Orientador: Clarice Weis Arns, Renata Servan de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_HelenaLage_D.pdf: 2290087 bytes, checksum: 244512a14adbf81da5ab74893d3c12b2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente primário da rinotraqueíte dos perus (TRT). O AMPV pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovirus. Também está associado à síndrome da cabeça inchada (SHS) em galinhas e é responsável por significativas perdas econômicas em sua produção. O presente estudo foi dividido em três partes. A primeira parte do trabalho consistiu em avaliar a beta-actina, gene utilizado como controle interno das técnicas moleculares de detecção viral, das células chicken embryo related (CER). Para isso, foi realizado o sequenciamento dos amplicons gerados pelo PCR do gene da beta-actina. A beta-actina das células BHK21 e CER foram detectadas utilizando oligonucleotídeos hamster-específicos. Além disso, pela análise filogenética as células CER e BHK21 apresentaram uma alta similaridade genética (p>0.996). Estes resultados sugerem que as células CER não deveriam ser mais consideradas como células aviárias. A segunda parte do estudo consistiu em comparar a especificidade e limite de detecção de duas novas técnicas de RT-PCR convencional (genes da nucleoproteína (N) e da proteína de fusão -F) e de duas novas técnicas de real time RT-PCR (RRT-PCR; genes F e N) com um RT-PCR (gene da glicoproteína -G) previamente estabelecido para a detecção do AMPV. Todos estes métodos foram capazes de detectar os isolados AMPV subtipo A (AMPV/A). As técnicas RRT-PCR (genes F e N) foram capazes de amplificar os maiores limites de detecção (diluições 10-5 e 10-5, respectivamente). Além disso, o RRT-PCR gera resultados rápidos e sensíveis, o que o torna uma ferramenta alternativa para o isolamento viral. Na terceira parte, foi realizado o silenciamento gênico de AMPV pela aplicação de seqüências curtas e específicas de RNA (siRNAs, do inglês short interfering RNA) para regiões alvo do genoma viral. Assim, foram desenhadas moléculas de siRNA contra os genes N e F do AMPV. Três dias após a infecção viral, o efeito do siRNA na replicação viral foi verificado por titulação viral, RRT-PCR e RT-PCR. Os títulos virais das células CER transfectadas com o siRNA/N apresentaram queda de até 99,9% em relação ao controle. A produção de mRNAs para os genes N, F e G do AMPV também apresentou uma redução de até 99,7%. Desta forma, a molécula de siRNA contra o gene N foi capaz de inibir a replicação do AMPV in vitro. Em estudos futuros, a associação de siRNAs tendo como alvo o complexo da RNA polimerase deve ser avaliada como uma eficiente ferramenta para evitar o escape viral na terapia antiviral / Abstract: Avian metapneumovirus (AMPV) is the primary causative agent of severe rhinotracheitis in turkeys. AMPV belongs to the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, within the genus Metapneumovirus. It is associated with swollen head syndrome in chickens and is the source of significant economic losses to animal food production. The present study is divided in three parts. In the first part, the chicken embryo related (CER) cells beta-actin was evaluated. The CER beta actin gene was amplified by RT-PCR, and the amplicon was sequenced. The BHK21 and CER beta-actins were detected using hamster-specific primers. The results showed that such cells are closely related to BHK21 (p > 0.966), having a p-distance of 0.7 from chicken embryo fibroblasts. This confirms that CER cells are phylogenetically closely related to BHK21 cells. The second part of the study, we compared the specificity and detection limits of two newly designed conventional RT-PCRs (F and N genes) and two newly defined real time RT-PCR (RRT-PCR; (F and N genes), with an established RT-PCR (G gene) for AMPV detection. All the RT-PCR tested assays were able to detect the six isolates. The higher detection limits were observed at 10-5- fold and 10-5-fold dilutions of the N- and F- based RRT-PCR, respectively. Important to note that RRT-PCR assays generate fast and sensitive results, becoming a feasible alternative for virus isolation. In the third part, the silencing of AMPV by targeting its viral regions was promoted. We designed specific short interfering RNA (siRNA) targeting the nucleoprotein (N) and fusion (F) genes. Three days after the virus infection, the effect of siRNA in the virus replication was verified by virus titration, real time RT-PCR, and RT-PCR assays. AMPV titers presented reduction by 99.9%, when compared to the siRNA/F and siRNA/GFP treated samples. Also, real time RT-PCR results presented reduction of AMPV N, F and G mRNAs by 99.7%, when transfected with siRNA/N. Therefore, an siRNA sequence targeting the N gene was able to inhibit the AMPV production in vitro. In future studies, a combination of siRNAs targeting the RNA-polymerase complex may be used as a tool to study AMPV-infected cells or as an antiviral therapy / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Dagmar Ruth Stach-Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T14:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coswig_LiaTreptow_D.pdf: 19863975 bytes, checksum: 7e0e923baa4947ed3f77ff3ca34747e9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: o Metapneumovírus Aviário (AMPV), também denominado vírus da rinotraqueíte dos perus (TRT), é um vírus que acomete e causa infecção no trato aéreo superior das galinhas e perus. Além da infecção respiratória, em poedeiras e matrizes está associado com uma queda significativa na produção de ovos. Em galinhas o vírus está relacionado com a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI), uma enfermidade multifatorial, e por este motivo é importante o diagnóstico diferencial. Testes realizados com anticorpos monoclonais (Mabs) e técnicas moleculares são capazes de detectar diferenças entre os subtipos do vírus. Os métodos de diagnóstico incluem isolamento ou detecção da partícula viral ou testes sorológicos. O isolamento das amostras virais SHS-BR-121 (subtipo A) e STG-SHS-1439 (subtipo B) foi realizado em cultura de anel de traquéia, em fibroblasto de embrião de galinha (FEG) e em células chicken embryo related (CER). A comparação das médias dos títulos obtidos para as duas amostras virais, em célula CER, apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,014) com p< 0,05. Neste projeto foi avaliada a suscetibilidades de seis sistemas celulares (CER, Vero, BHK-21, HEp-2, MDBK e ED) para a multiplicação das duas amostras virais (subtipos A e B). Destes sistemas as células CER, Vero e BHK-21 demonstraram ser apropriadas para a replicação vira!. Os títulos nestas células variaram de 105.5 a 107,o/mL DICC50 , para o vírus SHS-BR-121, e 105,5 a 106.0/mL DICC50 para o vírus STG-SHS-1439. As diferenças entre as médias dos títulos nos diferentes sistemas celulares foi estatisticamente significativa para a amostra SHS-BR-121 inoculada em CER em relação as células Vero e BHK-21 (P= 0,01 e P=0,004, respectivamente) com p< 0,05. Para a amostra STG-SHS-1439 não houve diferença estatística significativa, com p<0,05. A curva da cinética viral foi realizada para as duas amostras virais, em três sistemas celulares, CER, Vero e BHK-21, demonstrando estas diferenças. Foram produzidos anticorpos monoclonais contra o AMPV isolado no Brasil, sendo obtidos cinco anticorpos monoclonais para o antígeno viral através da fusão celular que apresentaram os isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b quando da isotipagem. Dos cinco anticorpos monoclonais, três possuíam atividade neutralizante e quatro deles inibiram a fusão invitro. No teste de soroneutralização cruzada foram utilizadas três amostras virais para a análise, sendo elas SHS-Br-121, STG 854/88 e TRT-SHS-1439. Todos os anticorpos monoclonais apresentaram resultado positivo em relação à amostra homóloga, sendo que três apresentaram resultados positivos também para as amostras heterólogas. Os resultados confirmam que os dois anticorpos monoclonais descritos podem ser utilizados com importante ferramenta nos estudos epizootiológicos e para o diagnóstico específico dos subtipos na infecção pelo Metapneumovírus Aviário / Abstract: Avian Metapneumovirus (AM PV) , also denominated virus of the rhinotracheitis of the turkeys, it is a virus that attacks and it causes infection in the upper respirator) tract of chickens and turkeys. Besides the respiratory infection, in breeders and layers is associated with a significant fall in the production of eggs. In chickens the virus is related with the Swollen Head Syndrome (SHS), an illness multifactorial and for this reason it is very important the differential diagnosis. Tests accomplished with monoclonal antibodies (Mabs) and molecular techniques are capable to detect differences among the subtypes of the virus. Methods for the diagnosis of AMPV infections include detection or isolation of the virus itself, demonstration of a specific antibody response to the virus. For the primary isolation of the two samples of AMPV SHS-BR-121 (subtype A) and STG-SHS-1439 (subtype B) was it accomplished ir chicken embryo tracheal" organ culture (TOC), in chicken embryo fibroblast cell culture (CEF) and was it accomplished in cell line chicken embryo related (CER). Done the comparison of the averages of the titers obtain for the two strains, in cellline CER, did present statistically significant difference (P=0,014) with p< 0,05. The growth of SHS121-BR and STG-SHS-1439 was evaluated in six different celllines (CER, Vero, BHK21, HEp-2, MDBK and ED). CER, Vero and BHK-21 showed to be the most appropriate for virus multiplication. The titers in these cells varied from 105.5 to 107,o/mL !CID50, for the virus SHS-BR-121, and 105,5 to 106,o/mL TCID50 for the virus STG-SHS71439. The differences among the averages of the titers in the different cell lines was statistically significant differences (P=0,01) with p<0,05 for the strain SHS-BR-121 in CER cellline. One-step growth curves of the strains SHS-BR-121 and STG-SHS-1439 in CER, Vero and BHK-21 showed that there was not statistically significant difference in the infectious virus titers from 0 to 60 hours after infection. Five monoclonal antibodies were obtained for the viral antigen through the cell fusion that showed the isotypes IgG1, IgG2a and IgG2b, when of the characterization of Mabs. Three of them showed neutralizing activity and four inhibited the fusion in vitro. These MAbs were used to investigate antigenic relationship among three strains (SHS-BR-121, STG 854/8o/and TRT1439/91) of a MPV subtypes A and B using cross-neutralization test. When the five hybridomas were analyzed showed result positive for the homologus virus. In relation t4 two samples of heterologus AMPV three Mabs were positive to heterologus AMPV. Th4 results confirm that the two monoclonal antibodies described can be used as a valuable tool in the epizootiological and serological studies, and also for the specific diagnosis o the subtypes in the infection for Avian Metapneumovirus / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RT-PCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPV-Infektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen.

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martini_MatheusCavalheiro_M.pdf: 571995 bytes, checksum: 52ec8a0bed8fa3efd4434ec2a2e6a100 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Para avaliar a atividade antiviral dos extratos de plantas brasileiras foram eleitos o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus Respiratório sincicial bovino (BRSV) pertences à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gêneros Metapneumovirus e Pneumovirus respectivamente. Tanto o aMPV quanto o BRSV são vírus semelhantes aos que causam doenças em humanos como o vírus respiratório sincicial humano (HRSV) e metapneumovírus humano (hMPV). O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antiviral de 12 diferentes espécies de plantas: Pterodon emarginatus Vogel.; Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.; Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen; Virola sebifera Aubl.; Gaylussacia brasiliensis (Spreng.) Meisn.; Maytenus ilicifolia (Schrad.) Planch.; Bursera aloexylon (Schiede ex Schltdl.) Engl.; Aspidosperma tomentosum Mart.; Copaifera langsdorffii Desf; Baccharis dracunculifolia DC.; Arrabideae chica (Humb. & Bonpl.) B.Verl.; Aniba rosaeodora Ducke (Lin 3). Para realizar os estudos antivirais foi utilizada concentrações máximas não tóxicas para as diferentes linhagens celulares utilizadas frente aos dois vírus. Para os ensaios antivirais foram utilizadas a linhagens CER (Chicken embryo related cells) e CRIB (bovine viral diarrhea virus-resistant clone of MDBK cells) para o aMPV e BRSV respectivamente. Os extratos brutos com atividade antiviral foram submetidos a uma curva concentração resposta com diferentes concentrações de extrato na presença de 100 DICC/mL de cada amostra viral através do ensaio colorimétrico MTT [3-(4,5- dimetiltiazol-z-yl)-2,5 difeniltertrazolim brometo] determinando assim a concentração antiviral 50% (EC50). Para determinar o mecanismo de ação dos extratos e os vírus nas células foram utilizados três diferentes tratamentos: (i) Pré-tratamento (célula tratada com extrato e posterior inoculação com a amostra viral); (ii) Pós-tratamento (célula inoculada com a amostra viral e depois tratada com o extrato); (iii) Virucida (extrato e vírus mantidos juntos e posterior inoculação na cultura celular). O extrato foi considerado ativo quando houve diminuição do título viral em 1,5 log em relação ao titulo viral controle. Os resultados mostraram que todos os extratos testados obtiveram concentrações não tóxicas para as diferentes linhagens celulares. Em relação à atividade antiviral o extrato da espécie Aspidosperma tomentosum apresentou atividade frente ao BRSV e aMPV, ambos no pré-tratamento. Os extratos das espécies Virola sebifera; Arrabidaea chica; Gaylussacia brasiliensis e Anniba rosaeodora apresentaram atividade antiviral para o aMPV no pós-tratamento. Nenhum extrato bruto apresentou atividade de "vírus-inativação" em relação aos vírus avaliados. Os demais extratos não apresentaram atividade antiviral significativa para nenhum destas espécies virais. O ensaio antiviral deste estudo poderá continuar sendo utilizado como triagem para outras espécies em busca de substâncias com potencial medicinal. As diferentes atividades de ação dos extratos sugerem a ocorrência de mecanismo de ação distinto entre os vírus avaliados / Abstract: To evaluate the antiviral activity of extracts from Brazilian plants two different viruses were elected Avian metapneumovirus (aMPV) and bovine respiratory syncytial virus (BRSV) members of the family Paramyxoviridae, subfamily Pneumovirinae, Pneumovirus and Metapneumovirus genera respectively. Both viruses are similar to those that cause humans diseases such as respiratory syncytial virus (HRSV) and human metapneumovirus (hMPV). The purpose of this study was to assess the antiviral activity of 12 different plant species: Pterodon emarginatus Vogel; Kielmeyera coriácea Mart. & Zucc.; Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen; Virola sebifera Aubl.; Gaylussacia brasiliensis (Spreng.) Meisn.; Maytenus ilicifolia (Schrad.) Planch. ex. Reiss; Bursera aloexylon (Schiede ex Schltdl.) Engl.; Aspidosperma tomentosum Mart.; Copaífera langsdorffii Desf.; Baccharis dracunculifolia DC.; Arrabideae chica (Humb. & Bonpl.) B.Verl.; Aniba rosaeodora Ducke. (Lin 3). To perform the antiviral assay we used non toxic maximum concentrations of the plants extracts with different cell lines used against the two viruses. The cell lines used were CER (Chicken embryo related cells) and CRIB (bovine viral diarrhea resistant clone of MDBK cells) for AMPV and BRSV, respectively. The extracts with antiviral activity were subjected to a concentration response curve with varying concentrations of extract in the presence of 100 TCID / mL of each viral sample by colorimetric MTT assay [3 - (4,5- dimethylthiazol-z-yl) -2 , 5-diphenyltetrazolium bromide] to identify the antiviral 50% concentration (EC50). To define the mechanism of action of extracts and viruses in cells three different treatments were used: (i) pre-treatment (cells treated with plants extracts and subsequent inoculation with a viral sample), (ii) Post-treatment (cells inoculated with the viral sample and afterwards treated with the extract), (iii) Virucidal (viruses and plants extracts were kept together and after that inoculated into cell cultures). The extract was considered active when there was a decrease of virus titers by 1.5 log in contrast to the control viral titer. The results revealed that all tested extracts had no toxic concentrations for the different cell lines and detected the antiviral activity of the extract of the species Aspidosperma tomentosum against the BRSV and aMPV, both in the pretreatment conditions. The extracts of the species Virola sebifera; Arrabidaea chica; Gaylussacia brasiliensis and Anniba rosaeodora (Lin 3) exhibited antiviral activity for aMPV after treatment. The other extracts showed no significant antiviral activity for any of these viral species. The antiviral test of this study may still be used as screening for other species in search for substances with medicinal potential. The varied action activities of the extracts suggest that the occurrence of distinct mechanism of action between the viruses evaluated / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sakata_SoniaTatsumi_M.pdf: 14113239 bytes, checksum: 26dfdfbc0c87c2a3a37c6143072df6c6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Produtos naturais isolados a partir de invertebrados e organismos marinhos tem sido objeto de pesquisas contínuas ao longo dos últimos cinquenta anos, principalmente devido à sua complexidade estrutural e potentes atividades biológicas. O presente trabalho teve como proposta ampliar e aprofundar a investigação de substâncias bioativas em extratos de organismos marinhos, junto ao IQSC-USP/Projeto temático, realizando bioensaios de atividade antiviral no laboratório de virologia da Unicamp. Com o objetivo de realizar uma triagem para pesquisar substâncias com ação antiviral, foram eleitas duas espécies de vírus de destaque na avicultura, o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus da Doença de Newcastle (NDV), representantes da família Paramyxoviridae. As propriedades em comum dos vírus dentro das respectivas subfamílias, como a organização genômica, sequências das proteínas e suas atividades biológicas, permitem a utilização do aMPV como modelo de estudo para importantes agentes infecciosos da subfamília Pneumovirinae, e o NDV da subfamília Paramyxovirinae. Para a triagem de compostos antivirais foi realizada a avaliação in vitro na linhagem celular Chicken Embryo Related (CER) para a propagação dos vírus e analisar os resultados de inibição viral frente a diferentes extratos e substâncias. Dos cento e vinte e cinco extratos testados frente ao aMPV, sete demonstraram ser ativos, e seis com alto potencial antiviral. Inicialmente, cento e quarenta e sete extratos foram testados frente ao NDV, porém, o resultado foi inconclusivo devido a problema com o título da amostra viral. Assim, os sete extratos ativos e os seis com alto potencial antiviral contra o aMPV foram testados quanto à capacidade de inibição do NDV. Apesar das similaridades dos vírus da família Paramyxoviridae, os extratos não tiveram atividade contra o NDV, como ocorreu frente ao aMPV. As amostras ativas foram estudadas em três tipos de tratamento a fim de determinar os possíveis mecanismos de ação dos extratos: Pré-tratamento, fases de adsorção e/ou penetração do vírus na célula; Pós-tratamento, etapas intracelulares de replicação do vírus; e Inativação Viral. Pela análise visual do efeito citopático, os sete extratos ativos contra aMPV, quatro interrompem as etapas intracelulares de replicação do vírus, dois agem nas fases de adsorção e/ou penetração do vírus à célula, e um não tinha quantidade suficiente para realizar o teste. Com a finalidade de avaliar os possíveis mecanismos de ação com maior objetividade, menor risco de contaminação e alta especificidade, testou-se a metodologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Utilizando um composto puro (pirocina A) frente ao aMPV em CER, a metodologia se demonstrou eficiente. Esse dado foi confirmando pela diminuição de RNA viral quando ocorre a atividade antiviral, dando indícios de atuação do composto em etapas intracelulares de replicação do aMPV. A detecção de extratos com atividade antiviral nas situações testadas neste trabalho corrobora o valor da biodiversidade marinha como fonte de produtos promissores na terapêutica de enfermidades virais. Portanto, a necessidade de estudos sobre esses vírus e do desenvolvimento de novos insumos a serem utilizados nos seus controles é de grande importância ponderado a crescente projeção da indústria avícola brasileira no comércio mundial / Abstract: Natural products isolated from invertebrates and marine organisms have been studied over the past fifty years, mainly due to their structural complexity and potent biological activities. This project was proposed to broaden and deepen the research of bioactive substances in extracts of marine organisms, with the IQSC-USP group, performing bioassays antiviral activity in the laboratory of virology at Unicamp. In order to perform a screening to search antiviral substances were elected two species prominent in poultry, the avian Metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV), representatives of the family Paramyxoviridae. The common properties of the virus within their respective subfamilies, such as genomic organization, sequences of proteins and their biological activities, allow the use of aMPV as a study model for important infectious agents of Pneumovirinae subfamily, and NDV Paramyxovirinae subfamily. For antiviral screening, compounds were tested in vitro using Chicken Embryo Related (CER) cell lineage for the propagation of the virus and analyze the results of viral inhibition against various substances. Among one hundred twenty five extracts tested against aMPV, seven were actives and six have been shown high antiviral potential against the virus. Initially, one hundred fourty seven extracts were tested against NDV. However, the result was inconclusive due to problems with the titer of the viral sample. Thus, the seven active extracts and six extracts with high antiviral potential against the aMPV were tested for the ability to inhibit NDV. Despite the similarities of viruses of the family Paramyxoviridae, the extracts had no activity against NDV, as occurred against aMPV. The active samples were studied in three types of treatment in order to determine the possible mechanisms of action of the extracts: Pre-treatment, stages of adsorption and / or penetration of the virus into the cell; Post-treatment, intracellular steps of virus replication; and Viral Inactivation. At visual analysis of cytopathic effect, from all 7 extracts active against aMPV, 4 disrupt intracellular steps of virus replication, 2 acts on adsorption and / or penetration stages of the virus into the cell, and 1 was not enough to perform the test. In order to assess the possible mechanisms of action more objectively, lower contamination risk and high specificity, the polymerase chain reaction (PCR) in real time methodology was tested. Using a pure compound (pirocina A) against aMPV in CER cell lineage, the methodology is demonstrated efficient. This was confirmed by the decrease of viral RNA when occurs antiviral activity, an evidence of compound's action on intracellular steps of aMPV replication. The detection of extracts with antiviral activity in this study confirms the value of marine biodiversity as a source of promising products in the viral diseases therapeutic. Therefore, the primordiality for more studies and the development of new inputs to control these viruses is extremely important to increasing of Brazilian poultry industry in world trade / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:57:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_AlyneVieira_M.pdf: 608733 bytes, checksum: 93e4d814c0f99c65741a343e76d35fc4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Estudos de plantas medicinais com conhecimento tradicional têm sido uma fonte potencial de substâncias com atividades farmacológicas e biológicas significantes. Guettarda angelica Mart. ex Müll. Arg. (Rubiaceae) é uma planta medicinal no qual suas raízes são popularmente utilizadas para diversos fins terapêuticos, incluindo veterinário. Estudos antimicrobianos com raízes desta planta também relataram uma atividade in vitro contra bactérias. Como as infecções virais ainda continuam sendo um sério problema mundial, a etnofarmacologia fornece uma abordagem alternativa para descoberta de novos agentes antivirais. O objetivo do presente trabalho foi o estudo antiviral de extratos da casca das raízes, folhas e sementes de G. angelica frente aos herpesvírus bovino (BoHV-1), suíno (SuHV-1) e equino (EHV-1), reovírus (ARV) e metapneumovírus aviário (aMPV). A atividade antiviral foi testada in vitro em células Vero e MDBK utilizando os ensaios de redução do título viral e o ensaio quantitativo colorimétrico através do MTT. Inicialmente, a concentração máxima não-citotóxica (MNCC) dos extratos foi determinada nas células através da observação de suas alterações morfológicas. Estudos realizados através da redução dos títulos virais mostrou que apenas o extrato aquoso de sementes (AEs) apresentou uma atividade antiviral contra o BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 e ARV. Assim, esse extrato foi posteriormente avaliado pelo método MTT para determinação do CC50 (concentração citotóxica a 50%), IC50 (concentração inibitória a 50%) e o SI (índice de seletividade). Os valores de CC50 do extrato AEs foram 400,60 e 920,50 para células Vero e MDBK, respectivamente. E os valores de IC50 e SI foram 22, 79 e 40,39 para BoHV-1; 91,30 e 10,08 para SuHV-1; 19,95 e 20,08 para EHV-1; e 23,59 e 17,00 para ARV. Esses resultados indicam que a semente de G. angelica contém compostos com atividade antiviral promissora e baixa toxicidade / Abstract: Study of medicinal plants with traditional knowledge has been a potential source of substances with significant pharmacological and biological activities. Guettarda angelica M. (Rubiaceae) is a medicinal plant where its roots are popularly used for various therapeutic purposes including veterinary. In vitro antimicrobial studies also related antibacterial activity of these roots against bacteria. Like viral infections still remain a serious worldwide problem, the ethnopharmacology provides an alternative approach for discovery of new antiviral agents. The aim of the present work was the antiviral study of extracts from roots bark, leaves and seeds of G. angelica against bovine (BoHV-1), swine (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses, avian reovirus (ARV) and metapneumovirus (aMPV) The antiviral activity was tested in vitro on Vero and MDBK cells using the viral titer assay and the quantitative colorimetric assay through MTT. Initially, the maximum non-citotoxic concentration (MNCC) of extracts was determined in cells by observation of their morphological alterations. Studies through the reduction of viral titers showed that only the aqueous extract from seeds (AEs) presented an antiviral activity against BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 and ARV. Then, this extract was further evaluated by MTT method to determine the CC50 (50% cytotoxic concentration), IC50 (50% inhibitory concentration) and SI (selectivity index). The values of CC50 of AEs extract were 400.60 and 920.60 to Vero and MDBK cells, respectively. And the values of IC50 and SI were 22.79 and 40.39 for BoHV-1; 91.30 e 10.08 for SuHV-1; 19.95 and 20.08 for EHV-1; 23.59 and 17.00 for ARV. These results indicate that the seeds from G. angelica contain composts with promising antiviral activity and low toxicity / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientadores: Clarice Weis Arns, Fernando Rosado Spilki / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:38:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_LucianaHelenaAntoniassida_D.pdf: 3352165 bytes, checksum: 1c8836441214fc41a7890899268f1163 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os membros da família Paramyxoviridae são vírus que causam infecções em humanos e animais de importância econômica global. Entre os membros desta família incluem patógenos de importância mundial para os humanos, como o vírus respiratório sincicial humano (hRSV), o metapneumovírus humano (hMPV) e vírus de importância em Medicina Veterinária, como o vírus respiratório sincicial bovino (bRSV) e o metapnemovírus aviário (aMPV). Os membros da família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae são vírus envelopados, não-segmentados dotados de genoma de RNA de fita simples com sentido negativo. Na primeira parte do estudo, desenvolvemos um adenovírus recombinante expressando a proteína F do aMPV. A expressão da proteína F foi determinada por Western Blot. Os níveis de transcrição do gene F foram avaliados por RT-PCR em tempo real, em células HEK-293 e células HEP-2. Foi realizada a imunização experimental de Ad-aMPV-F e foi analisada a indução de resposta de anticorpos em camundongos BALB/c. Os títulos de anticorpos neutralizantes foram detectados após a imunização com Ad-aMPV-F. Na segunda parte do trabalho o objetivo foi à construção de adenovírus recombinantes expressando a proteína F do bRSV. A proteína F parece ser um antígeno ideal para fins de diagnóstico. Utilizando anticorpo anti-V-5, uma banda de ~90 kDa foi detectada no sobrenadante de cultura de células HEK-293 infectadas com Ad-bRSV-F. Na terceira parte do estudo, o objetivo foi à construção de dois vetores adenovirais expressando as proteínas G do aMPV e bRSV, a expressão destas proteínas em células HEK-293 infectadas foi analisada pela expressão do gene repórter, da proteína verde fluorescente (GFP) / Abstract: The members of the family Paramyxoviridae are viruses that cause infectious in human and animals of importance to global economics. Among the member of this family include pathogens of importance global for humans such as human respiratory syncytial virus (hRSV), the human and metapneumovirus (hMPV) and of viruses importance in veterinary medicine, such as bovine respiratory syncytial virus (bRSV) and avian metapnemovírus (aMPV). The members of the Paramyxoviridae are enveloped, non-segmented viruses, with negative-sense single stranded genomes. In the first part of the study, we developed a recombinant adenovirus expressing the F protein of AMPV. The expression of F gene was determined by Western Blot. The levels of transcription were evaluated by RT-PCR in real time in HEK-293 cells and HEP-2 cells. Immunization experiment was carried out Ad-AMPV-F was analyzed and the induction of antibody response in BALB/c mice. The neutralizing antibody titers detected after immunization with Ad-AMPV-F. In the second part, the objective was to construct recombinant adenoviruses expressing the F protein of bRSV. Protein F appears to be an ideal antigen for diagnostic purposes. Using the anti-antibody AdV-5, a single band of ~ 90 kDa was detected in the culture supernatant in 293 cells infected with Ad-bRSV-F. In the third part of the study, the objective was to build two adenoviral vectors expressing the G protein of aMPV and bRSV and the expression of these proteins in infected HEK-293 cells were analyzed for expression of the reporter gene, green fluorescent protein (GFP) / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RT-PCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPV-Infektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen.