Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Die Stimulation des CD95-Todesrezeptors durch seinen natürlichen membranständigen Li-ganden CD95L führt zur kontextabhängigen Aktivierung von sowohl apoptotischen als auch nicht-apoptotischen Signalwegen. Durch Proteolyse wird aus dem membranständigen CD95L löslicher trimerer CD95L freigesetzt. Die Bindung von löslichem trimerem CD95L an CD95 ist nicht ausreichend, um die CD95-Signaltransduktion effizient zu stimulieren. Die Fähigkeit von löslichen CD95L-Trimeren CD95-vermittelte Signalwege robust zu aktivieren kann jedoch durch Oligomerisierung und artifizielle Immobilisierung an eine Oberfläche drastisch gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde zunächst bestätigt, dass nur oligomere CD95L-Varianten, die z.B. durch Antikörpervernetzung von N-terminal getaggten rekombinanten CD95L-Varianten oder durch eine gentechnisch erzwungene Hexamerisierung von CD95L-Molekülen erhalten wur-den, in der Lage sind, effizient apoptotische und nicht-apoptotische Signalwege zu aktivieren. Ferner zeigte sich dann, dass die Bindung von löslichen CD95L-Trimeren nicht ausreichend ist, um die Translokation von CD95-Molekülen in detergenzunlösliche „Lipid Raft“- Membrandomänen zu stimulieren. Die „Lipid Raft“-Translokation ist ein zentrales Ereignis bei der CD95-Aktivierung und vor allem für die Induktion der Apoptose bedeutsam. Dabei ist ein selbstverstärkender Prozess aus Caspase-8-Aktivierung und „Lipid Raft“-Assoziation des CD95 von Bedeutung. Um die Interaktion von CD95 und CD95L mit Hilfe von hoch sensitiven zellulären Bindungs-studien analysieren zu können, wurden in dieser Arbeit desweiteren CD95L-Fusionsproteine entwickelt und hergestellt, an welche N-terminal eine Gaussia princeps Luziferase (GpL)- Reporterdomäne gekoppelt ist. So konnte mit den GpL-CD95L-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von CD95L-Trimeren keinen Effekt auf die Ligandenbele-gung des CD95 hat. Dies spricht dafür, dass die höhere spezifische Aktivität von oligomeri-sierten CD95L-Trimeren nicht auf einer Aviditäts-vermittelten Zunahme der apparenten Affi-nität beruht, sondern dies deutet darauf hin, dass die sekundäre Aggregation von sich initial bildenden trimeren CD95L-CD95-Komplexen eine entscheidende Rolle in der CD95-Aktivierung spielt. Durch Scatchard-Analysen zeigte sich ferner, dass trimerer CD95L mit mindestens zwei zellulären Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität interagiert. Bindungs-studien mit löslichen monomeren und trimeren GpL-CD95-Rezeptoren an membranständigen CD95L, als auch Inhibitionsstudien ergaben, dass trimerer CD95 weitaus besser an CD95L bindet. Dies legt nahe, dass es sich bei den zuvor beobachteten hoch- und niederaffinen Bindungsstellen für CD95L um monomere bzw. prä-assemblierte CD95-Moleküle handelt. Die GpL-CD95L-Fusionsproteine wurden auch genutzt, um die CD95-Translokation in „Lipid Rafts“ zu analysieren. So wurde trimerer GpL-CD95L als „Tracer“ zur Markierung von inaktiven CD95-Molekülen eingesetzt. Nach Aktivierung der übrigen freien CD95-Moleküle mit hoch aktivem hexameren Fc-CD95L konnte eine Zunahme der inaktiven GpL-CD95L-markierten Rezeptoren in „Lipid Rafts“ beobachtet werden. Offensichtlich stimulieren also aktivierte CD95-Moleküle in „trans“ die Ko-Translokation inaktiver CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Dies bestätigte sich auch in Experimenten mit Transfektanten, die einen chimären CD40-CD95-Rezeptor exprimieren. Letzterer ist nach Stimulation mit CD40L in der Lage, intrazellu-läre CD95-vermittelte Signalwege zu aktivieren. Die Aktivierung von CD95-assoziierten Sig-nalwegen durch Stimulation von endogenem CD95 in CD40-CD95-Transfektanten resultierte nun in der Ko-Translokation von unstimulierten CD40-CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts“. Vice versa zeigte sich die Ko-Translokation von endogenem CD95 nach spezifischer Aktivierung des chimären CD40-CD95-Rezeptors. Schlussendlich erwiesen sich eine funktionsfähige Todesdomäne und die Aktivierung der Caspase-8 als essentiell für die „Lipid Raft“-Assoziation von aktivierten CD95-Molekülen und auch für die durch diese Rezeptorspezies induzierte Ko-Translokation von inaktiven Rezeptoren in „Lipid Rafts“. / Membrane-bound CD95L activates the CD95 death receptor to induce context-dependent apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. In contrast, soluble trimeric CD95L, which is released by proteolysis, is not sufficient to stimulate CD95-induced signaling. However, the ability of soluble CD95L trimers to activate robust CD95 mediated signaling pathways can be increased drastically by oligomerization and artificial immobilization on the cell surface. In this work, it has been confirmed that only the oligomeric CD95L-variants, produced by an-tibody crosslinking of N-terminal tagged recombinant CD95L-variants or by genetic engineer-ing-enforced formation of hexamers, are able to efficiently activate both apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. Moreover, it has been shown that binding of soluble trimeric CD95L is not sufficient to stimulate translocation of CD95 molecules to the “lipid raft”-containing compartment of the cell membrane. This translocation of CD95 to “lipid rafts” is a pivotal event in CD95 activation and mainly meaningful, especially for induction of apoptosis. Thereby an auto-amplification-loop of caspase-8 activation and association of CD95 with “lipid rafts” is of importance. To analyze CD95-CD95L interactions, highly sensitive cellular binding studies using CD95L fusion proteins linked to the N-terminal Gaussia princeps luciferase (GpL) have been per-formed. With GpL-CD95L fusion proteins it has been demonstrated that oligomerization of CD95L trimers has no major effect on CD95 occupancy. Therefore higher specific activity of oligomerized CD95L trimers is not related to an avidity-driven increase in apparent affinity. This suggests that a process of secondary aggregation of the initially formed trimeric CD95L-CD95 complexes is crucial for CD95 activation. Furthermore, the data obtained from scat-chard analysis showed that trimeric CD95L interacts with at least two binding sites of different affinity. This was further examined by performing binding studies of soluble monomeric and trimeric GpL-CD95 receptors to membrane-bound CD95L and neutralization assays. It was observed that trimeric CD95 receptor can bind to CD95L much better. These results suggest that the high and low affinity binding sites concern to monomeric or rather pre-assembled CD95 molecules. Moreover, GpL-CD95L fusion proteins have been employed to analyze translocation of CD95 to “lipid rafts”. In these experiments, GpL-CD95L trimers were applied to “mark” inactive CD95 molecules. Upon activation of the remaining free CD95 molecules using highly active Fc-CD95L, an increased association of these inactive receptors with “lipid rafts” was observed. Apparently activated CD95 molecules stimulate in “trans” the co-translocation of inactive CD95 receptors to “lipid rafts”. This has also been confirmed in experiments with transfectants expressing chimeric CD40-CD95 receptors. These chimeric receptors are able to activate CD95-mediated signaling pathways after stimulation with CD40L. After stimulation of endogenous CD95 in CD40-CD95 transfectants the unstimulated chimeric CD40-CD95 receptors co-translocated to “lipid rafts”. Conversely, activation of CD95-associated pathways by specific stimulation of chimeric CD40-CD95 receptors resulted in co-translocation of the endogenous CD95. In conclusion, it has been shown that a functional death domain and caspase-8 activation turned out to be essential for both “lipid raft” association of signaling-active CD95 molecules and co-translocation of inactive CD95 receptors induced by active receptor species.

Le CD95 appartient à la famille du TNF-R. Il est capable de déclencher un signal apoptotique et joue un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie du système immunitaire et dans l’élimination de cellules infectées ou transformées. Suite à la fixation de son ligand le CD95L ou d’un anticorps agoniste, le CD95 recrute la protéine FADD, qui à son tour agrège les caspases initiatrices (i.e., caspase -8 et -10). Le complexe formé par le CD95, FADD et les caspases -8/10 est appelé DISC, pour Deah Inducing Signaling Complex. Une fois le DISC formé, l’agrégation des caspases initiatrices entraîne leur activation, et la mort de la cellule par apoptose. Ce signal médié par CD95, peut être modulé par la distribution ou l’exclusion du récepteur vis à vis des microdomaines membranaires ou radeaux lipidiques. Ces domaines de la membrane plasmique sont des structures membranaires enrichies en sphingolipides et cholestérol. La relocalisation de CD95 dans ces radeaux lipidiques permet d’amplifier le signal de mort. L’activation de la voie phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt, est connue pour sa capacité à protéger les cellules tumorales du signal apoptotique médié par CD95, et à induire des mouvements latéraux de CD95 à la membrane. Nos travaux montrent que l’inhibition de la voie PI3K/Akt induit i) la relocalisation du CD95 dans les microdomaines et ii) l’induction du signal apoptotique CD95 indépendamment de la présence du ligand CD95L. Ainsi, nous mettons en évidence que la voie PI3K/Akt est capable d’augmenter le seuil d’activation du signal CD95 en agissant en amont de la formation du DISC ou de l’interaction CD95/CD95L, en maintenant le récepteur exclu des microdomaines. / CD95 belongs to the TNF-R superfamily, and it triggers an apoptotic signal. CD95 plays a key role in homeostasis of the immune system and in the elimination of infected and transformed cells. Upon CD95L binding, CD95 recruits FADD, which in turn aggregates initiator caspases (i.e., caspase-8 and -10). The complex CD95, FADD and caspase-8/10 is called DISC for Death Inducing Signaling Complex. At the DISC level, caspase aggregation leads to their activation and death of the cells through apoptosis. The CD95-mediated apoptotic signal is modulated by microdomains, or lipid rafts, which are plasma membrane sub-domains enriched in sphygolipids and cholesterol. Thereby, partition of CD95 into lipid rafts promotes the apoptotic signal. Activation of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway is known to prevent the CD95-mediated apoptotic signal in malignant cells, and to control lateral mobility of CD95 at the plasma membrane. Herein, we showed that inhibition of PI3K signal induced i) the distribution of CD95 into lipid rafts and ii) the subsequent induction of the CD95-mediated apoptotic signal through a CD95L independent manner. In conclusion, we pinpointed that PI3K/Akt signaling pathway inhibits the CD95 signal by acting upstream DISC formation and even upstream the CD95-CD95L interaction through the exclusion of the death receptor from the microdomains.

Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und geschädigten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgelöst werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die räumliche Nähe der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex führt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle führt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. Störungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. Die Tumorzellen sind große, einkernige Hodgkin- oder mehrkernige Reed/Sternbergzellen (HRS-Zellen). Sie leiten sich von Keimzentrum-B-Zellen ab. In HRS-Zellen fehlt die Expression einer Vielzahl von typischen B-Zellmarkern, darunter die des B-Zellrezeptors. Solche B-Zellen sterben normalerweise während der Keimzentrumsreaktion durch Apoptose. An diesem Prozess ist CD95 beteiligt. In einer Reihe von malignen Erkrankungen wurden eine Herunterregulation der CD95-Expression oder Mutationen im CD95-Gen beobachtet. Es wird daher vermutet, dass CD95-induzierte Apoptose zur Entfernung von Tumorzellen beiträgt. Im Gegensatz dazu exprimieren sowohl primäre HRS-Zellen als auch etablierte HRS-Zelllinien in der Regel Wildtyp-CD95, sind aber trotzdem CD95-resistent. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des CD95-Systems, im Gegensatz zu anderen malignen Erkrankungen, in den HRS-Zellen hochreguliert sind, darunter CD95 selbst. In immunpräzipitierten DISCs von CD95-stimulierten HRS-Zellen wurde neben FADD und Caspase-8/-10 auch c-FLIP nachgewiesen. c-FLIP ist ein Caspase-8/-10-Homolog, das ebenfalls an FADD bindet, aber aufgrund fehlender katalytischer Aktivität die Aktivierung der Caspasen im DISC und damit die Apoptoseinduktion verhindert. Eine starke c-FLIP-Expression konnte in allen HRS-Zelllinien und in den HRS-Zellen nahezu aller untersuchter primärer Hodgkinfälle (55/59) gezeigt werden. Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von c-FLIP war es möglich, HRS-Zelllinien gegenüber CD95-induzierter Apoptose zu sensitivieren. Dies zeigt, dass die CD95-Rezeptor-induzierte Apoptose in den HRS-Zellen nicht strukturell, sondern funktionell inhibiert ist und c-FLIP stark zu dieser Inhibition beiträgt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die c-FLIP-Expression in den HRS-Zellen von der konstitutiven Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB abhängt, die charakteristisch für diese Zellen ist. Normalerweise wird NF-κB von Inhibitorproteinen, den IκBs, im Zytoplasma zurückgehalten. Diverse Stimuli können den IKK-Komplex aktivieren, der die IκBs an bestimmten Serinresten phosphoryliert. Dies hat die Ubiquitinylierung und den Abbau der IκBs zur Folge, wodurch NF-κB frei wird, in den Kern wandert und dort seine Zielgene aktiviert. Es wird angenommen, dass in HRS-Zellen ein konstitutiv aktiver IKK-Komplex und teilweise Mutationen der IκB-Proteine zur konstitutiven NF-κB-Aktivität beitragen. Zu den NF-κB-abhängigen Genen in den HRS-Zellen gehören solche mit anti-apoptotischer und Zellzyklus-treibender Wirkung. Die Inhibition der NF-κB-Aktivität in den HRS-Zellen führt zu Apoptose und eingeschränkter Proliferation. Von dreiwertigem Arsen ist bekannt, dass es die Induzierbarkeit des IKK-Komplexes inhibieren kann und damit letztendlich die Aktivierung von NF-κB. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arsen in HRS-Zellen den konstitutiv aktiven IKK-Komplex inhibiert. In Zelllinien mit intakten IκB-Proteinen führte dies zur NF-κB-Inhibition und Apoptoseinduktion. Die Reduktion der NF-κB-Aktivität ging mit der Herunterregulation von anti-apoptotischen und Proliferations-fördernden Zielgenen einher. Die ektope Überexpression von NF-κB hob die Apoptose-induzierende Wirkung von Arsen teilweise auf. Durch Arsen-Behandlung von Mäusen konnte das Tumorwachstum xenotransplantierter HRS-Zellen stark verlangsamt werden. In explantierten Tumorzellen konnte ebenfalls eine NF-κB-Inhibition nachgewiesen werden. Die NF-κB-Inhibition durch Arsen trägt also stark zur Apoptoseinduktion in den HRS-Zellen bei. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Modulation der Apoptoseresistenz neue therapeutische Ansätze für die Behandlung des Hodgkin Lymphoms bieten könnte. Der Einsatz von Arsen ist dabei besonders interessant, da Arsen schon für die Behandlung anderer maligner Erkrankungen eingesetzt wird. / Apoptosis, the programmed cell death, is important for the balance between proliferation and dying of cells. It is also involved in the removal of infected and damaged cells. Apoptosis can be induced by stimulation of receptors of the TNF-receptor family like CD95. After ligand-induced trimerisation of these receptors, FADD binds to the cytoplasmic part of the receptor and recruits Caspase-8 and/or -10. The induced proximity of the caspases in this complex, called DISC, leads to their auto- and transcatalytic cleavage and subsequently to their activation. This starts the apoptotic program which leads to the death of the cell. A number of anti-apoptotic proteins control this process. The deregulation of this system is involved in a variety of diseases. The disruption of the apoptotic program can contribute to the development of tumors. Classical Hodgkin Lymphoma is a malignant disease of the lymphatic system, characterized by mononucleated Hodgkin or multinucleated Reed/Sternberg (HRS) cells. These tumor cells are derived from germinal-center B-cells. However, HRS cells lack the expression of typical B cell markers, such as the B-cell receptor. Usually, B-cells without B-cell receptor expression die by apoptosis during the germinal-center reaction. CD95 is involved in this process. It has been shown previously that in many malignant diseases CD95 is down-regulated or mutated, indicating that CD95 is involved in the removal of tumor cells. In opposite to these findings, primary HRS cells and Hodgkin-derived cell lines usually express wild type CD95, but are resistant to CD95 induced apoptosis. In this work, it could be demonstrated that in contrast to other malignant diseases components of the CD95 system are up-regulated in HRS cells, including CD95 itself. By immunoprecipitation it was shown that, in addition to FADD and Caspase-8/-10, c-FLIP is a component of the DISC in CD95-stimulated cells. c-FLIP is a caspase homolog which, like caspases, binds to FADD, but lacks proteolytic activity. It inhibits the activation of caspases in the DISC and thus prevents apoptosis induction. A strong c-FLIP expression was shown in all HRS cell lines and in HRS cells of nearly all investigated primary cases of Hodgkin Lymphoma (55/59). siRNA-mediated (small interfering RNA) down-regulation of c-FLIP sensitized HRS cell lines to CD95-induced apoptosis. This shows that the CD95 receptor-induced apoptosis in HRS cells is not structurally but functionally inhibited and that c-FLIP strongly contributes to this inhibition. In addition, it was shown that c-FLIP expression depends on the constitutive activity of the transcription factor NF-κB which is characteristic for HRS cells. Usually, NF-κB is sequestered in the cytoplasm by inhibitor proteins, the IκBs. A variety of stimuli can activate the IKK-complex which subsequently phosphorylates the IκBs, leading to their ubiquitinylation and degradation. The released NF-κB translocates to the nucleus where it activates the transcription of target genes. It is supposed that a constitutively activated IKK complex and, in some cases, mutated IκB proteins contribute to the constitutive NF-κB activity in HRS cells. To the NF-κB dependent genes in HRS cells belong those with anti-apoptotic and cell cycle promoting activities. Inhibition of the NF-κB activity in HRS cells leads to apoptosis and decreased proliferation. Trivalent arsenic is known to inhibit the induction of the IKK complex and thus the activation of NF-κB. In this work, it was shown that arsenic inhibits the constitutively active IKK complex in HRS cells. This led to an inhibition of NF-κB and induction of apoptosis in HRS cell lines with non-mutated IκB proteins. The NF-κB inhibition was accompanied by the down-regulation of anti-apoptotic and cell cycle promoting genes. Ectopic overexpression of NF-κB partially reverted the apoptotic effect of arsenic. Treatment of mice with arsenic reduced the growth of subcutaneously xenotransplanted HRS cells. In explanted tumor cells, a reduced NF-κB activity could be demonstrated following treatment with arsenic. Thus, the inhibition of NF-κB by arsenic contributes to the induction of apoptosis in HRS cells. Taken together, the results indicate that modulation of the apoptosis resistance may offer new strategies for the treatment of Hodgkin Lymphoma. Of particular interest is the application of arsenic because it is already used in the treatment of other malignant disorders.

Depuis sa découverte en 1991, l’implication du récepteur CD95 dans l’induction de l’apoptose a été plus que largement décrite. Mais bien qu'ayant été identifié comme étant un récepteur de mort, CD95 est aussi capable d'induire un signal pro-oncogénique lorsqu'il est fixé au CD95L clivé. L’activation de cette voie de signalisation non-apoptotique par le s-CD95L contribue au processus inflammatoire dans le lupus et à la dissémination métastatique dans les cancers du sein triples négatifs. Cependant aucun traitement thérapeutique satisfaisant n’est à ce jour disponible. De par son implication dans des pathologies cancéreuses et inflammatoires, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la double signalisation de CD95 n’est plus un enjeu mais une nécessité. Afin de développer des molécules pour bloquer la signalisation non apoptotique de CD95, il est essentiel d’en identifier tous les protagonistes et de définir leur fonction biologique. C’est avec cet objectif que notre équipe a mené deux études protéomiques dont les résultats ont permis d’identifier eIF4A1 comme un nouveau partenaire direct de CD95. Nous montrons que eIF4A1 est indispensable à la mise en place de la signalisation pro-motile de CD95 dépendante de la voie PI3K. De plus eIF4A1 est recruté à la membrane ainsi que les autres protéines du complexe eIF4F. Nos données de séquençage ont montré que de par cette interaction, CD95 recrute à la membrane un ensemble d’ARNm impliqués dans la réponse immunitaire et l’adhésion cellulaire. En outre, une perte de CD95 dans certaines cellules cancéreuses conduit à la perte d’expression de ces ARNm. Ainsi CD95 pourrait protéger certains ARNm de la dégradation et favoriser la traduction des ARNm pro-inflammatoires de manière indépendante du ligand. Cibler spécifiquement cette interaction pourrait être une piste thérapeutique prometteuse dans la lutte contre les cancers du sein triples négatifs mais aussi contre le lupus. / Since its discovery in 1991, the involvement of the CD95 receptor in the induction of apoptosis has been more than widely described. But although identified as a death receptor, CD95 is also capable of inducing a pro-oncogenic signal when attached to the cleaved CD95L. Activation of this non-apoptotic signaling pathway by s-CD95L contributes to the inflammatory process in lupus and metastatic spread in triple negative breast cancers. However, no satisfactory therapeutic treatment is currently available. By its implication in cancerous and inflammatory pathologies, better understanding the mechanisms at the origin of the double signaling of CD95 is no longer an issue but a necessity. In order to develop molecules to block the non-apoptotic CD95 signaling, it is essential to identify all the protagonists and define their biological function. Our team conducted two proteomic studies, the results of which identified eIF4A1 as a new direct partner of CD95. We show that eIF4A1 is essential for the implementation of PI3K pathway-dependent CD95 signaling. In addition eIF4A1 is recruited to the membrane as well as the other eIF4F complex proteins. Our sequencing data showed that by this interaction, CD95 recruits a set of mRNAs involved in the immune response and cell adhesion. In addition, a loss of CD95 in some cancer cells leads to the loss of expression of these mRNAs. Thus CD95 could protect certain mRNA from degradation and promote the translation of pro-inflammatory mRNAs independently of the ligand. Specific targeting of this interaction could be a promising therapeutic avenue in the fight against triple negative breast cancers but also against lupus.

<p>To maintain homeostasis, T lymphocytes die through caspase&ndash;dependent apoptosis. However, blockage of caspase activity in T lymphocytes does not increase cell survival. The loss of caspase 8 activity leads to programmed necrosis (necroptosis) upon T cell receptor (TCR) stimulation in T lymphocytes. Necroptosis is correlated with excessive macroautophagy, an intracellular catabolic process characterized by the sequestration of cytoplasmic compartments through double&ndash;membrane vacuoles. Meanwhile, the proper induction of macroautophagy is required for T lymphocyte survival and function. Cellular caspase 8 (FLICE)&ndash;like inhibitory protein (c&ndash;FLIP) promotes survival in T lymphocytes. c&ndash;FLIP suppresses death receptor&ndash;induced apoptosis by modulating caspase 8 activation. Whether this modulation plays a role in the regulation of necroptosis has yet to be studied. Additionally, overexpression of c&ndash;FLIP reduces autophagy induction and promotes cell survival in cell lines. It remains unclear whether c&ndash;FLIP protects primary T lymphocytes by regulating the threshold at which autophagy occurs. In this study, c&ndash;FLIP isoform&ndash;specific conditional deletion models were used to study the role of c&ndash;FLIP in necroptosis and autophagy in primary T lymphocytes.</p><p>Our results showed that the long isoform of c&ndash;FLIP (c&ndash; FLIP_L) regulates necroptosis by inhibiting receptor interacting protein 1 (RIP&ndash;1). Upon TCR stimulation, c&ndash;FLIP_L&ndash;deficient T cells underwent RIP&ndash;1&ndash;dependent necroptosis. Interestingly, though previous studies have generally described necroptosis in the absence of caspase 8 activity and apoptosis, pro&ndash;apoptotic caspase 8 activity and the rate of apoptosis were also increased in c&ndash;FLIPL&ndash;deficient T lymphocytes. Moreover, c&ndash; FLIP_L&ndash;deficient T cells exhibited enhanced autophagy, which served a cytoprotective function. </p><p>Apoptosis can be induced by either death receptors on the plasma membrane (extrinsic pathway), or the damage of the genome and/or cellular organelles (intrinsic pathway). Previous studies in c&ndash;FLIP&ndash;deficient T lymphocytes suggested that c&ndash;FLIP promotes cell survival in the absence of death receptor signals. Independent of death receptor signaling, mitochondria sense apoptotic stimuli and mediate the activation of caspases. Whether c&ndash;FLIP regulates mitochondrion&ndash;dependent apoptotic signaling remains unknown. Here, by deleting the <italic>c&ndash;Flip <italic> gene in mature T lymphocytes, we showed a role for c&ndash;FLIP in the intrinsic apoptosis pathway. In naïve T cells stimulated with the apoptosis inducer, c&ndash;FLIP suppressed cytochrome c release from mitochondria. Bim&ndash;deletion rescued the enhanced apoptosis in c&ndash;FLIP&ndash;deficient T cells, while inhibition of caspase 8 did not. Different from activated T cells, there were no signs of necroptosis in c&ndash;FLIP&ndash;deficient naïve T cells. Together, our findings indicate that c&ndash;FLIP is a key regulator of apoptosis, necroptosis and autophagy in T lymphocytes.</p> / Dissertation

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:07Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12661a.pdf: 1894354 bytes, checksum: 39e63c18340aaa8ae1aee1ec0b447c39 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:08Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12661a.pdf: 1894354 bytes, checksum: 39e63c18340aaa8ae1aee1ec0b447c39 (MD5) Publico-12661b.pdf: 1881342 bytes, checksum: 92081544fa53e07e990b31d9fe71e6a8 (MD5) / Objetivo: O Papillomavirus humano (HPV) é o agente etiológico do câncer cervical, mas isoladamente é incapaz de induzir a oncogênese. A progressão para as lesões invasoras está associada à imunidade do hospedeiro, dentre as quais, a interferência no processo de apoptose celular. Entre os vários genes associados à morte celular, o gene FAS parece ser um elemento importante. O objetivo deste estudo foi avaliar se há uma associação do polimorfismo da região promotora -670 do gene FAS com a NIC 3 e o carcinoma invasivo do colo do útero. Métodos: A avaliação da presença do polimorfismo do gene FAS foi realizada através da Técnica de PCR e RFLP em amostras de sangue para o grupo controle (225 amostras) e de tecido cervical para o grupo de casos, com NIC 3 (75 casos) e carcinoma invasor (214 casos). A análise estatística foi realizada através do cálculo do Teste Exato de Fisher, Kruskal-Wallis, Mann-Whitney e Qui-Quadrado, sendo considerado o valor de significância de 5% ou p<0,05. Resultados: O genótipo heterozigoto (AG) do gene FAS -670 foi significativamente mais frequente no grupo de mulheres com NIC 3, com um risco estimado de 3 vezes (OR=3,0; 95% IC: 1,29-7,16), quando ajustado a idade. Não houve diferença, porém, tanto no grupo controle quanto nas mulheres com carcinoma cervical. Nenhum genótipo esteve associado a um maior risco de NIC 3 ou câncer quando comparamos idade e etnia. Nas mulheres com câncer, os genótipos foram semelhantes nos diferentes tipos histológicos (epidermóide e adenocarcinoma) e grau de diferenciação tumoral. Avaliando a distribuição alélica (A e G), não observamos diferença na frequência dos alelos nos grupos estudados. Conclusão: O polimorfismo da região promotora do gene FAS -670 esteve associado a um risco maior de lesão intraepitelial de alto grau (NIC 3), mas não para o câncer invasor do colo do útero, quando comparados ao grupo controle. / Objective: The human papillomavirus (HPV) is the etiologic agent of cervical cancer, but alone it is incapable of inducing oncogenesis. Rather, progression to invasive lesions is associated with host immunity and interference in the process of cellular apoptosis. Among the several genes involved in cell death, the FAS gene appears to be an important factor. The aim of this study was to evaluate whether there is an association between polymorphisms of the FAS -670 gene promoter region and preinvasive and invasive lesions of the cervix. Methods: The FAS gene was evaluated for the presence of polymorphisms using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism techniques in 225 blood samples for the control group, as well as cervical tissue from patients with cervical intraepithelial neoplasia grade 3 (CIN 3; 75 cases) or invasive carcinoma (214 cases). Results: The heterozygous genotype (AG) of the FAS -670 gene promoter region was significantly more frequent in women with CIN 3, with an estimated risk of three times (OR=3.0; 95% CI: 1.29 to 7.16). No difference, however, was observed in the control group and women with cervical cancer. In women with cancer, the genotypes were similar in the different histological types and degree of tumor differentiation. Assessing allelic distribution (A or G), we observed no difference in frequency of allele in studied groups. Conclusion: Polymorphism of the promoter region of the FAS -670 gene was associated with increased risk of CIN 3, but not for invasive cancer of the cervix when compared to the control group. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Die vorliegende Promotionsarbeit beschäftigte sich mit der Frage, ob der Todesligand TRAIL in Keratinozyten eine Aktivierung verschiedener Mitogen-aktivierter Protein Kinasen (MAPK) induzieren kann und welche physiologische Relevanz diese TRAIL-induzierte MAPK-Aktivität hat. In unseren Analysen konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAPKERK1/2, MAPKJNK1/2 und MAPKp38 mit unterschiedlicher Kinetik aktivieren kann. Diese Aktivierung zeigte sich beeinflusst vom verwendeten Zelltyp, der Zeitdauer der Stimulation sowie dem Ausmaß der TRAIL-induzierten Caspase-Aktivität. Die TRAIL-vermittelte Aktivierung der MAPKERK1/2 beginnt sehr rasch und kann über einen längeren Zeitraum detektiert werden, während die MAPKJNK erst spät aktiviert wird. Im Gegensatz dazu zeigt die MAPKp38 eine biphasische Aktivierung. Die TRAIL-induzierte Aktivierung der MAPK ist teilweise von aktiven Caspasen abhängig, denn eine Präinkubation mit dem pharmakologischen Caspase-Inhibitor zVAD-fmk hemmt sowohl die TRAIL-induzierte MAPKJNK- als auch die MAPKp38-Aktivität. Untersuchungen mit ektoper Expression des physiologischen Caspase-8 Inhibitors c-FLIPL konnten zeigen, dass cFLIPL nicht nur die Spaltung von Caspase-8, sondern auch die verzögerte TRAIL-induzierte MAPKp38-Aktivität hemmen kann. In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem nachgewiesen, dass TRAIL in Keratinozyten nicht nur Apoptose induziert, sondern auch an der Sekretion des proinflammatorischen Chemokins CXCL-8 beteiligt ist. Dabei war die MAPKp38, aber nicht die MAPKERK1/2 an der TRAIL-induzierten Sekretion von CXCL-8 beteiligt. Zukünftig werden weitere detailliertere Untersuchungen insbesondere zur physiologischen Bedeutung der TRAIL-induzierten MAPKJNK- und MAPKERK1/2-Aktivität erforderlich sein, für die diese Arbeit eine wichtige Grundlage gelegt hat. / Analyses should show if the apoptosis-inducing ligand TRAIL activates mitogen-activated protein kinases (MAPK) in keratinocytes. Further studies examined the physiological relevance of TRAIL-induced MAPK-activity. Our data demonstrate that TRAIL induces MAPK ERK1/2, MAPK JNK1/2 and MAPK p38. This induction depends on cell specifity, duration of stimulation and caspases activity. TRAIL induces MAPK ERK1/2 activity rapidly and MAPK JNK1/2 at late timepoints. In contrast MAPK p38 is biphasically activated by TRAIL. TRAIL-induced MAPK-activity depends on active caspases because pretreatment with the pharmacological pancaspases-inhibitor zVAD-fmk inhibits TRAIL-induced MAPK JNK and p38-activity. Furthermore, ectopic expression of c-FLIPL inhibits MAPK p38-activation at late timepoints. Our analyses demonstrate that TRAIL beside apoptotic signals, induces CXCL-8 secretion. This depends on active MAPK p38 but does not need MAPK ERK1/2 activity. The data show that further investigations especially about the physiological relevance of TRAIL-induced MAPK-activity is needed.

In dieser Arbeit wurde die Zytolyse, die durch HIV-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) bewirkt wird, untersucht. Grundsätzlich erscheinen in der Abwehr viraler Infekte sowohl CD4+ wie CD8+ CTL. In chronisch HIV-Infizierten sind in der Regel lediglich CD8+ CTL zu finden. HIV-spezifische CD4+ CTL können aber zum Beispiel in Impfstudien aus Probandenblut isoliert werden. Sie erwiesen sich als zytolytisch aktiv und waren außerdem, wie in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden konnte, auch an einer Fusions-vermittelten Lyse beteiligt. Diese ist Kalzium-unabhängig, auch mit heterologen Zellen möglich und die Expression des HIV-gp120 an der Zelloberfläche der Zielzellen ist essentiell, während die Präsentation von gp120 Epitopen nicht ausreicht. Die Konsequenz dieser Lyseform ist die apoptotische Zerstörung aller beteiligten Zellen. CD4+ HIV-spezifische CTL können über diesen Lysemechanismus bereits in der akuten Phase der Infektion einer negativen Selektion unterliegen, was ein Grund für das Fehlen der HIV-spezifischen CD4+ CTL in chronisch Infizierten darstellen kann. HIV-spezifische CD8+ CTL konnten aus einem HIV-positiven Patienten isoliert werden. Insgesamt wurden fünf Klone näher charakterisiert. Zwei erkannten jeweils ein Epitop aus unterschiedlichen Bereichen des extrazellulären Anteils des Glykoproteins, einer einen Bereich des p17-Anteils und zwei dasselbe Epitop im p24-Anteil des gag-Proteins. Dieses Epitop, plaziert innerhalb der Aminosäuren 71 bis 85, konnte hier zum erstenmal für die Präsentation mit HLA B51 beschrieben werden. In der spezifisch induzierten Lyse wiesen alle CD8+ CTL-Klone zwei Lysemechanismen auf, einen Perforin-vermittelten und einen CD95-vermittelten Anteil. Die CD95-vermittelte Lyse war stets prozentual geringer, und zusätzlich, sowohl Klon- wie Zielzell-spezifisch, unterschiedlich stark ausgeprägt . In HIV-infizierten primären Zellen ließ sich kein CD95-Anteil signifikant nachweisen, was darauf hinweist, daß dieser Lysemechanismus wahrscheinlich keine Rolle bei der Zerstörung infizierter Zellen im peripheren Blut spielt. In anderen Geweben kann sich die Situation unterschiedlich darstellen. Desweiteren konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß das Vakzinia-Virus B13R-Genprodukt die CD95-vermittelte Apoptose hemmt. Daher muß bei der Untersuchung apoptotischer Vorgänge, die Wahl der eingesetzten Vektoren genauestens bedacht werden. / In this work the HIV-specific cytotoxic T-lymphocyte (CTL) mediated cytolysis was investigated. Normally CD4+ and CD8+ CTL are generated to defend viral infections. In chronically infected HIV-patients generally only CD8+ CTL are detectable. But HIV-specific CD4+ CTL can be isolated fram blood of HIV-vaccine candidates, for example. These CTL were cytolytic active and, as shown in this work for the first time, were also involved in fusion-mediated lyses. This lyses is independent of extracellular calcium, works with heterologous cells and the expression of HIV-gp 120 at the cell surface is essential. A presentation of gp 120 epitopes by HLA is not sufficient. In consequence this form of lysis is destructive in an apoptotic manner for all participating cells. CD4+ HIV-specific CTL could be negative selected by this mechanism in the early stage of infection. This could be a reason for the absence of HIV-specific CD4+ CTL in chronically infected patients. HIV-specific CD8+ CTL were isolated from one patient. Five were characterized in more detail. Two of them recognized an epitope in different parts of the extracellular region of the glycoprotein, one discerned the p17-protein and two the same epitope of the p24-part of the gag-protein. This epitope, localized between amino acids 71 to 85, is here reported for the fist time for presentation with HLA B51. In specific induced lyses all CD8+ CTL-clones presented two lyses-mechanisms, a perforin-mediated and a CD95-mediated portion. The CD95-mediated lyses always showed lower percentages and differed dependant on the CTL-clone and the target-cells in its markedness. For HIV-infected primary cells no significant CD95-mediated lyses was detectable, leading to that there is no role for this lyses mechanism in destruction of infected cells in peripheral blood. In other tissues the situation can differ. In this work, furthermore the inhibition of CD95-mediated apoptosis by the Vaccinia Virus B13R gene product was proven. Therefore, the vectors used in investigations of apoptosis has to be chosen carefully.