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Les anticorps sont les molécules effectrices de l’immunité adaptatrice humorale. Ils se lient spécifiquement et neutralisent une large panoplie d’antigènes. Au-delà de leurs fonctions classiques, les anticorps possèdent les propriétés moins explorées que sont l’activité catalytique, qui permet aux anticorps de se comporter comme des enzymes, et la polyréactivité, qui représente la capacité d’une molécule d’anticorps à se lier à plusieurs antigènes structurellement différents. Les anticorps catalytiques sont retrouvés dans plusieurs pathologies chez l’homme, telle que l’hémophilie acquise, une maladie caractérisée par la survenue d’autoanticorps anti-facteur VIII. Dans ce travail, nous décrivons des IgG hydrolysant et activant le facteur IX de la coagulation chez les patients avec hémophilie acquise. Par ailleurs, nous avons effectué une étude longitudinale de deux ans des IgG catalytiques chez les patients subissant une transplantation rénale. Les anticorps polyréactifs représentent une proportion importante du répertoire des immunoglobulines circulantes. De plus, les sites inflammatoires sont abondants en molécules, telles que l’hème libre, capables de rendre polyréactives certaines IgG monoréactives. Nous avons étudié l’influence de la nature des régions constantes de la chaîne lourde des anticorps sur leur susceptibilité à devenir polyréactifs. Ce travail apporte un nouvel éclairage sur l’importance physiopathologique des anticorps catalytiques et polyréactifs. / Antibodies are effector molecules of the humoral arm of the adaptive immune system that bind specifically and neutralize diverse array of antigens. Beyond the classical function of antibodies exist the relatively less explored properties, of “catalytic activity” that enable antibodies to act as enzymes and “polyreactivity” that confers the ability to bind to several structurally unrelated antigens. Catalytic antibodies have been associated with several autoimmune, inflammatory and infectious diseases. Acquired hemophilia is an autoimmune disease, reported with the presence of catalytic antibodies against coagulation factor FVIII. In the present work, we have investigated the presence of factor IX (FIX) hydrolyzing IgG in patients with acquired hemophilia. We investigated the molecular mechanism and the physiological relevance of FIX activation upon hydrolysis by patients’ IgG. In addition, a longitudinal follow-up for 2 years was done in patients undergone renal transplant to investigate the evolution of catalytic antibodies in the course of disease. Polyreactive antibodies constitute a major portion of the natural antibody repertoire. Additionally, sites of inflammation are abundant in protein destabilizing agents like free heme that can induce polyreactivity in monoreactive antibodies. We have investigated the effect of the antibody constant domain on heme-induced polyreactivity. The present work has allowed us a better understanding of the physiopathological relevance of catalytic and polyreactive antibodies.

Les anticorps catalytiques sont étudiés pour comprendre leur rôle en conditions physiopathologiques. Ils semblent aussi représenter des outils révolutionnaires pour des études à l'interface entre la chimie, la biochimie, la biologie et immunologie. Par conséquent, la connaissance des relations de structure- fonction représente un grand intérêt. Nous avons exploré deux systèmes d'expression pour la production d'un anticorps catalytique modèle présentant une activité bêta-lactamase. Le fragment scFv recombinant a été produit dans le système d'expression procaryote. Les scFv sont souvent décrits comme des protéines difficiles à produire. Une méthode efficace a été développée pour produire de grandes quantités de scFv solubles et correctement repliés. L'anticorps catalytique entier a aussi été produit en exploitant le système d'expression eucaryote. Des cellules de mammifères ont été utilisées car elles peuvent conserver le repliement original des protéines, leur assemblage et les modifications post-traductionnelles. La structure secondaire du scFv catalytique a été analysée par dichroïsme circulaire pour s’assurer que la renaturation du scFv est en accord avec le repliement des scFv natifs. La fonctionnalité du scFv catalytique et de l'anticorps catalytique entier a été validée par deux approches : (1) le développement d’un test immuno-enzymatique (ELISA) et la résonance plasmonique de surface (RPS) et (2) le développement d'un test catalytique sensible utilisant un substrat fluorogénique. Ce travail amène à considérer de potentielles applications biotechnologiques et thérapeutiques des anticorps catalytiques. / Catalytic antibodies are investigated in order to understand their role under physio-pathological situations. But they also appear to be revolutionary tools to perform studies at the interface between chemistry, biochemistry, biology and immunology. Consequently, the knowledge of structure–function relationships is of great interest. We explored two expression systems for the production of a model catalytic antibody displaying a beta-lactamase activity. The recombinant scFv fragment was produced in the prokaryotic expression system. scFv fragments are often described as proteins being laborious to produce. An efficient method was developed to produce large quantities of refolded soluble catalytic scFv. Whole catalytic antibody was also produced by exploiting eukaryotic expression system. Mammalian cells were used because they are able to retain the original protein folding, assembly and post-translational modifications. The secondary structure of the catalytic scFv has been analyzed by circular dichroism to ensure that the refolded scFv is consistent with a native scFv fold. The functionality of the catalytic scFv and whole catalytic antibody has been validated by two approaches: (1) development of enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) and surface plasmon resonance (SPR) approaches for testing that the binding characteristics of an inhibitory peptide have been retained, and (2) proof of the subtle catalytic properties conservation through the development of a new sensitive catalytic assay using a fluorogenic substrate. This will lead to consider potential biotechnological and therapeutic applications of catalytic antibodies.

Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, katalytische Antikörper zur Hydrolyse von Benzylphenylcarbamaten sowie zahlreiche monoklonale Antikörper gegen Haptene herzustellen.<br /> <br /> Es wurden verschiedene Hapten-Protein-Konjugate unter Verwendung unterschiedlicher Kopplungsmethoden hergestellt und charakterisiert. Zur Generierung der hydrolytisch aktiven Antikörper wurden Inzuchtmäuse mit KLH-Konjugaten von 4 Übergangszustandsanaloga (ÜZA) immunisiert. Mit Hilfe der Hybridomtechnik wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen diese ÜZA gewonnen. Dabei wurden sowohl verschiedene Immunisierungsschemata als auch verschiedene Inzuchtmausstämme und Fusionstechniken verwendet. Insgesamt wurden 32 monoklonale Antikörper gegen die verwendeten ÜZA selektiert. Diese Antikörper wurden in großen Mengen hergestellt und gereinigt. <br /> <br /> Zum Nachweis der Antikörper-vermittelten Katalyse wurden verschiedene Methoden entwickelt und eingesetzt, darunter immunologische Nachweismethoden mit Anti-Substrat- und Anti-Produkt-Antikörpern und eine photometrische Methode mit Dimethylaminozimtaldehyd. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität gelang mit Hilfe eines Enzymsensors, basierend auf immobilisierter Tyrosinase. Die Antikörper N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysierten die Benzylphenylcarbamate POCc18, POCc19 und Substanz 27. Der Nachweis der hydrolytischen Aktivität dieser Antikörper gelang auch mit Hilfe der HPLC. <br /> <br /> Der katalytische Antikörper N1-BC1-D11 wurde kinetisch und thermodynamisch untersucht. Es wurde eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Km von 210 &#181;M, vmax von 3 mM/min und kcat von 222 min-1 beobachtet. Diese Werte korrelieren mit den Werten der wenigen bekannten Diphenylcarbamat-spaltenden Abzyme. Die Beschleunigungsrate des Antikörpers N1-BC1-D11 betrug 10. Das ÜZA Hei3 hemmte die hydrolytische Aktivität. Dies beweist, dass die Hydrolyse in der Antigenbindungsstelle stattfindet. Weiter wurde zwischen der Antikörperkonzentration und der Umsatzgeschwindigkeit eine lineare Abhängigkeit festgestellt. Die thermodynamische Gleichtgewichtsdissoziationskonstante KD des Abzyms von 2,6 nM zeugt von einer sehr guten Affinität zum ÜZA. <br /> <br /> Hydrolytisch aktiv waren nur Antikörper, die gegen das Übergangszustandsanalogon Hei3 hergestellt worden waren. Es wird vermutet, dass die Hydrolyse der Benzylphenylcarbamate über einen Additions-Eliminierungsmechanismus unter Ausbildung eines tetraedrischen Übergangszustandes verläuft, dessen analoge Verbindung Hei3 ist.<br /> <br /> Im Rahmen der Generierung von Nachweisantikörpern zur Detektion der Substratabnahme bei der Hydrolyse wurden Anti-Diuron-Antikörper hergestellt. Einer der Antikörper (B91-CG5) ist spezifisch für das Herbizid Diuron und hat einen IC50-Wert von 0,19 &#181;g/l und eine untere Nachweisgrenze von 0,04 &#181;g/l. Ein anderer Antikörper (B91-KF5) reagiert kreuz mit einer Palette ähnlicher Herbizide. Mit diesen Antikörpern wurde ein empfindlicher Labortest, der ein Monitoring von Diuron auf Grundlage des durch die Trinkwasserverordnung festgeschriebenen Wertes für Pflanzenschutzmittel von 0,1 &#181;g/l erlaubt, aufgebaut. <br /> <br /> Der Effekt der Anti-Diuron-Antikörper auf die Diuron-inhibierte Photosynthese wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl in isolierten Thylakoiden, als auch in intakten Algen eine Vorinkubation der Anti-Diuron-Antikörper mit Diuron zur Inaktivierung seiner Photosynthese-hemmenden Wirkung führt. Wurde der Elektronentransport in den isolierten Thylakoiden oder in Algen durch Diuron unterbrochen, so führte die Zugabe der Anti-Diuron-Antikörper zur Reaktivierung der Elektronenübertragung. / Attempts to produce catalytic antibodies for hydrolysis of arylcarbamates and arylureas:<br /> The aim of the investigations was to produce antibodies which are able to cleave herbicides resistant to naturally occuring enzymes. Structurally similar carbamate and urea derivatives were chosen for the experiments.<br /> <br /> Phosphonate derivatives were synthesized that mimick possible transition state analogues in structure and charge. Mice were immunized with 4 different derivatives after conjugating them to carrier proteins. 32 hybridomas were established that produce monoclonal antibodies binding to these derivatives. <br /> <br /> The possible cleavage of substrates was determined by immunoassays with monoclonal antibodies against the substrate and the products and with a photometric method based on dimethylaminocinammonaldehyde. The measuring of cleavage products was succeeded by an amperometric method. The enzyme sensor was based on immobilized tyrosinase which oxidizes p-chlorophenol and phenol.<br /> <br /> The antibodies N1-BC1-D11, N1-FA7-C4, N1-FA7-D12 und R3-LG2-F9 hydrolysed the benzylphenylcarbamates POCc18, POCc19 und Substance 27. The hydrolytic activity of these antibodies was also succeeded with HPLC.<br /> <br /> The catalytic antibody N1-BC1-D11 was investigated kinetically and thermodynamically. A Michaelis-Menten-Kinetic was observed (at pH 8.0 exhibited a Km 210 &#181;M, a vmax 3 mM/min and a kcat 222 min-1). These values are in the range of the values obtained for the antibody-catalysed hydrolysis of diphenylcarbamates. The rate enhancement of N1-BC1 was 10. The reaction was completely inhibited by stoichiometric quantities of the transition state analogue Hei3. This is consistent with the affinity of the abzyme to Hei3 of 2.6 nM, determined by BIAcore assay.<br /> <br /> Only antibodies generated against Hei3 showed hydrolytic activity. The hydrolysis of benzylphenylcarbamates presumably occurs via an addition-elimination-Mechanism involving a tetrahedral intermediate. <br /> <br /> In summary, this work presents the first example of antibody-catalysed hydrolysis of benzylphenylcarbamates. <br /> <br /> Monoclonal anti-diuron antibodies were generated that bind to the herbicide diuron with an extremely low equilibrium dissociation constant. A sensitive immunoassay with a low detection limit of 0.2 nM for diuron was established. This is the most sensitive immunological method for detection of diuron known so far.<br /> <br /> These antibodies were also used in vitro and in vivo to prevent diuron-dependent inhibition of photosynthesis or to restore photosynthesis after inhibition. In isolated thylakoids prepared from spinach leaves (Spinacia oleracea L.) the diuron-inhibited Hill reaction was reconstituted immediately following the addition of the monoclonal antibodies. In an in vivo approach the photosynthetic oxygen evolution of the cell wall deficient mutant (cw 15) of the green alga Chlamydomonas reinhardtii Dangeard was monitored. The antibodies prevented the diuron-dependent inhibition of photosynthesis and restored photosynthesis after inhibition. Transgenic plants that synthesize and accumulate these antibodies or antibody fragments and are therefore diuron-resistant can be created.

Les anticorps catalytiques (ou abzyme) ont fait l’objet de nombreuses recherches et ont été produits pour réaliser de nombreuses réactions. Ces protéines ont été ensuite découvertes dans le sérum d’individus sains ou atteints de pathologies, dont les pathologies autoimmunes. Les études suggèrent que ces abzymes peuvent avoir des effets bénéfiques ou délétères sur la santé des individus. L’origine des anticorps catalytiques et leur rôle restent ambigus et doivent être approfondis. Nous avons développé une nouvelle stratégie visant à étudier les abzymes, basée sur la technologie du phage display. Nous avons construit 4 banques de fragments d’anticorps, chacune présentant un répertoire immun différent (fond génétique et état d’immunitaire) : saine et naïve, saine et immunisée, autoimmune et naïve, et autoimmune et immunisée. Les stratégies d’amplification et de clonage des régions variables des immunoglobulines ont été conçues afin d’optimiser la taille et la diversité des banques. Nous avons rassemblé les 4 banques en une banque unique élargie contenant 2.7×109 séquences. L’analyse des séquences a mis en évidence des différences dans les profils d’expression des sous-groupes de gènes selon la banque. Nous avons ensuite procédé à la sélection d’abzymes à activité β-lactamase en utilisant deux cibles : un peptide cyclique, et un dérivé de sulfone pénam, inhibiteurs de l’enzyme. Nous avons sélectionné 5 abzymes. Chacun de ces immunoglobulines ont des séquences protéiques propres, incluant un potentiel site actif. Ces résultats montrent que différents motifs peuvent assurer la fonction catalytique de la β-lactamase, confirmant la flexibilité moléculaire de cette enzyme. / Catalytic antibodies (or abzymes) have been the focus numerous studies for some decades and have been produced with the ability to catalyze a wide range of reactions. They have also been discovered naturally in normal physiological and pathological conditions, notably on the background of autoimmune disease. Some have beneficial effects and others are detrimental to individual’s health. Hence, the origin of abzymes and their role in the immune response are ambiguous and must be enhanced. We have developed a novel strategy for the study of abzymes based on the phage display technology. We have constructed 4 libraries representing 4 murine immune repertoires with different genetic backgrounds and immunological states : healthy and naïve, healthy and immunized, autoimmune and naïve , and autoimmune and immunized. The strategies for the amplification and cloning of the immunoglobulin (lg) variable regions have been designed to optimize the size and diversity of the libraries. We have been able to pool the four libraries to create a large repertoire of size 2.7x109. After sequence analysis, we have found a number of statistically significant differences between the libraries. We have then used two strategically chosen targets to select for antibodies endowed with β lactamase activity : a cycle peptide and a penam sulfone, both inhibitors of the enzyme. We have selected for a total of 5 lgs endowed with β lactamase activity. The selected abzymes have different amino acid sequences. 3D modeling has provides insights on potential active sites demonstrating the ability of different structures to maintain the β lactamase activity and confirming the flexibility of the active site.

Una de les àrees més prometedores en recerca biomèdica i farmacèutica és el disseny molecular computacional, que intenta establir relacions entre propietats físico-químiques i activitat biològica. L'èxit d'aquestes tècniques depen críticament de la qualitat de la descripció molecular. En aquest sentit, metodologies basades en potencials d'interacció molecular (MIP) són eines útils per la comparació de compostos que presenten comportaments biològics semblants. Aquest projecte desenvolupa eines per comparar molècules basades en la caracterització de llurs MIPs. El programa de similaritat molecular MIPsim ha estat desenvolupat i aplicat a diferents problemes biològics. Aquesta tesi consisteix en quatre estudis científics que mostren l'ús del MIPSim en aliniament molecular, catalisi enzimàtica, en acoratge de molècules dins el lligand i en estudis 3D-QSAR. / One of the most promising areas in biomedical and pharmaceutical research is computer assisted molecular design, which tries to stablish relationships between physicochemical properties and biological activity. The success of these techniques depends critically on the quality of the molecular description. In this sense, methodologies based on molecular interaction potentials (MIP) are useful tools for the comparison of compounds displaying related biological behaviours. This project aims to develop tools to compare 'molecules based on the characterization 'of their MIPs. To this end, the molecular similarity program MIPSim has been further developed and applied to different biological problems. This thesis consists on four scientific studies showing the use of MIPSim for molecular alignment, enzymatic catalysis, ligand-protein docking and 3D-QSAR analyses.