Étude moléculaire des étapes précoces de la symbiose actinorhizienne Casuarina-Frankia : analyse fonctionnelle des gènes de la plante hôte contrôlant l'infectionPlus de 80% des plantes peuvent établir une symbiose racinaire avec des champignons de l'ordre des Glomales et former des endomycorhizes à arbuscules (AM). En revanche, seules certaines espèces appartenant à dix familles d'angiospermes réunies dans le Clade des Eurosidées I peuvent établir une symbiose racinaire fixatrice d'azote. Il s'agit d'une part, des plantes de la famille des légumineuses (Fabacées) et de Parasponia associées à Rhizobium et d'autre part, des plantes actinorhiziennes associées à l'actinomycète Frankia. Comme chez les légumineuses, la symbiose actinorhizienne aboutit à la formation de nodosités (ou « nodules »), siège de la fixation d'azote par les bactéries. Cependant, contrairement aux nodules des légumineuses, le nodule actinorhizien présente une structure et un développement s'apparentant aux racines latérales. L'étude des nodosités actinorhiziennes est donc particulièrement intéressante tant pour rechercher les spécificités de cette symbiose, que pour déterminer quelles sont les caractéristiques communes avec les légumineuses. Nous avons étudié le rôle du gène CCaMK dans le processus symbiotique et l'organogenèse nodulaire chez l'arbre actinorhizien Casuarina glauca. CCaMK code pour une protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline (« calcium and calmodulin dependent protein kinase »). Dans la cascade de signalisation conduisant à la nodulation et à la mycorhization chez les légumineuses, ce gène est positionné en aval des oscillations calciques (« calcium spiking ») qui ont lieu durant les premières étapes de l'interaction symbiotique. CCaMK jouerait un rôle dans la perception et le décodage des oscillations calciques, ainsi que leur transduction aux différents composants contrôlant les endosymbioses racinaires. Nous avons suivi l'expression spatio-temporelle de la fusion transcriptionnelle PromCgCCaMK::GUS au cours de la nodulation et montré que celle-ci était corrélée à la présence de Frankia tout au long du processus symbiotique, soulignant ainsi le rôle clé de CCaMK dans l'infection. Par ailleurs, nous avons cherché à déterminer l'importance du domaine autoinhibiteur de la protéine CCaMK dans l'activation du processus d'organogenèse du nodule. Pour cela, nous avons réalisé et introduit chez C. glauca des constructions géniques de CgCCaMK permettant l'expression de formes tronquées constitutivement actives, car dépourvues du domaine autoinhibiteur/CaM. Nous avons aussi utilisé des formes tronquées du gène MtCCaMK de Medicago truncatula. L'expression de ces formes tronquées de CCaMK a révélé que la levée de l'autoinhibition induit la formation de nodules spontanés indépendamment de l'actinobactérie Frankia. Les résultats obtenus suggèrent que la protéine dérégulée est capable de réactiver la voie de signalisation, ainsi que les gènes situés en aval de CCaMK, qui sont nécessaires à l'organogenèse nodulaire.Mots clés : Casuarina glauca, Frankia, CCaMK, infection, autoinhibition, nodules spontanés / Molecular study of the early stages of actinorhizal symbiosis Casuarina-Frankia: functional analysis of the host plant genes controlling the infectionMore than 80% of plant species are able to develop arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis in association with glomeromycete fungi. In contrast, only some species of the Eurosid I clade, confined to four orders and ten Angiosperm families, are able to form nitrogen-fixing root nodule symbioses with soil bacteria. This concerns plants of the legume family (Fabaceae) and Parasponia associated with Rhizobium bacteria and actinorhizal plants associated with the actinomycete Frankia. Similarly to Legumes, the actinorhizal symbiosis results in the formation of nitrogen-fixing root nodules. However, unlike legume nodule, the actinorhizal nodule has a same origin and structure than a lateral root. Thus, the study of actinorhizal nodules is of particular interest not only for investigating its specific properties but also, for determining common characteristics shared with legume nodules.We have studied the role of CgCCaMK gene during the symbiotic process and nodule organogenesis in the actinorhizal tree Casuarina glauca. CCaMK encodes a calcium and calmodulin dependent protein kinase. In the signalisation cascade leading to both nodulation and mycorrhization in legumes, this gene is acting downstream the calcium oscillations (« calcium spiking ») that occur during the early steps of the symbiotic interaction. It has been suggested that these calcium oscillations are decoded and transduced by the CCaMK protein.We have monitored the spatio-temporal expression of a PromCgCCaMK::GUS fusion during actinorhizal nodulation and have shown that reporter gene expression was correlated with the presence of Frankia along the symbiotic process. This data highlights the role of CgCCaMK during Frankia infection. In addition, we have investigated the role of the CCaMK autoinhibitory/CaM domain in actinorhizal nodule organogenesis. To achieve this goal, we have obtained truncated versions of CgCCaMK lacking the autoinhibitory/CaM domain, and then expressed them into C. glauca. We have also used truncated forms of MtCCaMK from Medicago truncatula. The expression of these CCaMK constructs from C. glauca and M. truncatula was found to induce spontaneous nodulation in the absence of Frankia bacteria. These results suggest that deregulation of the calcium and calmodulin dependent protein kinase is able to reactivate the symbiotic signalling pathway and genes acting downstream CCaMK that are needed for nodule organogenesis.Key words: Casuarina glauca, Frankia, CCaMK, infection, autoinhibition, spontaneous nodules

Les deux systèmes nodulaires symbiotiques les plus importants au niveau agronomique et environnemental sont, d'une part, les symbioses Rhizobium-légumineuses qui concernent environ 14 000 espèces, et d'autre part, les symbioses entre les plantes actinorhiziennes (environ 200 espèces) et l'actinomycète du sol Frankia. La plupart des plantes actinorhiziennes sont capables de fixer des quantités d'azote comparable à celles des Légumineuses ; ce sont généralement des plantes pionnières capables de coloniser des environnements pauvres en éléments minéraux. Elles représentent donc un atout écologique important. Si la symbiose Rhizobium-légumineuse est très étudiée, les mécanismes moléculaires à l'origine de la formation des nodules actinorhiziens restent actuellement peu connus. Ainsi, chez les Légumineuses, les flavonoïdes sont des molécules-clefs du processus de nodulation, alors que chez les plantes actinorhiziennes, l'implication des flavonoïdes dans la nodulation reste imprécise. L'objectif de cette thèse était de comprendre l'implication des flavonoïdes au cours de l'interaction symbiotique entre l'arbre actinorhizien tropical Casuarina glauca et son symbiote Frankia. L'analyse d'une base de données d'unigènes couplée à celle de données d'expression de puces à ADN a permis l'identification de huit genes de C. glauca impliqués dans la voie de biosynthèse des flavonoïdes. L'étude de leur expression dans les racines par PCR quantitative au cours d'une cinétique d'infection de C. glauca par Frankia a montré que les transcrits de la chalcone isomerase et de l'isoflavone reductase s'accumulaient très tôt après l'inoculation, suggérant ainsi une implication des isoflavonoïdes dans la symbiose actinorhizienne. Nous avons alors utilisé une stratégie d'ARN interférent pour réduire l'expression du gène de la chalcone synthase, la première enzyme de la voie de biosynthèse des flavonoïdes. La réduction de l'expression du gène de la chalcone synthase a provoqué une réduction significative du taux de flavonoïdes dans les racines ainsi qu'une très forte diminution du taux de nodulation chez les plantes transformées. Une restauration du taux de nodulation a pu être obtenu en présence de naringenin, une molécule centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes.Nos résultats apportent donc, pour la première fois, une évidence directe de l'implication forte des flavonoïdes au cours de la nodulation des plantes actinorhiziennes. / Nitrogen-fixing root nodulation, confined to four plant orders, encompasses more than 14,000 Leguminosae species, and approximately 200 actinorhizal species forming symbioses with rhizobia and Frankia bacterial species, respectively. Most actinorhizal plants are capable of high rates of nitrogen fixation comparable to the nitrogen fixing symbiosis between legumes and Rhizobium. As a consequence, these plants are able to grow in poor and disturbed soils and are important elements in plant community worldwide. The basic knowledge of the symbiotic interaction between Frankia and actinorhizal plants is still poorly understood, although it offers striking differences with the Rhizobium-legume symbiosis. In the symbiosis between legumes and Rhizobium, flavonoids are key molecules for nodulation. In actinorhizal plants, the involvement of flavonoids in symbiosis is poorly understood, but because of the similarities of the infection process between some actinorhizal plants and legumes, flavonoids were proposed to act as plant signals for the bacteria Frankia. The objective of this thesis was to investigate the involvement of flavonoids during the actinorhizal nodulation process resulting from the interaction between the tropical tree Casuarina glauca and the actinomycete Frankia.Eight C. glauca genes involved in flavonoid biosynthesis were identified from a unigene database and their expression patterns were monitored by quantitative real-time PCR during the nodulation time course. Our results showed that chalcone isomerase and isoflavone reductase transcripts accumulated preferentially early after inoculation with Frankia, suggesting thus for the first time that isoflavonoids are implicated in actinorhizal nodulation. To go deeper in the understanding of the role of these molecules in actinorhizal symbiosis, we used RNA interference strategy to silence chalcone synthase, the enzyme that catalyzes the first committed step of the flavonoid pathway. Knockdown of chalcone synthase expression led to a strong reduction of specific flavonoids levels and resulted in a severely impaired nodulation. Nodule formation could be rescued by supplementation of plants with naringenin, which is an upstream intermediate in flavonoid biosynthesis. Our results provide, for the first time, direct evidence of a strong implication of flavonoids during actinorhizal nodulation.

Impacts d’agropolymères sur la germination, le développement racinaire, et les interactions plantes-microorganismes. Les travaux réalisés au cours de la thèse sont de nature exploratoire et visent à déterminer les effets physiologiques de la gomme de guar (Cyamopsis tetragonoloba) et trois de ses dérivés fonctionnalisés, sur la germination des semences, le développement racinaire des plantes et leur capacité à interagir avec un microorganisme symbiotique.Arabidopsis thaliana a été choisie comme plante modèle pour déterminer si le développement des plantes est modifié lorsqu’elles sont soumises à ces molécules, et explorer les mécanismes impliqués. Une analyse fine des modifications architecturales a été menée, via des études de microscopie et l’utilisation de plantes transgéniques. Des développements racinaires contrastés ont été mis en évidence pour deux des agropolymères fonctionnalisés, avec un raccourcissement de la racine primaire et des modifications du nombre de racines latérales. Les plantes traitées par ces deux agropolymères présentent une augmentation de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui traduisent un état de stress des plantes. Ces macromolécules polysaccharidiques ne semblent pas avoir d’impact sur les nutritions carbonée et azotée des plantes.Parallèlement aux recherches entreprises avec A. thaliana, des travaux ont été menés sur l’arbre tropical actinorhizien Casuarina glauca. Cette espèce d’intérêt pour certains pays du Sud peut se développer dans les sols pauvres en raison de son association symbiotique avec l’actinobactérie fixatrice d’azote Frankia. Les résultats obtenus mettent en évidence que les polymères induisent sur C. glauca des phénotypes racinaires identiques à ceux observés avec A. thaliana. Pour ce qui concerne l’interaction symbiotique, selon l’agropolymère testé et les concentrations choisies, des impacts positifs ou négatifs ont été observés sur le processus de nodulation résultant de l’interaction avec Frankia. L’ensemble de ces travaux fournit des éléments préliminaires qui devraient permettre de promouvoir, dans le futur, ces agropolymères dans le milieu agricole comme biostimulant, afin de tendre vers une agriculture plus durable et responsable.Mots clefs : Agropolymères – germination – développement racinaire – interactions plantes / microorganismes – Arabidopsis thaliana – Casuarina glauca / Impact of agropolymers on seed germination, root development, and plant-microorganism interactionsThe work performed during this thesis is of an exploratory nature and aims at providing insight to the physiological effects of guar (Cyamopsis tetragonoloba) gum polymer and three functionalized derivatives on seed germination, root development and a symbiotic plant-microorganism interaction.Arabidopsis thaliana was chosen as model plant to determine whether plant development was modified by the presence of these polymers and to explore the mechanisms involved. A detailed microscopic analysis of the root architecture was carried out using transgenic plants. Contrasted root development was evident for two of the functionalized agropolymers. Primary roots were shorter and lateral roots distribution was modified. Biochemical analyses revealed that the plants treated by these two agropolymers exibited an increase of reactive oxygen species (ROS) production in root tissues indicating that plants are in stress conditions. Such polysaccharides did not seem to have any effects on carbon and nitrogen plant nutrition.In parallel, studies were performed on the tropical actinorhizal tree Casuarina glauca. This species is of great environmental value in mitigating desertification since is able to grow in poor tropical soils because of its symbiotic interaction with the nitrogen-fixing actinobacteria Frankia. Treatment of C. glauca with the polymers induced root phenotypes that were very similar to those observed with A. thaliana. Treatment with agropolymers resulted in positive or negative effects on the nodulation process during the symbiotic interaction between C. glauca and FrankiaTaken together this work provides preliminary evidence supporting the value of the use agropolymers as agricultural biostimulants, facilitating the development of sustainable agriculture.Key words: Agropolymers – germination – root development – plants-microormanisms interactions – Arabidopsis thaliana – Casuarina glauca