Pour la cellule, l’assemblage du cytosquelette d’actine joue un rôle central dans son déplacement, sa division ou sa morphogenèse. Cette réorganisation est orchestrée par des protéines régulatrices et des contraintes mécaniques. Savoir comment les combinaisons de ces actions biochimiques et physiques régulent les différentes architectures d’actine reste un véritable défi.La formine protéine est un régulateur essentiel de l’actine. Ancrée à la membrane, elle assemble les filaments d’actine (nucléation et élongation) présents dans des architectures linéaires et non branchées. La formine est impliquée notamment dans la génération de filopodes, protrusions guidant la locomotion cellulaire.Une propriété remarquable est sa capacité à suivre processivement le bout barbé d’un filament qu’elle allonge, tout en stimulant son élongation en présence de profiline. La régulation de cette processivité de la formine est encore à clarifier. C’est une caractéristique importante, intervenant dans le contrôle de la longueur des filaments, dont les connaissances sont à approfondir.L’étude de cette processivité est facilitée par l’utilisation d’un outil microfluidique novateur pour l’étude de la dynamique de multiples filaments individuels d’actine in vitro. Au sein d’une chambre en PDMS, les filaments sont ancrés à la surface par un seul bout, le reste s’alignant avec le flux. Nous pouvons précisément y changer l’environnement biochimique,tandis que la friction visqueuse sur les filaments permet d’exercer une tension contrôlée sur chacun d’entre eux.Simultanément à l’action de la formine au bout barbé, j’étudie l’effet d’autres protéines ou de la vitesse d’élongation sur sa processivité, en mesurant son taux de détachement. Par ailleurs nous pouvons reproduire l’ancrage membranaire cellulaire en attachant spécifiquement nos formines à la surface. Dans la chambre, par l’intermédiaire du filament qu’elle allonge, nous pouvons alors exercer des forces et en étudier l’effet sur la formine.Premièrement, j’ai étudié l’impact de la protéine de coiffe (CP) sur l’activité de la formine au bout barbé. La liaison de ces deux protéines aubout barbé a jusqu’ici été considérée mutuellement exclusive. Nous avons observé qu’elles peuvent toutefois se retrouver simultanément liées au bout barbé, au sein d’un complexe à courte durée de vie. Ce complexe ternaire est capable de stopper l’activité du bout barbé même si l’affinité d’une protéine est réduite par la présence de l’autre. Nous proposons qu’une compétition entre la protéine de coiffe et la formine régule la dynamique du bout barbé dans des architectures où les longueurs doivent être hautement contrôlées.J’ai ensuite étudié l’influence de divers facteurs sur la processivité. La processivité est très sensible à la présence du sel et à la fraction demarquage fluorescent utilisée dans nos expériences. Nous avons également observé l’effet de la vitesse d’élongation, qui peut être modifiée en changeant la concentration en actine ou en profiline. D’une part, l’actine réduit la processivité, à n’importe quelle concentration de profiline. D’autre part, la concentration en profiline augmente cette processivité,indépendamment du taux d’élongation. Cela suggère qu’une incorporation de monomère diminue la processivité, tandis que la profiline, par sa présence au bout barbé, l’augmente.Enfin, la tension exercée sur les formines abaisse fortement la processivité : quelques piconewtons réduisent la processivité de plusieurs ordres de grandeurs. Cet effet, purement mécanique, prédomine sur les facteurs biochimiques. Ces résultats nous indiquent que les contraintes mécaniques de tension joueraient un rôle prédominant dans le contexte cellulaire. Cette étude nous aide à construire un modèle plus complet de l’élongation processive par les formines.En conclusion, ce projet permet de mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de la formine, en particulier le mécanisme de l’élongation processive et de sa régulation / Actin filament assembly plays a pivotal role in cellular processes such as cell motility, morphogenis or division. Elucidating how the actin cytoskeleton is globally controlled remains a complex challenge. We know that it is orchestrated both by actin regulatory proteins and mechanical constraints.The formin protein is an essential actin regulator. Anchored to the cell membrane, it is responsible for the assembly (nucleation and elongation) of actin filaments found in linear and unbranched architectures. It is notably involved in the generation of filopodia protrusions at the leading edge of a motile cell. One important feature is that it processively tracks the barbed end of an actin filament, while stimulating its polymerization in the presence of profilin.Formin processivity and its regulation is not yet completely understood. As an important factor determining the length of the resulting filament, it must be investigated further.A perfect assay to look at formin processivity in vitro is an innovative microfuidics assay coupled to TIRF microscopy, pioneered by the team, to simultaneously track tens of individual filaments. In a designed chamber,filaments are anchored to the surface by one end, and aligned with the solution flow. We can precisely control the biochemical environment of the filaments. Moreover, we can exert and modulate forces on filaments, due to the viscous drag of flowing solutions. By varying chemical conditions during formin action at the barbed end, I investigated how others proteins or the elongation rate can modulate formin processivity, by looking at the detachment rate of formins.Moreover, we can mimic the membrane anchoring in the cell by specifically attaching formins at the surface. In our chamber, through the filament they elongate, we can apply force to formins.In complement to biochemical studies, we then investigate the effect oftension on their processivity.I first investigated the impact of a capping protein on formin action at the barbed end. Their barbed end binding is thought to be mutually exclusive.We measured that the affinity of one protein is reduced by the presence of the other. However we observed they both can bind simultaneously the barbed end, in a transient complex, which block barbed end elongation.Competition of formin and CP would regulate barbed end dynamics in a cell situation where length is tightly controlled.I next studied formin processivity dependence on various parameters. We show that processivity is sensitive to salt and labelling fraction used in our solutions. We also looked at how processivity is affected by the elongation rate, which can either be varied by actin or profilin concentration. On one hand, actin concentration reduces processivity, at any given concentrationsof profilin. On the other hand, raising the concentration of profilin increasesprocessivity, regardless of the elongation rate. This indicates that theincorporation of actin monomers decreases processivity while in contrast,the presence of the profilin at the barbed end increases it.Moreover, tension exerted on formin was observed to largely favor its detachment. In a quantitative matter, the effect of tension prevails over anyothers biochemical factor on processivity : only a few piconewtons decreaseit by several orders of magnitude. This important effect helps us build amore complete model of processive elongation. These results indicate thatmechanical stress is likely to play an important role in a cellular context.In conclusion, this project brings insights into the molecular properties offormin and helps to decipher the mechanism of processive elongation and its regulation.

La division cellulaire asymétrique est un processus crucial dans le développement des organismes multicellulaires puisqu’elle permet la génération de la diversité cellulaire. Les cellules qui se divisent de façon asymétrique doivent tout d’abord se polariser et correctement orienter leur fuseau mitotique pour ségréger des déterminants cellulaires en deux entités distinctes. L’embryon du nématode C. elegans est un modèle robuste et largement utilisé pour étudier la division cellulaire asymétrique. Dans cet embryon, le point d'entrée du spermatozoïde détermine l'axe de polarité antéro-postérieur. Suite à la fécondation, le cortex embryonnaire est uniformément contractile et un complexe conservé formé des protéines PAR-3, PAR-6 et PKC-3 (nommé complexe PAR-3 ci-dessous) est localisé sur l'ensemble du cortex. La complétion de la méiose maternelle induit une relaxation corticale au postétieur et un flux cortical vers l’antérieur de l’embryon. Ces contractions corticales asymétriques mènent à la formation d'un domaine antérieur contenant le complexe PAR-3, tandis que le cortex postérieur, dont le complexe PAR-3 s’est délocalisé, est enrichi avec les protéines PAR-2 et PAR-1. Par conséquent, les domaines formés par les protéines PAR définissent un pôle antérieur et un pôle postérieur dans l'embryon suite au remodelage du cytosquelette. Les protéines PAR-4 et PAR-5 restent localisées de façon uniforme dans l'embryon. Curieusement, les protéines PAR exercent une régulation par rétroaction sur la contractilité corticale. Il a été montré qu’une des protéines PAR récemment identifiée, PAR-5, est orthologue à la protéine adaptatrice 14-3-3 et joue un rôle important dans la contractilité corticale. En dépit de son rôle central dans la contractilité corticale et le processus de polarisation cellulaire, le mécanisme par lequel PAR-5 régule la contractilité corticale n’est pas bien compris. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment PAR-5 et ses interacteurs contrôlent la régulation des contractions corticales et, de ce fait, la polarité cellulaire. Dans un essai de capture de la protéine GST (GST pull-down), nous avons identifié plusieurs nouveaux interacteurs de PAR-5. Parmi ceux-ci, nous avons trouvé CAP-2 (protéine de coiffage de l'actine), qui a été identifiée dans des éxpériences de capture de 14-3-3 dans trois systèmes modèles différents. CAP-2 est un hétérodimère des protéines CAP, qui sont impliquées dans la régulation de l'actine. Nous avons trouvé que la déplétion des protéines CAP par interférence à l’ARN dans des vers de type sauvage mène à une augmentation létalité embryonnaire, ce qui suggère que ces protéines jouent un rôle important dans le développement embryonnaire. L'imagerie en temps réel d'embryons déplétés pour les protéines CAP montre qu’ils ont une diminution des contractions corticales avec un sillon de pseudoclivage mois stable, suggérant un défaut dans la régulation du cytosquelette d'actine-myosine. Ceci a également été confirmé par la diminution de la vitesse et du nombre de foci de NMY-2::GFP. En outre, ces embryons montrent une légère diminution de la taille du croissant cortical de PAR-2 lors de la phase d’établissement de la polarité. Les embryons déplétés en CAP-2 montrent également un retard dans la progression du cycle cellulaire, mais le lien entre ce phénotype et la régulation des contractions corticales reste à être précisé. La caractérisation des protéines CAP, des régulateurs du remodelage du cytosquelette, permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire, et donc la division cellulaire asymétrique. / Asymmetric cell division is a crucial step in organism development, as it allows the generation of cellular diversity. In order to achieve asymmetric division cells need to polarize their cell fate determinants and properly orient their mitotic spindle before division. The C. elegans embryo is a powerful and widely used model to study asymmetric cell division. In the embryo the sperm entry site determines the anterior-posterior axis of polarity. In the newly fertilized embryo, shortly after meiosis, the cortex is uniformly contractile and the conserved PAR-3/PAR-6/PKC-3 complex (hereafter referred to as the PAR-3 complex) is localised on the entire cortex. Entry of the sperm triggers posterior smoothening and anterior-directed cortical flows. Asymmetric cortical contractions result in the formation of an anterior domain containing the PAR-3 complex, while the posterior-pole cortex, depleted of the PAR-3 complex, is enriched in PAR-2 and PAR-1 proteins. Therefore PAR domains define an anterior and a posterior pole of the embryo in response to cytoskeleton remodelling. The PAR-4 and PAR-5 proteins remain localized uniformly throughout the embryo. Intriguingly, the PAR proteins exert a feedback regulation on cortical contractility. PAR-5, one of the lately identified PAR proteins, was shown to be an ortholog of the adaptor protein 14-3-3 and to play an important role in cortical contractility. Despite its central role in cortical contractility and henceforth the polarization process, little is known on how PAR-5 regulates cortical contractility. The aim of this project is to better understand the regulation of cortical contractions via the PAR-5 protein and its interactors, and how they control cell polarity. In a GST pull down assay we identified several new interactors of PAR-5. Among these we found CAP-2 (actin capping protein), which was also pulled down with 14-3-3 in three different model systems. CAP-2 has been implicated in actin regulation. Interestingly we found that depletion of CAP proteins by RNA interference in wild type worms results in increased embryonic lethality, suggesting an important role in embryonic development. Live imaging of embryos depleted of CAP proteins shows that these embryos have decreased cortical contractions with a less stable pseudo cleavage furrow, indicating a defect in the regulation of the actin-myosin cytoskeleton. This was further confirmed by the decreased velocity and the number of NMY-2::GFP foci in CAP depleted embryos. Furthermore, these embryos show mild decrease in PAR-2 domain size during the polarity establishment phase. cap-2(RNAi) embryos also show a delay in cell cycle progression, however the role of the cell cycle delay in the regulation of cortical contractions has to be determined. The characterization of CAP proteins, which are cytoskeleton-remodeling regulators, will improve our understanding of the mechanisms underling the establishment and maintenance of cell polarity, and thereby asymmetric cell division.