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Levantamento de bacteriofagos liticos : isolamento e caracterização de virus provenientes de esgoto comum com potencial aplicação antimicrobiana / Survey of lytic bacteriophages: isolation and characterizatio of virus proceeding from raw sewage with potential antimicrobial applicationGregoracci, Gustavo Bueno 17 February 2006 (has links)
Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2006 / Resumo: Os bacteriófagos, vírus que infectam procariotos, são as entidades biológicas mais numerosas do globo. Sua abundância desencadeou revisões em diversos campos como genética, evolução e ecologia, e os fagos atualmente são reconhecidos como importantes vetores para o fluxo de matéria, energia e informação em ambientes naturais. Contudo, há uma enorme diferença entre a quantidade de bacteriófagos estimada no globo (mais de 1030 partículas virais) e a quantidade descrita na literatura (em torno de 5300 amostras). Esta amostragem restrita reflete complicações para estudos de diversidade viral e demonstra as limitações de nosso conhecimento sobre estes vírus. Além disso, a emergência de bactérias resistentes a múltiplos antibióticos implica em uma necessidade de novas práticas terapêuticas, e os fagos representam uma alternativa digna de estudos aprofundados. Assim sendo, este trabalho objetivou o isolamento, a partir de esgoto, e a caracterização biológica de bacteriófagos líticos contra patógenos humanos, visando ampliar a amostragem destes vírus e selecionar novos possíveis agentes terapêuticos. A caracterização envolveu análises morfológica, genética e de especificidade de hospedeiros. As metodologias adaptadas de isolamento e caracterização permitiram a análise de mais de 20 bacteriófagos, todos pertencentes à ordem Caudovirales, bem como de uma proposição para a classificação taxonômica dos isolados. Merece destaque especial o isolamento de três fagos contra Chromobacterium violaceum, feito inédito na literatura, bem como estudos sobre a suscetibilidade deste organismo a diversos bacteriófagos isolados. Por fim, ensaios biológicos sugerem estudos posteriores sobre a aplicação de um destes fagos, denominado Shfl1, para a terapia de Shigella flexneri em infecções humanas, mas são incertos quanto ao potencial do mesmo para contenção deste patógeno no processamento de esgoto comum / Abstract: Bacteriophages, viruses that infect prokaryotic hosts, are the most numerous biological entities of the world. Their abundance implied in reviews in several areas of knowledge, like genetics, evolution and ecology, and phages are now recognized as important vectors in the flux of matter, energy and information in natural environments. However, there is a huge difference between the estimated number of bacteriophages in the world (more than 1030 viral particles) and the quantity described in the literature (around 5300 samples). This restricted sampling reflects in complications to studies of viral diversity and demonstrates our limited knowledge regarding these viruses. Furthermore, the emergence of bacteria resistant to multiple antibiotics implies in a need for new therapeutical approaches, and phages represent an alternative worthy of additional studies. As being so, our purpose in this study was to isolate, from raw sewage, and to biologically characterize lytic bacteriophages, intending to extend these viruses¿ sampling and to select possible new therapeutic agents. Characterization involved morphological, genetic and host range analysis. The adapted protocols for isolation and characterization permitted the analysis of more than 20 bacteriophages, all belonging to the Caudovirales order, as well as a tentative taxonomic classification of the samples. Other distinctive results include the isolation of three bacteriophages against Chromobacterium violaceum, previously unknown in the literature, as well as the study about the susceptibility of this organism to several isolated phages. Moreover, biological assays suggested further studies about the application of one of these phages, named Shfl1, in the treatment of Shigella flexneri infections in humans, but were uncertain about the potential of the same virus to restrain this pathogen during sewage processing / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular
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Estudo do efeito da interferencia por RNA (RNAi) na replicação do metapneumovirus aviario (AMPV) subtipo A in vitro / The effect of RNA interference (RNAi) in avian metapneumovirus (AMPV) subtype A in vitro aplicationFerreira, Helena Lage 02 December 2007 (has links)
Orientador: Clarice Weis Arns, Renata Servan de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2007 / Resumo: O metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente primário da rinotraqueíte dos perus (TRT). O AMPV pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovirus. Também está associado à síndrome da cabeça inchada (SHS) em galinhas e é responsável por significativas perdas econômicas em sua produção. O presente estudo foi dividido em três partes. A primeira parte do trabalho
consistiu em avaliar a beta-actina, gene utilizado como controle interno das técnicas moleculares de detecção viral, das células chicken embryo related (CER). Para isso, foi realizado o sequenciamento dos amplicons gerados pelo PCR do gene da beta-actina. A beta-actina das células BHK21 e CER foram detectadas utilizando oligonucleotídeos hamster-específicos. Além disso, pela análise filogenética as células CER e BHK21 apresentaram uma alta similaridade genética (p>0.996). Estes resultados sugerem que as células CER não deveriam ser mais consideradas como
células aviárias. A segunda parte do estudo consistiu em comparar a especificidade e limite de detecção de duas novas técnicas de RT-PCR convencional (genes da nucleoproteína (N) e da proteína de fusão -F) e de duas novas técnicas de real time RT-PCR (RRT-PCR; genes F e N) com um RT-PCR (gene da glicoproteína -G) previamente estabelecido para a detecção do AMPV. Todos estes métodos foram capazes de detectar os isolados AMPV subtipo A (AMPV/A). As técnicas RRT-PCR (genes F e N) foram capazes de amplificar os maiores limites de detecção (diluições
10-5 e 10-5, respectivamente). Além disso, o RRT-PCR gera resultados rápidos e sensíveis, o que o torna uma ferramenta alternativa para o isolamento viral. Na terceira parte, foi realizado o silenciamento gênico de AMPV pela aplicação de seqüências curtas e específicas de RNA (siRNAs, do inglês short interfering RNA) para regiões alvo do genoma viral. Assim, foram desenhadas moléculas de siRNA contra os genes N e F do AMPV. Três dias após a infecção viral, o efeito do siRNA na replicação viral foi verificado por titulação viral, RRT-PCR e RT-PCR. Os títulos
virais das células CER transfectadas com o siRNA/N apresentaram queda de até 99,9% em relação ao controle. A produção de mRNAs para os genes N, F e G do AMPV também apresentou uma redução de até 99,7%. Desta forma, a molécula de siRNA contra o gene N foi capaz de inibir a replicação do AMPV in vitro. Em estudos futuros, a associação de siRNAs tendo como alvo o complexo da RNA polimerase deve ser avaliada como uma eficiente ferramenta para evitar o escape viral na terapia antiviral / Abstract: Avian metapneumovirus (AMPV) is the primary causative agent of severe rhinotracheitis in turkeys. AMPV belongs to the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, within the genus Metapneumovirus. It is associated with swollen head syndrome in chickens and is the source of significant economic losses to animal food production. The present study is divided in three parts. In the first part,
the chicken embryo related (CER) cells beta-actin was evaluated. The CER beta actin gene was amplified by RT-PCR, and the amplicon was sequenced. The BHK21 and CER beta-actins were detected using hamster-specific primers. The results showed that such cells are closely related to BHK21 (p > 0.966), having a p-distance of 0.7 from chicken embryo fibroblasts. This confirms that CER cells are phylogenetically
closely related to BHK21 cells. The second part of the study, we compared the specificity and detection limits of two newly designed conventional RT-PCRs (F and N genes) and two newly defined real time RT-PCR (RRT-PCR; (F and N genes), with an established RT-PCR (G gene) for AMPV detection. All the RT-PCR tested assays were able to detect the six isolates. The higher detection limits were observed at 10-5-
fold and 10-5-fold dilutions of the N- and F- based RRT-PCR, respectively. Important to note that RRT-PCR assays generate fast and sensitive results, becoming a feasible alternative for virus isolation. In the third part, the silencing of AMPV by targeting its viral regions was promoted. We designed specific short interfering RNA (siRNA) targeting the nucleoprotein (N) and fusion (F) genes. Three days after the virus infection, the effect of siRNA in the virus replication was verified by virus titration, real time RT-PCR, and RT-PCR assays. AMPV titers presented reduction by
99.9%, when compared to the siRNA/F and siRNA/GFP treated samples. Also, real time RT-PCR results presented reduction of AMPV N, F and G mRNAs by 99.7%, when transfected with siRNA/N. Therefore, an siRNA sequence targeting the N gene was able to inhibit the AMPV production in vitro. In future studies, a combination of siRNAs targeting the RNA-polymerase complex may be used as a tool to study AMPV-infected cells or as an antiviral therapy / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular
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