Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. / Objetive: The aim of this study is to verify the presence of Citokeratin7 (CK7) and Citokeratin 8 (CK8) positive cells of OSCC of the floor of the mouth establishing a speculation if this neoplasia has origin in excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa. Methods: Ninety two cases of OSCC of the floor of the mouth were evaluated by straptavidin/biotin complex immunohistochemical technique and anti-CK7 and anti-CK8 monoclonal antibodies were used. Results: Seventy eight cases (84,78%) showed positive for one of the CKs; Forty five cases (48,9%) showed positive for CK7 and Sixty six cases (71,7%) showed positive for CK8. Conclusions: There is a high and significantly incidence of the immunoexpression of this citokeratins. These results suggest that the excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa participates on the genesis of the OSCC in this location.

Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. Objetivo: Verificar a presença da expressão imunoistoquímica das Citoqueratinas (CKs) 7 e 8 nas células do Carcinoma epidermóide localizado em assoalho bucal (CEAB), estabelecendo a especulação de que essa neoplasia tem origem no epitélio de transição entre o ducto excretor da glândula salivar e a mucosa oral de superfície. Métodos: Noventa e dois casos de CEAB foram avaliados através da técnica imunoistoquímica da streptavidina/biotina, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-CKs 7 e 8. Resultados: Setenta e oito casos (84,78%) mostraram positividade para as CKs estudadas. Quarenta e cinco casos (48,9%) mostraram positividade para CK7 e Sessenta seis casos (71,7%) para CK8. Conclusão: Houve uma intensa marcação celular das CKs estudadas. Os resultados encontrados indicam a participação do epitélio de transição entre os ductos excretores das glândulas salivares e a mucosa bucal de revestimento, na gênese dos carcinomas epidermóides nessa localização. / Objetive: The aim of this study is to verify the presence of Citokeratin7 (CK7) and Citokeratin 8 (CK8) positive cells of OSCC of the floor of the mouth establishing a speculation if this neoplasia has origin in excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa. Methods: Ninety two cases of OSCC of the floor of the mouth were evaluated by straptavidin/biotin complex immunohistochemical technique and anti-CK7 and anti-CK8 monoclonal antibodies were used. Results: Seventy eight cases (84,78%) showed positive for one of the CKs; Forty five cases (48,9%) showed positive for CK7 and Sixty six cases (71,7%) showed positive for CK8. Conclusions: There is a high and significantly incidence of the immunoexpression of this citokeratins. These results suggest that the excretory salivary duct epithelia transition to floor of the mouth mucosa participates on the genesis of the OSCC in this location.

Os genes homeobox atuam como reguladores da morfogênese e diferenciação celular embrionária, portanto, é evidente a possibilidade de sua expressão anormal estar presente na progressão de tumores. Estudos preliminares em nosso laboratório verificaram a participação de alguns genes homeobox em carcinoma epidermóide de boca (CEB). Este trabalho teve como objetivo avaliar a amplificação, expressão e o perfil de metilação dos genes HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 em linhagem celular derivadas de CEB e tecidos frescos tumoral e não-tumoral. Além disso, verificar o efeito da desmetilação na expressão gênica de linhagens celulares que apresentaram genes 100% metilados e a participação das enzimas responsáveis pela metilação do DNA, bem como a expressão das DNAmetiltransferases (DNMT) nos tumores. A análise de amplificação do DNA e expressão de mRNA foi realizada por qRT-PCR. O perfil de metilação foi avaliada pelo sistema PCR Array e a análise proteica das DNMT1, DNMT3a, DNMT3b e HOXA9 foi verificada por meio de reações imunohistoquímicas. As linhagens celulares SCC4 e SCC9 foram utilizadas para análise de desmetilação com 5-aza-2\'-deoxicitidina e a linhagem SCC4 para avaliar os efeitos do aumento de expressão do HOXA9, na proliferação celular por imunocitoquimica para Ki67, migração celular por transwell e apoptose pela avaliação de células positivas no ensaio de TUNEL. Na comparação entre os grupos, o gene HOXA5 apresentou-se amplificado na margem em relação ao tumor; o HOXA9 apresentou nível de metilação aumentada no tumor; o HOXB5 com amplificação maior na margem, com nível de expressão do mRNA aumentada nos tumores, e nível de metilação do tumor maior em relação a margem, sendo correlacionada com menor sobrevida; HOXB13 se apresentou amplificado no tumor em relação a margem, e com nível de metilação maior nos tumores e, HOXC12 com níveis de metilação maior nos tumores em relação a margem. É interessante, que os mesmos genes que tiveram níveis de metilação aumentados nos tumores em relação a margem, também estavam 100% metilados nas linhagens celulares SCC4 e SCC9 e tiveram sua expressão restaurada após o tratamento com 5-aza-2´-deoxicitina. Na avaliação do nível de expressão das DNMTs nos tumores, a DNMT3b apresentou-se com níveis aumentados em relação a DNMT1 e DNMT3a, e quando avaliado em nível proteico, a DNMT3a pode ser correlacionada com melhor sobrevida. O aumento da expressão do gene HOXA9 mostrou diminuição da migração celular, porém não alterou a proliferação e apoptose celular. A expressão proteica não apresentou correlação com parâmetros clínicos. Em conclusão, os resultados mostram que os genes homeobox estudados estão pouco metilados nas linhagens celulares e em tecidos de CEB. A amplificação desses genes não é um evento frequente. O gene HOXA9 é pouco expresso no tumor, e o aumento da sua expressão em linhagens celulares diminui a migração celular. / Homeobox genes are important as morphogenetic and embrionary cellular differentiation regulators, therefore there is basis for their abnormal expression in tumor progression. Preliminary studies in our laboratory have shown that homeobox genes are dysregulated in oral squamous cell carcinoma (OSCC). This study evaluates the genomic amplification, mRNA expression and methylation status of HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 in squamous cell carcinoma derived cell lines, and fresh tumor tissue. Also, analyzes the demethylation effect in gene expression of cell lines with genes showing 100% methylation, and the participation of enzymes responsible for DNA methylation, DNAmetiltransferases (DNMT), in gene and protein expression in tumors. DNA amplification and mRNA expression was analyzed by qRT-PCR. The methylation profile was evaluated by PCR Array System and DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HOXA9 protein expression was verified by immunohistochemistry. SCC4 and SCC9 cell lines were submitted to 5-aza-2\'-deoxycytidine for demethylation analysis. SCC4 cell lineage was analyzed by immunocytochemistry for Ki67, cell migration by transwell and apoptosis by TUNEL test after increased expression of HOXA9. HOXA5 gene was amplified in the adjacent margin when compared with the tumor; HOXA9 showed increased level of methylation in tumor; HOXB5 showed amplification in the margin, increased mRNA expression in tumors, increased methylation level and was correlated with decreased survival; HOXB13 was amplified in tumor samples when compared to the margins and also higher methylation level in tumors; and HOXC12 also showed increased methylation levels in tumors when compared to margin. Interestingly, the same genes with increased methylation levels in tumors, were also 100% methylated in cell lines SCC4 and SCC9. The expression of these gens was restored after treatment with 5-aza-2\'-deoxycytidine. DNMT3b presented higher levels of protein expression relative to DNMT1 and DNMT3a. DNMT3a protein expression was correlated with improved survival. SCC4 cells overexpressing HOXA9 gene showed decreased cell migration, with no effect on cell proliferation and apoptosis. HOXA9 protein expression was not correlated with clinical parameters. In conclusion, the results shows that homeobox genes are methylated in some OSCC cell lines and tissues. Amplification of these genes is not a frequent event. HOXA9 gene has low expression in OSCC, and when overexpressed in cell lines decreases cell migration.

PTEN é um gene supressor de tumor, que resulta na proteína citoplasmática de mesmo nome, e possui a capacidade de modular a apoptose e o ciclo celular, assim como de inibir a migração celular. Por outro lado, o oncogene Akt promove a sobrevida celular e impede a apoptose. A ativação de Akt é inversamente relacionada com a ausência de PTEN em uma variedade de neoplasias malignas. Neste estudo, linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermóide bucal (HN6, HN30, HN31 e uma linhagem de células controle, HaCat) foram submetidas ao método de invasão in vitro e clones celulares altamente invasivos foram isolados. Através das técnicas de imunofluorescência e Western blot foi verificada a expressão de ambas as proteínas nos novos clones (denominados HN6.1, HN30.1, HN31.1 e HaCat.1) e comparada às linhagens controle. A técnica da zimografia também foi realizada, desde que várias metaloproteinases (MMPs) têm demonstrado possuir papel importante no processo de invasão e metástase dos CEB. Nossos resultados revelaram que todas as linhagens celulares e seus respectivos clones invasivos mostraram marcação citoplasmática e nuclear para PTEN e pAkt, respectivamente. A exceção foi a HaCat.1 que apresentou marcação predominantemente citoplasmática para pAkt. A análise do Western blot revelou que os clones invasivos expressam menor quantidade de PTEN, não significantes estatisticamente. Essa diminuição foi expressiva somente na linhagem HaCat.1 (p<0.05). Em relação ao pAkt, foi observado uma discreta superexpressão dessa proteína nas linhagens invasivas de CEB. Contrariamente, a linhagem HaCat.1 sofreu uma significante diminuição de pAkt (p<0,05). Finalmente, a zimografia mostrou um discreto aumento de MMP-2 latente e/ou um significante aumento de MMP-9 ativa em todos os clo nes invasivos. Nossos resultados sugerem que não há uma relação inversa consistente e significativa entre as proteínas PTEN e Akt no processo de invasão in vitro com células derivadas de CEB. Não há somente um padrão de sinalização PTEN-PI3K-Akt no processo de carcinogênese desta neoplasia. A linhagem celular HaCat.1 se comportou diferente das linhagens derivadas de CEB e provavelmente sofreu diferenciação. Um aumento estatisticamente significante de secreção de MMP-9 ativa foi observado em 2 das 3 linhagens de CEB estudadas / PTEN is a tumor suppressor gene that encodes a dual phosphates protein capable to modulate apoptosis and cell cycle and prevent cellular migration. On the other hand, Akt oncogene promotes both cell cycle progression and inhibits apoptosis. Akt activation is inversely correlated with PTEN lost in a variety of cancers. In this study, highly invasive clones of OSCC cell lines (HN6, HN30, HN31 and a control cell line, HaCat) were isolated using an in vitro assay method. The expression of both proteins in these cells was compared by immunofluorescence and western blot technique. The metalloproteinase activation was analyzed by gelatin zimography, since several MMPs have been shown to play an important role in the invasion and metastasis of OSCC. All OSCC cell lines and its new clones showed cytoplasmatic and nuclear staining for PTEN and pAkt, respectively. The western blot analysis revealed no significant decrease of PTEN expression in the most invasive clones (named HN6.1, HN30.1 and HN31.1). Only HaCat.1 had a significant decrease (p<0,05). However, there was no significant increase of Akt in the invasiveness clones and oppositely the expression of Akt was strongly reduced (p<0,05) in the HaCat.1. Finally, the zimography showed a discrete increase of inactive MMP-2 and/or a significant increase of active MMP-9 in all the most invasive cell lines. In conclusion, no correlation was seen between PTEN and pAkt in the process of invasion in vitro. There is not only a linear PTEN-PI3K-Akt pathway in OSCC. The HaCat.1 had a different behavior in relation to OSCC cell lines and probably allowed cellular differentiation. In addition, a significant increase of active MMP-9 was seen in 2 of 3 lines of cells derived from OSCC

PTEN é um gene supressor de tumor, que resulta na proteína citoplasmática de mesmo nome, e possui a capacidade de modular a apoptose e o ciclo celular, assim como de inibir a migração celular. Por outro lado, o oncogene Akt promove a sobrevida celular e impede a apoptose. A ativação de Akt é inversamente relacionada com a ausência de PTEN em uma variedade de neoplasias malignas. Neste estudo, linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermóide bucal (HN6, HN30, HN31 e uma linhagem de células controle, HaCat) foram submetidas ao método de invasão in vitro e clones celulares altamente invasivos foram isolados. Através das técnicas de imunofluorescência e Western blot foi verificada a expressão de ambas as proteínas nos novos clones (denominados HN6.1, HN30.1, HN31.1 e HaCat.1) e comparada às linhagens controle. A técnica da zimografia também foi realizada, desde que várias metaloproteinases (MMPs) têm demonstrado possuir papel importante no processo de invasão e metástase dos CEB. Nossos resultados revelaram que todas as linhagens celulares e seus respectivos clones invasivos mostraram marcação citoplasmática e nuclear para PTEN e pAkt, respectivamente. A exceção foi a HaCat.1 que apresentou marcação predominantemente citoplasmática para pAkt. A análise do Western blot revelou que os clones invasivos expressam menor quantidade de PTEN, não significantes estatisticamente. Essa diminuição foi expressiva somente na linhagem HaCat.1 (p<0.05). Em relação ao pAkt, foi observado uma discreta superexpressão dessa proteína nas linhagens invasivas de CEB. Contrariamente, a linhagem HaCat.1 sofreu uma significante diminuição de pAkt (p<0,05). Finalmente, a zimografia mostrou um discreto aumento de MMP-2 latente e/ou um significante aumento de MMP-9 ativa em todos os clo nes invasivos. Nossos resultados sugerem que não há uma relação inversa consistente e significativa entre as proteínas PTEN e Akt no processo de invasão in vitro com células derivadas de CEB. Não há somente um padrão de sinalização PTEN-PI3K-Akt no processo de carcinogênese desta neoplasia. A linhagem celular HaCat.1 se comportou diferente das linhagens derivadas de CEB e provavelmente sofreu diferenciação. Um aumento estatisticamente significante de secreção de MMP-9 ativa foi observado em 2 das 3 linhagens de CEB estudadas / PTEN is a tumor suppressor gene that encodes a dual phosphates protein capable to modulate apoptosis and cell cycle and prevent cellular migration. On the other hand, Akt oncogene promotes both cell cycle progression and inhibits apoptosis. Akt activation is inversely correlated with PTEN lost in a variety of cancers. In this study, highly invasive clones of OSCC cell lines (HN6, HN30, HN31 and a control cell line, HaCat) were isolated using an in vitro assay method. The expression of both proteins in these cells was compared by immunofluorescence and western blot technique. The metalloproteinase activation was analyzed by gelatin zimography, since several MMPs have been shown to play an important role in the invasion and metastasis of OSCC. All OSCC cell lines and its new clones showed cytoplasmatic and nuclear staining for PTEN and pAkt, respectively. The western blot analysis revealed no significant decrease of PTEN expression in the most invasive clones (named HN6.1, HN30.1 and HN31.1). Only HaCat.1 had a significant decrease (p<0,05). However, there was no significant increase of Akt in the invasiveness clones and oppositely the expression of Akt was strongly reduced (p<0,05) in the HaCat.1. Finally, the zimography showed a discrete increase of inactive MMP-2 and/or a significant increase of active MMP-9 in all the most invasive cell lines. In conclusion, no correlation was seen between PTEN and pAkt in the process of invasion in vitro. There is not only a linear PTEN-PI3K-Akt pathway in OSCC. The HaCat.1 had a different behavior in relation to OSCC cell lines and probably allowed cellular differentiation. In addition, a significant increase of active MMP-9 was seen in 2 of 3 lines of cells derived from OSCC

Os genes homeobox são responsáveis por codificar proteínas nucleares que agem como fatores de transcrição durante o desenvolvimento embrionário, regulando proliferação e diferenciação celular. A expressão alterada do gene homeobox PROX1 já foi identificado em diferentes neoplasias, incluindo mama, esôfago, fígado, sistema biliar, linfomas e cavidade bucal. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da superexpressão do gene PROX1 em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide bucal nos mecanismos de proliferação e diferenciação celular, apoptose e perfil global de expressão gênica. Após a superexpressão deste gene na linhagem celular SCC-9, foi realizada a análise de proliferação por meio dos ensaios de curva de proliferação celular, citometria de fluxo, índice de incorporação de BrdU ao DNA e expressão de Ki67. A diferenciação celular foi verificada por meio de reações imunocitoquímicas para as citoqueratinas 1, 10, 13, 14, 16, 18 e 19 e a apoptose foi avaliada por meio de células positivas para anexina-V e iodeto de propídeo. O ensaio de microarray foi realizado para avaliação do perfil global de expressão gênica na linhagem celular SCC9 com superexpressão do gene PROX1. Observou-se que a superexpressão do gene PROX1 promove redução da proliferação celular, bem como reduz a expressão das citoqueratinas 1, 13, 18 e 19. Não houve alteração na taxa de apoptose entre as células com superexpressão do gene PROX1 e controles. Os resultados do microarray revelaram a expressão diferencial significante de genes envolvidos com os processos de desenvolvimento, adesão e invasão celular. Desta maneira, estes resultados são fortemente sugestivos de que o gene PROX1 inibe a proliferação celular e contribui para a diferenciação do carcinoma epidermóide bucal. / Homeobox genes encode transcription factors with an important role during normal development by controlling cellular proliferation and differentiation. Altered expression of PROX1 homeobox gene is related to many cancers, including those of the breast, esophagus, liver, billiary system and lymphomas. The aim of this study was evaluate the effects of PROX1 overexpression, in an oral squamous cell carcinoma cell line, on cellular proliferation and differentiation, apoptosis as well as gene expression prolfile. After overexpression of PROX1 gene in SCC9 cell line, proliferation was assessed by proliferation curve, flow citometry, BrdU incorporation to DNA and Ki67 expression. Cell differentiation was verified by immunocytochemistry to cytokeratins 1, 10, 13, 14, 16, 18 and 19 and apoptosis was measured by annexin V positive cells. Gene expression profile was analyzed by microarray in PROX1-overexpressing cells and control. PROX1-overexpressing cells showed a statistically significant decrease in proliferation as well cytokeratin 1, 13, 18 and 19 expression. No significant differences from controls and PROX1- overexpressing cells were observed in apoptosis. Microarray analyses showed differential expression of genes related to development, cellular adhesion an invasion. Our results strongly suggest that overexpression of PROX1 inhibit cell proliferation and contributes to differentiation of oral squamous cell carcinoma.

Os genes homeobox são responsáveis por codificar proteínas nucleares que agem como fatores de transcrição durante o desenvolvimento embrionário, regulando proliferação e diferenciação celular. A expressão alterada do gene homeobox PROX1 já foi identificado em diferentes neoplasias, incluindo mama, esôfago, fígado, sistema biliar, linfomas e cavidade bucal. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da superexpressão do gene PROX1 em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide bucal nos mecanismos de proliferação e diferenciação celular, apoptose e perfil global de expressão gênica. Após a superexpressão deste gene na linhagem celular SCC-9, foi realizada a análise de proliferação por meio dos ensaios de curva de proliferação celular, citometria de fluxo, índice de incorporação de BrdU ao DNA e expressão de Ki67. A diferenciação celular foi verificada por meio de reações imunocitoquímicas para as citoqueratinas 1, 10, 13, 14, 16, 18 e 19 e a apoptose foi avaliada por meio de células positivas para anexina-V e iodeto de propídeo. O ensaio de microarray foi realizado para avaliação do perfil global de expressão gênica na linhagem celular SCC9 com superexpressão do gene PROX1. Observou-se que a superexpressão do gene PROX1 promove redução da proliferação celular, bem como reduz a expressão das citoqueratinas 1, 13, 18 e 19. Não houve alteração na taxa de apoptose entre as células com superexpressão do gene PROX1 e controles. Os resultados do microarray revelaram a expressão diferencial significante de genes envolvidos com os processos de desenvolvimento, adesão e invasão celular. Desta maneira, estes resultados são fortemente sugestivos de que o gene PROX1 inibe a proliferação celular e contribui para a diferenciação do carcinoma epidermóide bucal. / Homeobox genes encode transcription factors with an important role during normal development by controlling cellular proliferation and differentiation. Altered expression of PROX1 homeobox gene is related to many cancers, including those of the breast, esophagus, liver, billiary system and lymphomas. The aim of this study was evaluate the effects of PROX1 overexpression, in an oral squamous cell carcinoma cell line, on cellular proliferation and differentiation, apoptosis as well as gene expression prolfile. After overexpression of PROX1 gene in SCC9 cell line, proliferation was assessed by proliferation curve, flow citometry, BrdU incorporation to DNA and Ki67 expression. Cell differentiation was verified by immunocytochemistry to cytokeratins 1, 10, 13, 14, 16, 18 and 19 and apoptosis was measured by annexin V positive cells. Gene expression profile was analyzed by microarray in PROX1-overexpressing cells and control. PROX1-overexpressing cells showed a statistically significant decrease in proliferation as well cytokeratin 1, 13, 18 and 19 expression. No significant differences from controls and PROX1- overexpressing cells were observed in apoptosis. Microarray analyses showed differential expression of genes related to development, cellular adhesion an invasion. Our results strongly suggest that overexpression of PROX1 inhibit cell proliferation and contributes to differentiation of oral squamous cell carcinoma.

Os genes homeobox atuam como reguladores da morfogênese e diferenciação celular embrionária, portanto, é evidente a possibilidade de sua expressão anormal estar presente na progressão de tumores. Estudos preliminares em nosso laboratório verificaram a participação de alguns genes homeobox em carcinoma epidermóide de boca (CEB). Este trabalho teve como objetivo avaliar a amplificação, expressão e o perfil de metilação dos genes HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 em linhagem celular derivadas de CEB e tecidos frescos tumoral e não-tumoral. Além disso, verificar o efeito da desmetilação na expressão gênica de linhagens celulares que apresentaram genes 100% metilados e a participação das enzimas responsáveis pela metilação do DNA, bem como a expressão das DNAmetiltransferases (DNMT) nos tumores. A análise de amplificação do DNA e expressão de mRNA foi realizada por qRT-PCR. O perfil de metilação foi avaliada pelo sistema PCR Array e a análise proteica das DNMT1, DNMT3a, DNMT3b e HOXA9 foi verificada por meio de reações imunohistoquímicas. As linhagens celulares SCC4 e SCC9 foram utilizadas para análise de desmetilação com 5-aza-2\'-deoxicitidina e a linhagem SCC4 para avaliar os efeitos do aumento de expressão do HOXA9, na proliferação celular por imunocitoquimica para Ki67, migração celular por transwell e apoptose pela avaliação de células positivas no ensaio de TUNEL. Na comparação entre os grupos, o gene HOXA5 apresentou-se amplificado na margem em relação ao tumor; o HOXA9 apresentou nível de metilação aumentada no tumor; o HOXB5 com amplificação maior na margem, com nível de expressão do mRNA aumentada nos tumores, e nível de metilação do tumor maior em relação a margem, sendo correlacionada com menor sobrevida; HOXB13 se apresentou amplificado no tumor em relação a margem, e com nível de metilação maior nos tumores e, HOXC12 com níveis de metilação maior nos tumores em relação a margem. É interessante, que os mesmos genes que tiveram níveis de metilação aumentados nos tumores em relação a margem, também estavam 100% metilados nas linhagens celulares SCC4 e SCC9 e tiveram sua expressão restaurada após o tratamento com 5-aza-2´-deoxicitina. Na avaliação do nível de expressão das DNMTs nos tumores, a DNMT3b apresentou-se com níveis aumentados em relação a DNMT1 e DNMT3a, e quando avaliado em nível proteico, a DNMT3a pode ser correlacionada com melhor sobrevida. O aumento da expressão do gene HOXA9 mostrou diminuição da migração celular, porém não alterou a proliferação e apoptose celular. A expressão proteica não apresentou correlação com parâmetros clínicos. Em conclusão, os resultados mostram que os genes homeobox estudados estão pouco metilados nas linhagens celulares e em tecidos de CEB. A amplificação desses genes não é um evento frequente. O gene HOXA9 é pouco expresso no tumor, e o aumento da sua expressão em linhagens celulares diminui a migração celular. / Homeobox genes are important as morphogenetic and embrionary cellular differentiation regulators, therefore there is basis for their abnormal expression in tumor progression. Preliminary studies in our laboratory have shown that homeobox genes are dysregulated in oral squamous cell carcinoma (OSCC). This study evaluates the genomic amplification, mRNA expression and methylation status of HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 in squamous cell carcinoma derived cell lines, and fresh tumor tissue. Also, analyzes the demethylation effect in gene expression of cell lines with genes showing 100% methylation, and the participation of enzymes responsible for DNA methylation, DNAmetiltransferases (DNMT), in gene and protein expression in tumors. DNA amplification and mRNA expression was analyzed by qRT-PCR. The methylation profile was evaluated by PCR Array System and DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HOXA9 protein expression was verified by immunohistochemistry. SCC4 and SCC9 cell lines were submitted to 5-aza-2\'-deoxycytidine for demethylation analysis. SCC4 cell lineage was analyzed by immunocytochemistry for Ki67, cell migration by transwell and apoptosis by TUNEL test after increased expression of HOXA9. HOXA5 gene was amplified in the adjacent margin when compared with the tumor; HOXA9 showed increased level of methylation in tumor; HOXB5 showed amplification in the margin, increased mRNA expression in tumors, increased methylation level and was correlated with decreased survival; HOXB13 was amplified in tumor samples when compared to the margins and also higher methylation level in tumors; and HOXC12 also showed increased methylation levels in tumors when compared to margin. Interestingly, the same genes with increased methylation levels in tumors, were also 100% methylated in cell lines SCC4 and SCC9. The expression of these gens was restored after treatment with 5-aza-2\'-deoxycytidine. DNMT3b presented higher levels of protein expression relative to DNMT1 and DNMT3a. DNMT3a protein expression was correlated with improved survival. SCC4 cells overexpressing HOXA9 gene showed decreased cell migration, with no effect on cell proliferation and apoptosis. HOXA9 protein expression was not correlated with clinical parameters. In conclusion, the results shows that homeobox genes are methylated in some OSCC cell lines and tissues. Amplification of these genes is not a frequent event. HOXA9 gene has low expression in OSCC, and when overexpressed in cell lines decreases cell migration.

O carcinoma epidermóide bucal (CEC) é uma neoplasia maligna com alta morbidade e mortalidade e de difícil tratamento. O tratamento convencional para o CEC inclui cirurgia e radioterapia, seguida ou não de quimioterapia. Apesar de serem amplamente difundidos, esses tratamentos podem ser ineficazes para alguns CECs resistentes. A terapia fotodinâmica (PDT) oncológica tem sido utilizada para o tratamento adjuvante do CEC bucal, principalmente nos casos menos invasivos e que necessitam de redução do tumor para a ressecção cirúrgica. Contudo, semelhantemente aos tratamentos convencionais, a PDT pode também induzir o aparecimento de populações celulares resistentes, fato já descrito para carcinoma cutâneo, adenocarcinoma de cólon e adenocarcinoma mamário. A hipótese de que células de CEC bucal possam desenvolver resistência à PDT ainda não foi testada. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar se células de CEC bucal (SCC9) desenvolvem resistência a ciclos repetidos de PDT mediada pelo ácido 5- aminolevulínico (5-ALA-PDT) e avaliar se nesse processo ocorre modificação da expressão de marcadores relacionados a sobrevivência celular (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR e Akt). Foi utilizada linhagem de células de CEC bucal (SCC9), submetida às seguintes condições: 1) Controle - células cultivadas sem nenhum tratamento; 2) ALA - células incubadas com 5-ALA (1mM durante 4 horas); 3) LED - tratadas com iluminação LED (630nm, 5,86J/cm2, 22,5J, 150mW, 150s); 4) PDT - tratadas com 5- ALA-PDT, com os protocolos do grupo ALA e LED combinados, gerando dose letal de 90%. Inicialmente foi realizado somente um ciclo de PDT, sendo avaliada a viabilidade celular em todos os grupos após 24, 48, 72 e 120h da irradiação. Também foi realizado ensaio de detecção da fragmentação de DNA (TUNEL) e análise por imunofluorescência da expressão das proteínas NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt nas células viáveis. Como resultado desse primeiro tratamento com 5-ALA-PDT, observou-se que as células sobreviventes ao tratamento apresentaram intensa marcação para pmTOR e exibiram potencial de crescimento durante o período analisado. Após esses ensaios, as células que sobreviveram a essa primeira sessão foram coletadas, replaqueadas e novamente cultivadas, sendo então submetidas a novo ciclo de 5-ALA-PDT. Esse processo foi realizado 5 vezes, variando-se a intensidade de irradiação à medida que se observava aumento na viabilidade celular. As populações celulares que exibiram viabilidade 1,5 vezes maior do que a detectada no primeiro ciclo PDT foram consideradas resistentes ao tratamento. Os mesmos marcadores analisados no primeiro ciclo de PDT foram novamente avaliados nas populações resistentes. Foram obtidas quatro populações celulares resistentes, com viabilidade de até 4,6 vezes maior do que a do primeiro ciclo de PDT e irradiação com LED que variou de 5,86 a 9,38J/cm2. A população mais resistente apresentou ainda menor intensidade de protoporfirina IX, maior capacidade de migração e modificação na morfologia nuclear. As populações resistentes testadas exibiram aumento na expressão de pNF?B, iNOS, pmTOR e pAkt, mas não da proteína anti-apoptótica Bcl- 2. Ensaio in vivo foi também conduzido em ratos, nos quais CEC bucal foi quimicamente induzido e tratado ou não com 5-ALA-PDT. Houve intensa expressão imuno-histoquímica das proteínas pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt em relação ao controle não tratado, nas células adjacentes à área de necrose provocada pela PDT. Concluiu-se que as células de CEC bucal tratadas com 5-ALA-PDT a uma dose de 90% de letalidade desenvolveram viabilidade crescente após ciclos repetidos do tratamento, bem como exibiram superexpressão de proteínas relacionadas à sobrevivência celular, tanto in vitro quanto in vivo. Esses fatos, aliados à maior capacidade de migração, sugerem a aquisição de fenótipo de resistência à 5-ALAPDT. Esse aspecto deve ser cuidadosamente considerado no momento da instituição dessa terapia para os CECs bucais. / Oral squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant tumor with high morbidity and mortality rates, and it is difficult to treat. Conventional treatment for oral SCCs includes surgery and radiotherapy that may be followed by chemotherapy. Although these treatments are widely used, they are ineffective against some resistant tumors. Oncologic photodynamic therapy (PDT) has been used as an adjuvant treatment for oral SCCs, especially in less invasive cases that require tumor reduction before surgical resection. However, like conventional treatments, PDT can induce the occurrence of resistant cell populations such as cutaneous carcinomas and colon and breast adenocarcinomas. The hypothesis that oral SCCs develop resistance to PDT has not yet been tested. Therefore, the aims of this study were to investigate whether oral SCCs (SCC9) develop resistance to several cycles of 5-aminolevulinic acidmediated PDT (5-ALA-PDT) and to determine whether the expression of markers associated with cell survival (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR, and Akt) is altered during this process. An oral SCC (SCC9) cell line was used, which was subjected to the following conditions: 1) Control: cultured without any treatment; 2) ALA: incubated with 5-ALA (1 mM for 4 h); 3) LED: treated with LED light (630 nm, 5.86 J/cm2, 22.5 J, 150 mW, 150 s); and 4) PDT: treated with 5-ALA-PDT (with the protocols of the ALA and LED groups combined) generating a lethal dose of 90%. Initially, only one cycle of PDT was administered, and cell viability was determined in all groups 24, 48, 72, and 120 h after irradiation. Subsequently, the DNA fragmentation detection assay (TUNEL) and immunofluorescence analysis of the expression of proteins NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR, and pAkt were performed on viable cells. The fraction of cells that survived the first treatment with 5-ALA-PDT exhibited intense staining for pmTOR and growth potential during the testing period. After these assays, the cells that survived the first cycle were collected, plated, and cultured and were subjected to another cycle of 5- ALA-PDT. This process was repeated five times at various irradiation intensities, and cell viability gradually increased. The cell populations that exhibited 1.5-times higher viability than that detected after the first PDT cycle were considered to be resistant to treatment. The markers analyzed after the first PDT cycle were again assessed in the resistant populations. Four resistant cell populations were obtained with a viability of up to 4.6-times higher than that of the first PDT cycle and LED light treatment, which varied between 5.86 and 9.38J/cm2. The most resistant population exhibited lower intensity of protoporphyrin IX, higher migration capacity, and changes in nuclear morphology. The resistant populations tested showed increased expression of pNF?B, iNOS, pmTOR, and pAkt, but not of the anti-apoptotic Bcl-2 protein. Moreover, an in vivo assay was conducted in rats; oral SCCs were chemically induced and treated with 5-ALA-PDT. The intensity of the immunohistochemical expression of proteins pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR, and pAkt in cells adjacent to the area with necrosis caused by PDT was higher than that observed in the untreated control. In conclusion, oral SCCs treated with 5-ALA-PDT at a lethal dose of 90% exhibited increasing viability after several treatment cycles and overexpression of proteins associated with cell survival both in vitro and in vivo. These results, together with the higher migration capacity, suggest the acquisition of the phenotype of resistance to 5-ALA-PDT. This aspect should be carefully considered when initiating this therapy for oral SCCs.

O carcinoma epidermóide bucal (CEC) é uma neoplasia maligna com alta morbidade e mortalidade e de difícil tratamento. O tratamento convencional para o CEC inclui cirurgia e radioterapia, seguida ou não de quimioterapia. Apesar de serem amplamente difundidos, esses tratamentos podem ser ineficazes para alguns CECs resistentes. A terapia fotodinâmica (PDT) oncológica tem sido utilizada para o tratamento adjuvante do CEC bucal, principalmente nos casos menos invasivos e que necessitam de redução do tumor para a ressecção cirúrgica. Contudo, semelhantemente aos tratamentos convencionais, a PDT pode também induzir o aparecimento de populações celulares resistentes, fato já descrito para carcinoma cutâneo, adenocarcinoma de cólon e adenocarcinoma mamário. A hipótese de que células de CEC bucal possam desenvolver resistência à PDT ainda não foi testada. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar se células de CEC bucal (SCC9) desenvolvem resistência a ciclos repetidos de PDT mediada pelo ácido 5- aminolevulínico (5-ALA-PDT) e avaliar se nesse processo ocorre modificação da expressão de marcadores relacionados a sobrevivência celular (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR e Akt). Foi utilizada linhagem de células de CEC bucal (SCC9), submetida às seguintes condições: 1) Controle - células cultivadas sem nenhum tratamento; 2) ALA - células incubadas com 5-ALA (1mM durante 4 horas); 3) LED - tratadas com iluminação LED (630nm, 5,86J/cm2, 22,5J, 150mW, 150s); 4) PDT - tratadas com 5- ALA-PDT, com os protocolos do grupo ALA e LED combinados, gerando dose letal de 90%. Inicialmente foi realizado somente um ciclo de PDT, sendo avaliada a viabilidade celular em todos os grupos após 24, 48, 72 e 120h da irradiação. Também foi realizado ensaio de detecção da fragmentação de DNA (TUNEL) e análise por imunofluorescência da expressão das proteínas NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt nas células viáveis. Como resultado desse primeiro tratamento com 5-ALA-PDT, observou-se que as células sobreviventes ao tratamento apresentaram intensa marcação para pmTOR e exibiram potencial de crescimento durante o período analisado. Após esses ensaios, as células que sobreviveram a essa primeira sessão foram coletadas, replaqueadas e novamente cultivadas, sendo então submetidas a novo ciclo de 5-ALA-PDT. Esse processo foi realizado 5 vezes, variando-se a intensidade de irradiação à medida que se observava aumento na viabilidade celular. As populações celulares que exibiram viabilidade 1,5 vezes maior do que a detectada no primeiro ciclo PDT foram consideradas resistentes ao tratamento. Os mesmos marcadores analisados no primeiro ciclo de PDT foram novamente avaliados nas populações resistentes. Foram obtidas quatro populações celulares resistentes, com viabilidade de até 4,6 vezes maior do que a do primeiro ciclo de PDT e irradiação com LED que variou de 5,86 a 9,38J/cm2. A população mais resistente apresentou ainda menor intensidade de protoporfirina IX, maior capacidade de migração e modificação na morfologia nuclear. As populações resistentes testadas exibiram aumento na expressão de pNF?B, iNOS, pmTOR e pAkt, mas não da proteína anti-apoptótica Bcl- 2. Ensaio in vivo foi também conduzido em ratos, nos quais CEC bucal foi quimicamente induzido e tratado ou não com 5-ALA-PDT. Houve intensa expressão imuno-histoquímica das proteínas pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt em relação ao controle não tratado, nas células adjacentes à área de necrose provocada pela PDT. Concluiu-se que as células de CEC bucal tratadas com 5-ALA-PDT a uma dose de 90% de letalidade desenvolveram viabilidade crescente após ciclos repetidos do tratamento, bem como exibiram superexpressão de proteínas relacionadas à sobrevivência celular, tanto in vitro quanto in vivo. Esses fatos, aliados à maior capacidade de migração, sugerem a aquisição de fenótipo de resistência à 5-ALAPDT. Esse aspecto deve ser cuidadosamente considerado no momento da instituição dessa terapia para os CECs bucais. / Oral squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant tumor with high morbidity and mortality rates, and it is difficult to treat. Conventional treatment for oral SCCs includes surgery and radiotherapy that may be followed by chemotherapy. Although these treatments are widely used, they are ineffective against some resistant tumors. Oncologic photodynamic therapy (PDT) has been used as an adjuvant treatment for oral SCCs, especially in less invasive cases that require tumor reduction before surgical resection. However, like conventional treatments, PDT can induce the occurrence of resistant cell populations such as cutaneous carcinomas and colon and breast adenocarcinomas. The hypothesis that oral SCCs develop resistance to PDT has not yet been tested. Therefore, the aims of this study were to investigate whether oral SCCs (SCC9) develop resistance to several cycles of 5-aminolevulinic acidmediated PDT (5-ALA-PDT) and to determine whether the expression of markers associated with cell survival (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR, and Akt) is altered during this process. An oral SCC (SCC9) cell line was used, which was subjected to the following conditions: 1) Control: cultured without any treatment; 2) ALA: incubated with 5-ALA (1 mM for 4 h); 3) LED: treated with LED light (630 nm, 5.86 J/cm2, 22.5 J, 150 mW, 150 s); and 4) PDT: treated with 5-ALA-PDT (with the protocols of the ALA and LED groups combined) generating a lethal dose of 90%. Initially, only one cycle of PDT was administered, and cell viability was determined in all groups 24, 48, 72, and 120 h after irradiation. Subsequently, the DNA fragmentation detection assay (TUNEL) and immunofluorescence analysis of the expression of proteins NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR, and pAkt were performed on viable cells. The fraction of cells that survived the first treatment with 5-ALA-PDT exhibited intense staining for pmTOR and growth potential during the testing period. After these assays, the cells that survived the first cycle were collected, plated, and cultured and were subjected to another cycle of 5- ALA-PDT. This process was repeated five times at various irradiation intensities, and cell viability gradually increased. The cell populations that exhibited 1.5-times higher viability than that detected after the first PDT cycle were considered to be resistant to treatment. The markers analyzed after the first PDT cycle were again assessed in the resistant populations. Four resistant cell populations were obtained with a viability of up to 4.6-times higher than that of the first PDT cycle and LED light treatment, which varied between 5.86 and 9.38J/cm2. The most resistant population exhibited lower intensity of protoporphyrin IX, higher migration capacity, and changes in nuclear morphology. The resistant populations tested showed increased expression of pNF?B, iNOS, pmTOR, and pAkt, but not of the anti-apoptotic Bcl-2 protein. Moreover, an in vivo assay was conducted in rats; oral SCCs were chemically induced and treated with 5-ALA-PDT. The intensity of the immunohistochemical expression of proteins pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR, and pAkt in cells adjacent to the area with necrosis caused by PDT was higher than that observed in the untreated control. In conclusion, oral SCCs treated with 5-ALA-PDT at a lethal dose of 90% exhibited increasing viability after several treatment cycles and overexpression of proteins associated with cell survival both in vitro and in vivo. These results, together with the higher migration capacity, suggest the acquisition of the phenotype of resistance to 5-ALA-PDT. This aspect should be carefully considered when initiating this therapy for oral SCCs.