nas folhas, como aos pesticidas naturais e sintéticos relacionados. “Green tobacco sickness” (GTS) é conhecida como risco ocupacional à saúde de trabalhadores do campo no plantio de tabaco. Os sintomas têm sido atribuídos ao envenenamento agudo por nicotina seguido por contato dermal com as folhas do fumo. Contudo autores salientam que os efeitos sinérgicos da nicotina e dos pesticidas devem ser examinados. Neste trabalho utilizou-se Cantareus aspersus com o objetivo de identificar a ação genotóxica e/ou mutagênica das folhas de Nicotiana tabacum através da exposição dermal. O caracol terrestre tem sido utilizado nos últimos anos devido a sua fácil aclimatação e manipulação em laboratório e por sua sensibilidade e resistência aos testes de genotoxicidade. Nestes animais foram realizados testes de biomonitoramento de exposição: Ensaio Cometa e quantificação dos elementos químicos pela técnica PIXE; bem como, testes de biomonitoramento de efeito: Teste de Micronúcleo e quantificação do Citocromo P450. Nosso estudo dosou a quantidade de nicotina na água, exposta à superfície da folha, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e realizou “screening” fitoquímico de N. tabacum. Trinta moluscos terrestres foram expostos a diferentes tratamentos: dez expostos a folhas de tabaco sem pesticida; dez expostos a folhas de tabaco com pesticida e dez expostos a folhas de Lactuca sativa L. (grupo controle). Células da hemolinfa foram coletadas após 0, 24, 48 e 72 horas de exposição, o dano ao DNA foi avaliado pelo Ensaio Cometa em todos os períodos e a freqüência de micronúcleos somente em 72 horas. Resultados significativos foram encontrados nos grupos expostos a folhas de fumo, através do Ensaio Cometa, no período de 24, 48 e 72 horas de exposição e em 72 horas através doTeste de Micronúcleos, quando comparados ao grupo controle. Não houve diferença significativa entre caracóis expostos a folhas de fumo com e sem pesticida, portanto, podemos afirmar que o pesticida flumetralin não contribuiu com os danos ao DNA observados. “Screening” fitoquímico revelou presença de alcalóide, cumarina, traços de saponina e flavonóides. Inibição da atividade da enzima do Citocromo P450 ocorreu somente no grupo exposto a folhas de fumo sem pesticida. Doze elementos inorgânicos diferentes foram quantificados nas folhas de tabaco e nos caracóis expostos a folhas sem pesticida e, dez nos caracóis expostos a folhas com pesticida. Por cromatografia foram dosados 0,02% de nicotina por folha. A presença de alcalóides (nicotina), cumarinas, saponinas, flavonóides e diferentes metais provavelmente influenciaram o efeito mutagênico e genotóxico em C. aspersus expostos ao fumo. Estes efeitos possivelmente tenham sido causados pela complexa mistura presente nas folhas que podem interagir produzindo efeitos sinérgicos, antagônicos ou influenciando a absorção de um dado composto. As enzimas do sistema Citocromo P450 em C. aspersus expostos a folhas de fumo sem veneno podem ter sido inibidas pela nicotina, pelos flavonóides e pelo cobre. Por fim, nosso estudo providencia dados biológicos e químicos sobre C. aspersus expostos à folha de fumo e confirma a sensibilidade do Ensaio Cometa e do Teste de Micronúcleos na avaliação de misturas complexas, indicando associação entre nicotina, cumarina e interação flavonóide/metal (principalmente cobre e ferro) como principais causadores de dano ao DNA em células de hemolinfa do molusco terrestre C. aspersus por folhas de N. tabacum. / Tobacco production in southern Brazil, precisely in Rio Grande do Sul state (RS) play a major role in economic and social activity. Tobacco farmers are routinely exposed to complex mixtures present in tobacco leaves including organic and inorganic compounds. Green tobacco sickness (GTS) is a form of nicotine poisoning that affects workers who have direct dermal contact with tobacco plants during cultivation and harvesting. However, some authors suggest that the synergistic effects of nicotine and pesticide should be examined. The purpose of this study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effect of tobacco leaves, with and without exposure to flumetralin in Cantareus aspersus through dermal exposure. The land mollusk was utilized because of its easy acclimatization and manipulation in the laboratory and for its sensibility and resistance in genotoxicity tests. Biomonitoring exposure test was performed on these animals: Comet Assay and chemical elements quantification by PIXE; biomonitoring tests for effects were also carried out: Micronuclei Test and cytochrome P450 quantification. Nicotine dosage was performed in water exposed to the surface of tobacco leaves, by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and screening phytochemistry in Nicotiana tabacum. Thirty land mollusks were exposed to different treatments; ten snails to tobacco leaves with pesticide; ten to tobacco leaves without pesticide and ten snails exposed to lettuce leaves (control group). Hemolymph cells were collected after 0, 24, 48 and 72 hours, the DNA damage was evaluated by single cell gel assay for all these periods, and the frequency of micronuclei only in 72h. Significant results were found in groups exposed to tobacco leaves during 24, 48 and 72 hours of exposure by Comet Assay and by Micronucleus Test when compared to the control group. No difference was observed between different periods or between exposure to leaves with and without pesticide. This result shows that no genotoxic effect can be attributed to pesticide. Chemical results found alkaloid, coumarin, saponin traces, flavonoids and different metals. Inhibition of cytochrome P450 enzymes occurs only in the group without pesticide. Twelve inorganic elements were found in tobacco leaves and in snails exposed to tobacco leaves without pesticide. Ten inorganic elements were found in tobacco leaves with pesticide. Nicotine dosage found 0.02% of this alkaloid per leaf. The presence of coumarin, saponin traces, flavonoids, alkaloid (nicotine) and different metals probably causes genotoxic effects on land mollusks exposed to tobacco leaves with and without pesticide. This induction of DNA damage by dermal exposure to tobacco leaves was caused by a complex mixture present in the leaves. The enzymes of cytochrome P450 systems were inhibited by nicotine, flavonoids and copper. Our study provided chemical and biological data on C. aspersus exposed to tobacco leaves. The results of our study confirm the sensibility of the Comet Assay and Micronucleus Test for the evaluation of the complex mixture, indicating an association between nicotine, coumarin and flavonoid/metal interaction (mainly copper and iron) as the main causes of DNA damage in hemolymph cells from the land mollusk C. aspersus by N. tabacum.

A produção de fumo na região sul do Brasil, mais precisamente no Estado do Rio Grande do Sul (RS), exerce grande importância na atividade econômica e social. Na área econômica, o fumo é responsável pela arrecadação de grandes somas em impostos. No campo social, a atividade fumageira é grande geradora de empregos diretos e indiretos. Os agricultores que trabalham nas lavouras de fumo estão em constante contato com a planta. Consequentemente, estes trabalhadores se expõem tanto aos compostos orgânicos e inorgânicos presentes nas folhas, como aos pesticidas naturais e sintéticos relacionados. “Green tobacco sickness” (GTS) é conhecida como risco ocupacional à saúde de trabalhadores do campo no plantio de tabaco. Os sintomas têm sido atribuídos ao envenenamento agudo por nicotina seguido por contato dermal com as folhas do fumo. Contudo autores salientam que os efeitos sinérgicos da nicotina e dos pesticidas devem ser examinados. Neste trabalho utilizou-se Cantareus aspersus com o objetivo de identificar a ação genotóxica e/ou mutagênica das folhas de Nicotiana tabacum através da exposição dermal. O caracol terrestre tem sido utilizado nos últimos anos devido a sua fácil aclimatação e manipulação em laboratório e por sua sensibilidade e resistência aos testes de genotoxicidade. Nestes animais foram realizados testes de biomonitoramento de exposição: Ensaio Cometa e quantificação dos elementos químicos pela técnica PIXE; bem como, testes de biomonitoramento de efeito: Teste de Micronúcleo e quantificação do Citocromo P450. Nosso estudo dosou a quantidade de nicotina na água, exposta à superfície da folha, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e realizou “screening” fitoquímico de N. tabacum. Trinta moluscos terrestres foram expostos a diferentes tratamentos: dez expostos a folhas de tabaco sem pesticida; dez expostos a folhas de tabaco com pesticida e dez expostos a folhas de Lactuca sativa L. (grupo controle). Células da hemolinfa foram coletadas após 0, 24, 48 e 72 horas de exposição, o dano ao DNA foi avaliado pelo Ensaio Cometa em todos os períodos e a freqüência de micronúcleos somente em 72 horas. Resultados significativos foram encontrados nos grupos expostos a folhas de fumo, através do Ensaio Cometa, no período de 24, 48 e 72 horas de exposição e em 72 horas através doTeste de Micronúcleos, quando comparados ao grupo controle. Não houve diferença significativa entre caracóis expostos a folhas de fumo com e sem pesticida, portanto, podemos afirmar que o pesticida flumetralin não contribuiu com os danos ao DNA observados. “Screening” fitoquímico revelou presença de alcalóide, cumarina, traços de saponina e flavonóides. Inibição da atividade da enzima do Citocromo P450 ocorreu somente no grupo exposto a folhas de fumo sem pesticida. Doze elementos inorgânicos diferentes foram quantificados nas folhas de tabaco e nos caracóis expostos a folhas sem pesticida e, dez nos caracóis expostos a folhas com pesticida. Por cromatografia foram dosados 0,02% de nicotina por folha. A presença de alcalóides (nicotina), cumarinas, saponinas, flavonóides e diferentes metais provavelmente influenciaram o efeito mutagênico e genotóxico em C. aspersus expostos ao fumo. Estes efeitos possivelmente tenham sido causados pela complexa mistura presente nas folhas que podem interagir produzindo efeitos sinérgicos, antagônicos ou influenciando a absorção de um dado composto. As enzimas do sistema Citocromo P450 em C. aspersus expostos a folhas de fumo sem veneno podem ter sido inibidas pela nicotina, pelos flavonóides e pelo cobre. Por fim, nosso estudo providencia dados biológicos e químicos sobre C. aspersus expostos à folha de fumo e confirma a sensibilidade do Ensaio Cometa e do Teste de Micronúcleos na avaliação de misturas complexas, indicando associação entre nicotina, cumarina e interação flavonóide/metal (principalmente cobre e ferro) como principais causadores de dano ao DNA em células de hemolinfa do molusco terrestre C. aspersus por folhas de N. tabacum. / Tobacco production in southern Brazil, precisely in Rio Grande do Sul state (RS) play a major role in economic and social activity. Tobacco farmers are routinely exposed to complex mixtures present in tobacco leaves including organic and inorganic compounds. Green tobacco sickness (GTS) is a form of nicotine poisoning that affects workers who have direct dermal contact with tobacco plants during cultivation and harvesting. However, some authors suggest that the synergistic effects of nicotine and pesticide should be examined. The purpose of this study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effect of tobacco leaves, with and without exposure to flumetralin in Cantareus aspersus through dermal exposure. The land mollusk was utilized because of its easy acclimatization and manipulation in the laboratory and for its sensibility and resistance in genotoxicity tests. Biomonitoring exposure test was performed on these animals: Comet Assay and chemical elements quantification by PIXE; biomonitoring tests for effects were also carried out: Micronuclei Test and cytochrome P450 quantification. Nicotine dosage was performed in water exposed to the surface of tobacco leaves, by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and screening phytochemistry in Nicotiana tabacum. Thirty land mollusks were exposed to different treatments; ten snails to tobacco leaves with pesticide; ten to tobacco leaves without pesticide and ten snails exposed to lettuce leaves (control group). Hemolymph cells were collected after 0, 24, 48 and 72 hours, the DNA damage was evaluated by single cell gel assay for all these periods, and the frequency of micronuclei only in 72h. Significant results were found in groups exposed to tobacco leaves during 24, 48 and 72 hours of exposure by Comet Assay and by Micronucleus Test when compared to the control group. No difference was observed between different periods or between exposure to leaves with and without pesticide. This result shows that no genotoxic effect can be attributed to pesticide. Chemical results found alkaloid, coumarin, saponin traces, flavonoids and different metals. Inhibition of cytochrome P450 enzymes occurs only in the group without pesticide. Twelve inorganic elements were found in tobacco leaves and in snails exposed to tobacco leaves without pesticide. Ten inorganic elements were found in tobacco leaves with pesticide. Nicotine dosage found 0.02% of this alkaloid per leaf. The presence of coumarin, saponin traces, flavonoids, alkaloid (nicotine) and different metals probably causes genotoxic effects on land mollusks exposed to tobacco leaves with and without pesticide. This induction of DNA damage by dermal exposure to tobacco leaves was caused by a complex mixture present in the leaves. The enzymes of cytochrome P450 systems were inhibited by nicotine, flavonoids and copper. Our study provided chemical and biological data on C. aspersus exposed to tobacco leaves. The results of our study confirm the sensibility of the Comet Assay and Micronucleus Test for the evaluation of the complex mixture, indicating an association between nicotine, coumarin and flavonoid/metal interaction (mainly copper and iron) as the main causes of DNA damage in hemolymph cells from the land mollusk C. aspersus by N. tabacum.

A produção de fumo na região sul do Brasil, mais precisamente no Estado do Rio Grande do Sul (RS), exerce grande importância na atividade econômica e social. Na área econômica, o fumo é responsável pela arrecadação de grandes somas em impostos. No campo social, a atividade fumageira é grande geradora de empregos diretos e indiretos. Os agricultores que trabalham nas lavouras de fumo estão em constante contato com a planta. Consequentemente, estes trabalhadores se expõem tanto aos compostos orgânicos e inorgânicos presentes nas folhas, como aos pesticidas naturais e sintéticos relacionados. “Green tobacco sickness” (GTS) é conhecida como risco ocupacional à saúde de trabalhadores do campo no plantio de tabaco. Os sintomas têm sido atribuídos ao envenenamento agudo por nicotina seguido por contato dermal com as folhas do fumo. Contudo autores salientam que os efeitos sinérgicos da nicotina e dos pesticidas devem ser examinados. Neste trabalho utilizou-se Cantareus aspersus com o objetivo de identificar a ação genotóxica e/ou mutagênica das folhas de Nicotiana tabacum através da exposição dermal. O caracol terrestre tem sido utilizado nos últimos anos devido a sua fácil aclimatação e manipulação em laboratório e por sua sensibilidade e resistência aos testes de genotoxicidade. Nestes animais foram realizados testes de biomonitoramento de exposição: Ensaio Cometa e quantificação dos elementos químicos pela técnica PIXE; bem como, testes de biomonitoramento de efeito: Teste de Micronúcleo e quantificação do Citocromo P450. Nosso estudo dosou a quantidade de nicotina na água, exposta à superfície da folha, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e realizou “screening” fitoquímico de N. tabacum. Trinta moluscos terrestres foram expostos a diferentes tratamentos: dez expostos a folhas de tabaco sem pesticida; dez expostos a folhas de tabaco com pesticida e dez expostos a folhas de Lactuca sativa L. (grupo controle). Células da hemolinfa foram coletadas após 0, 24, 48 e 72 horas de exposição, o dano ao DNA foi avaliado pelo Ensaio Cometa em todos os períodos e a freqüência de micronúcleos somente em 72 horas. Resultados significativos foram encontrados nos grupos expostos a folhas de fumo, através do Ensaio Cometa, no período de 24, 48 e 72 horas de exposição e em 72 horas através doTeste de Micronúcleos, quando comparados ao grupo controle. Não houve diferença significativa entre caracóis expostos a folhas de fumo com e sem pesticida, portanto, podemos afirmar que o pesticida flumetralin não contribuiu com os danos ao DNA observados. “Screening” fitoquímico revelou presença de alcalóide, cumarina, traços de saponina e flavonóides. Inibição da atividade da enzima do Citocromo P450 ocorreu somente no grupo exposto a folhas de fumo sem pesticida. Doze elementos inorgânicos diferentes foram quantificados nas folhas de tabaco e nos caracóis expostos a folhas sem pesticida e, dez nos caracóis expostos a folhas com pesticida. Por cromatografia foram dosados 0,02% de nicotina por folha. A presença de alcalóides (nicotina), cumarinas, saponinas, flavonóides e diferentes metais provavelmente influenciaram o efeito mutagênico e genotóxico em C. aspersus expostos ao fumo. Estes efeitos possivelmente tenham sido causados pela complexa mistura presente nas folhas que podem interagir produzindo efeitos sinérgicos, antagônicos ou influenciando a absorção de um dado composto. As enzimas do sistema Citocromo P450 em C. aspersus expostos a folhas de fumo sem veneno podem ter sido inibidas pela nicotina, pelos flavonóides e pelo cobre. Por fim, nosso estudo providencia dados biológicos e químicos sobre C. aspersus expostos à folha de fumo e confirma a sensibilidade do Ensaio Cometa e do Teste de Micronúcleos na avaliação de misturas complexas, indicando associação entre nicotina, cumarina e interação flavonóide/metal (principalmente cobre e ferro) como principais causadores de dano ao DNA em células de hemolinfa do molusco terrestre C. aspersus por folhas de N. tabacum. / Tobacco production in southern Brazil, precisely in Rio Grande do Sul state (RS) play a major role in economic and social activity. Tobacco farmers are routinely exposed to complex mixtures present in tobacco leaves including organic and inorganic compounds. Green tobacco sickness (GTS) is a form of nicotine poisoning that affects workers who have direct dermal contact with tobacco plants during cultivation and harvesting. However, some authors suggest that the synergistic effects of nicotine and pesticide should be examined. The purpose of this study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effect of tobacco leaves, with and without exposure to flumetralin in Cantareus aspersus through dermal exposure. The land mollusk was utilized because of its easy acclimatization and manipulation in the laboratory and for its sensibility and resistance in genotoxicity tests. Biomonitoring exposure test was performed on these animals: Comet Assay and chemical elements quantification by PIXE; biomonitoring tests for effects were also carried out: Micronuclei Test and cytochrome P450 quantification. Nicotine dosage was performed in water exposed to the surface of tobacco leaves, by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and screening phytochemistry in Nicotiana tabacum. Thirty land mollusks were exposed to different treatments; ten snails to tobacco leaves with pesticide; ten to tobacco leaves without pesticide and ten snails exposed to lettuce leaves (control group). Hemolymph cells were collected after 0, 24, 48 and 72 hours, the DNA damage was evaluated by single cell gel assay for all these periods, and the frequency of micronuclei only in 72h. Significant results were found in groups exposed to tobacco leaves during 24, 48 and 72 hours of exposure by Comet Assay and by Micronucleus Test when compared to the control group. No difference was observed between different periods or between exposure to leaves with and without pesticide. This result shows that no genotoxic effect can be attributed to pesticide. Chemical results found alkaloid, coumarin, saponin traces, flavonoids and different metals. Inhibition of cytochrome P450 enzymes occurs only in the group without pesticide. Twelve inorganic elements were found in tobacco leaves and in snails exposed to tobacco leaves without pesticide. Ten inorganic elements were found in tobacco leaves with pesticide. Nicotine dosage found 0.02% of this alkaloid per leaf. The presence of coumarin, saponin traces, flavonoids, alkaloid (nicotine) and different metals probably causes genotoxic effects on land mollusks exposed to tobacco leaves with and without pesticide. This induction of DNA damage by dermal exposure to tobacco leaves was caused by a complex mixture present in the leaves. The enzymes of cytochrome P450 systems were inhibited by nicotine, flavonoids and copper. Our study provided chemical and biological data on C. aspersus exposed to tobacco leaves. The results of our study confirm the sensibility of the Comet Assay and Micronucleus Test for the evaluation of the complex mixture, indicating an association between nicotine, coumarin and flavonoid/metal interaction (mainly copper and iron) as the main causes of DNA damage in hemolymph cells from the land mollusk C. aspersus by N. tabacum.

Depuis au moins 2000 ans, le massif des Vosges a été le siège d’activités minières qui ont conduit (i) à l’émission de particules contaminées en éléments traces métalliques (ETMs), (ii) aux dépôts de déchets miniers et sidérurgiques et (iii) à des modifications du paysage. Les ressources présentes dans ce système de moyenne montagne, et utilisées par les populations, rendent nécessaire la mesure des impacts des activités anthropiques passées sur l’écosystème forestier.Ce travail de thèse propose une approche multi-proxy couplant géochimie, palynologie et écotoxicologie. Différentes phases de dépôts en ETMs ont été retracées sur les 2000 dernières années et regroupent celles connues à l’échelle de l’hémisphère Nord et des phases plus locales. L’impact paysager des activités minières semble quant à lui réduit par rapport à ce que laissaient penser les archives historiques qui présentaient des déserts forestiers dus aux activités minières. La biodisponibilité et le risque associés au transfert des ETMs ont été évalués dans un ancien district minier de production de plomb (Pb) et d’argent grâce à une campagne de bioindication active avec un indicateur de la qualité des sols, Cantareus aspersus. Sur huit stations, quatre présentent des excès de transfert induisant un risque toxicologique élevé et comprennent deux sites archéologiques miniers et un potager communal. Le fractionnement et la spéciation du Pb permettent de montrer une pratique à risque avec l’utilisation de scories comme amendements sur le potager. La contamination du milieu en ETMs par les activités minières est ici toujours transférable aux organismes du sol et donc potentiellement dans le réseau trophique / Since at least the last two millennia, mining and smelting activities have occurred in the Vosges Mountains and conducted to (i) the emission of trace metal (TM) contaminated particles in the atmosphere, (ii) the presence of mining and smelting wastes and (iii) landscape changes. Due to the use of resources from this mountainous area by local populations, it is necessary to measure impacts of these past activities on the forested ecosystem.This PhD thesis proposes a multi-proxy approach coupling geochemistry, palynology and ecotoxicology. Several phases of TM deposits have been recorded and correspond to major phases of TM contamination known in the northern hemisphere and also local periods of mining/smelting activities. The impact of mining activities on the landscape appears to be reduced contrary to historical data that described shortage of wood due to mining activities. The bioavailability and the risk associated to TMs from mining activities have been assessed in a former lead (Pb)-silver mining district by an active bioindication campaign using Cantareus aspersus, considered as indicator of soil quality. Among the eight stations, four of them present an excess of TM transfer conducting to a high ecological risk, particularly in two archaeological mining sites but also in a kitchen garden. Lead fractionation and speciation highlight the use of slags as amendments in the kitchen garden. Trace metal contamination of the soil due to mining activities is still bioavailable for soil organisms and so potentially transferred in food chain.