Clonal haematopoiesis of indeterminate potential, or CHIP are a family of mutations present in the general population. CHIP-mutations are prevalent in the haematopoietic stem cells and in the more mature cell populations, T-lymphocytes, B-lymphocytes and myeloid cells (CD3+, CD19+ and CD33+ cells) in blood. By separating these cell populations using magnetic isolation, extracting DNA from the cell populations, and detecting the same mutation in all cell populations, one can prove the presence of CHIP-mutations in a hematopoietic stem cell. At least 50 ng good quality DNA is needed for the gene analysis to detect CHIP-mutations. The magnet separated cell population may be very small, so the DNA extraction method must be optimized to achieve enough DNA yield. The main purpose of the method development was to compare two storage methods before DNA-extractions, and then three different DNA-quantification methods after the DNA-extractions. After the best storage and quantification methods were identified, five samples of cryo-preserved viable cells were used to isolate cell populations using magnetic beads covered in specific antibodies and a magnetic field, and then quantified. Results of the study showed that the best way was to store the cells in ATL-buffer and Proteinase K. To quantify DNA, qPCR was the most accurate method, since the other methods showed incorrect results because of the low DNA concentrations. Magnet cell separation was partly successful. All except one of the DNA yields from the cell separation protocols reached the critical amount of DNA, but some yields were not pure yields of the sought-after cell population. In general, the method must be worked on more with further research.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / In this study, a novel model for manipulating cancer blood cells based on multi-stage micro channels under varied low field concepts is proposed. Steering Device approach was followed to manipulate the cancer cells based on their various differential potentials across their membranes. The proposed approach considers the size and the surface potential as well as the iso electronic structure of the cells. These research objectives emphasize the separation of the cells in the blood stream, and differentiates various blood cells and tumors for further analysis within the microfluidic channels. The dimensions of the channel sets the required electric field for manipulating the cancer cells within the channels using low electrode voltage function. The outcomes of this research may introduce a new diagnostic approach of finding the minimum residual disease (MRD) scans, early detection and analysis scans. This thesis provides a mathematical model, detailing the theory of the cell sorting device, manipulating the blood cancer cells and design of the device structure are also detailed, leading to the optimum research parameters and process. A Computer Aided Design (CAD) was used to model the multi-cell sorting lab-on-chip device, details of hardware and software were used in the simulation of the device various stages. Reverse engineering to configure the potentials for sorting mechanism needs is discussed. The thesis work also presents a comparative study of this sorting mechanism and the other commercially available devices. The practical model of the proposed research is laid out for future consideration.

L’adhésion cellulaire chez les plantes est permise par la présence de la paroi dont les composants sont réticulés afin de former un réseau de polysaccharides liant les cellules entre elles. Cependant, la paroi est un compartiment cellulaire dynamique qui participe à la croissance et au développement de la plante, notamment par son relâchement et sa réorganisation constante et nous ne savons pas exactement comment l'adhésion cellulaire est effectivement maintenue dans ces conditions. Afin d'obtenir une meilleure compréhension des mécanismes qui contrôlent l'adhésion cellulaire chez les plantes, nous avons utilisé une combinaison de crible génétique suppresseur et de crible chémogenomique suppresseur sur les mutants quasimodo1 et quasimodo2 présentant un défaut d'adhésion cellulaire accompagné d’une déficience de synthèse de pectine. Par ces approches nous avons pu isoler des mutants suppresseurs et des molécules chimiques impliquées dans l'adhésion cellulaire. Le crible génétique a conduit à l'identification et l'étude d'un suppresseur muté dans le gène ESMERALDA1, une O-fucosyltransférase putative non caractérisée. L'étude génétique du défaut d’adhésion cellulaire en incluant friable1, muté dans une autre O-fucosyltransférase putative, a montré que la mutation de ESMD1 était suffisante pour supprimer le défaut d'adhésion cellulaire de qua1, qua2 et frb1, ce qui en fait un acteur majeur de l’adhésion cellulaire. Le crible chemogenomic a montré l'implication du transport de l'auxine et de l'activité pectin méthylesterase dans le processus contrôlant l'adhésion cellulaire. Sur la base de ces nouvelles informations, nous avons établi un modèle qui explique la perte de l'adhésion cellulaire chez les mutants quasimodo et friable1, et à partir de ce modèle, nous avons pu déduire l'existence de mécanismes qui permettent le maintien de l'adhésion cellulaire de façon dynamique au cours de croissance et de développement chez les plantes. / Cell to cell adhesion in plants is mediated by the cell wall in which the components are cross-linked in order to create a continuum of polysaccharides linking the cells together. However the cell wall is a dynamic compartment that participates in growth and development through its constant loosening and remodeling and it is not very clear how cell adhesion is actually maintained in these conditions. In order to get a better understanding of the mechanisms that control cell adhesion in plants we used a combination of a forward genetic suppressor screen and a chemical genomic suppressor screen on the cell adhesion defective and pectin synthesis deficient mutants quasimodo1 and quasimodo2, and have isolated a number of suppressor mutants and molecules implicated in cell adhesion. The genetic screen led to the identification and study of a suppressor mutated in the gene ESMERALDA1, an uncharacterized putative O-fucosyltransferase. The genetic study of cell adhesion including another putative O-fucosyltransferase FRIABLE1 showed that the disruption of ESMD1 was sufficient to suppress the cell adhesion defect of qua1, qua2 and frb1, making it a major player of the pathway. The chemical genomic screen has revealed the implication of auxin transport and pectin methyl esterase activity in the process of cell adhesion. Based on these new information we have established a model explaining the loss of cell adhesion in the quasimodo and friable1 mutants, and from this model we have inferred the existence of the mechanisms that dynamically allow the maintenance of cell adhesion in plants during growth and development.

[ES] La abscisión es un proceso de separación celular activo, organizado y altamente coordinado que permite el desprendimiento de órganos vegetativos y reproductivos completos, mediante la modificación de la adhesión celular y la desintegración de las paredes celulares en lugares específicos del cuerpo de la planta conocidos como zonas de abscisión. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), la abscisión de órganos florales y hojas caulinares está regulada por la interacción entre el péptido hormonal (IDA), un par de proteínas quinasas de tipo receptor redundantes, (HAE y HSL2), y correceptores de la familia SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El conocimiento sobre la maquinaria molecular que regula la abscisión en especies de plantas de importancia económica de la familia de las solanáceas es en la actualidad escaso. En esta investigación de doctorado, se realizó un análisis funcional de los componentes del módulo de señalización de abscisión IDA-HAE en N. benthamiana. En la primera sección de este trabajo, se estudió el grado de conservación y la filogenia de las familias de genes IDA-like y HAE-like en especies relevantes del género Solanum, Capsicum y Nicotiana. Se analizó la expresión de estos genes en el alopoliploide N. benthamiana, con el fin de identificar miembros implicados en la abscisión y en la respuesta a condiciones de estrés abiótico como la sequía. En la segunda sección, se evaluó el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de NbenIDA1A y NbenIDA1B, dos homeólogos IDA-like de N. benthamiana que se asociaron con la abscisión de la corola en la sección anterior. Además, también se determinó el efecto sobre la abscisión de la corola del silenciamiento de NbenHAE.1. Las relaciones filogenéticas entre los miembros IDA-like de las solanáceas estudiadas, agruparon los dos pares de homeólogos de proteínas NbenIDA1 y NbenIDA2 con los prepropéptidos de Arabidopsis relacionados con la abscisión. El análisis de las regiones promotoras en busca de elementos reguladores reveló que estos dos pares de homeólogos contenían elementos de respuesta tanto hormonales como de respuesta a la sequía, aunque NbenIDA2A carecía de los elementos reguladores hormonales. Los análisis de expresión génica también indican que el par de homeólogos NbenIDA1 se regulan positivamente durante la abscisión de la corola. Los pares NbenIDA1 y NbenIDA2 mostraron una expresión diferencial tisular en condiciones de estrés hídrico, ya que los homeólogos NbenIDA1 se indujeron en hojas estresadas, mientras que los homeólogos NbenIDA2, especialmente NbenIDA2B, se indujeron en raíces estresadas. En las plantas con crecimiento activo no estresadas, los nudos y los entrenudos fueron los tejidos con los niveles de expresión más altos de todos los miembros de la familia IDA-like y sus receptores HAE-like putativos. El silenciamiento basado en VIGS del par de homeólogos NibenIDA1 y NbenHAE.1 suprimió la abscisión de la corola en flores de N. benthamiana, lo que fue causado por un bloqueo en la desintegración de la pared celular en la base de la corola, probablemente debido a la falta de inducción de las enzimas hidrolíticas relacionadas con la abscisión. La sobreexpresión ectópica del homeólogo NbenIDA1A adelantó la senescencia y la abscisión de la corola y afectó negativamente al crecimiento de las plantas de N. benthamiana. Los resultados obtenidos utilizando la aproximación VIGS mostraron que el par de homeólogos NbenIDA1 y el receptor NbenHAE.1, posiblemente actuando como un módulo de señalización similar al descrito en Arabidopsis, regulan la abscisión de la corola en las flores de N. benthamiana. Este es, por tanto, el primer ejemplo en una especie vegetal distinta de Arabidopsis thaliana que indica que el módulo de señalización de abscisión IDA-HAE/HSL2 se conserva en las angiospermas. / [CA] L'abscisió és un procés de separació cel·lular actiu, organitzat i altament coordinat que permet el despreniment d'òrgans vegetatius i reproductius complets, mitjançant la modificació de l'adhesió cel·lular i la desintegració de les parets cel·lulars en llocs específics del cos de la planta coneguts com a zones d'abscisió. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), l'abscisió d'òrgans florals i fulles caulinars està regulada per la interacció entre el pèptid hormonal (IDA), un parell de proteïnes cinases de tipus receptor redundants, (HAE i HSL2), i coreceptors de la família SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El coneixement sobre la maquinària molecular que regula l'abscisió en espècies de plantes d'importància econòmica de la família de les solanàcies és en l'actualitat escàs. En aquesta recerca de doctorat, es va realitzar una anàlisi funcional dels components del mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE en N. benthamiana. A la primera secció d'aquest treball, es va estudiar el grau de conservació i la filogènia de les famílies de gens IDA-like i HAE-like en espècies rellevants de l'gènere Solanum, Capsicum i Nicotiana. Es va analitzar l'expressió d'aquests gens en l'al·lopoliploide N. benthamiana, per tal d'identificar membres implicats en l'abscisió i en la resposta a condicions d'estrès abiòtic, com la sequera. A la segona secció, es va avaluar l'efecte del silenciament i la sobreexpressió de NbenIDA1A i NbenIDA1B, dos homeòlegs IDA-like de N. benthamiana, que es van associar amb l'abscisió de la corol·la en la secció anterior. A més, també es va determinar l'efecte sobre l'abscisió de la corol·la del silenciament de NbenHAE.1. Les relacions filogenètiques entre els membres IDA-like de les solanàcies estudiades, van agrupar els dos parells d'homeòlegs de proteïnes NbenIDA1 i NbenIDA2 amb els prepropèptids d'Arabidopsis relacionats amb l'abscisió. L'anàlisi de les regions promotores a la recerca d'elements reguladors va revelar que aquests dos parells d'homeòlegs contenien elements de resposta tant hormonals com de resposta a la sequera, encara que NbenIDA2A mancava dels elements reguladors hormonals. Les anàlisis d'expressió gènica també indiquen que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 es regulen positivament durant l'abscisió de la corol·la. Els parells NbenIDA1 i NbenIDA2 van mostrar una expressió diferencial tissular en condicions d'estrès hídric, ja que els homeòlegs NbenIDA1 es van induir en fulls estressades, mentre que els homeòlegs NbenIDA2, especialment NbenIDA2B, es van induir en arrels estressades. A les plantes amb creixement actiu no estressades, els nusos i els entrenusos van ser els teixits amb els nivells d'expressió més alts de tots els membres de la família IDA-like i els seus receptors HAE-like putatius. El silenciament basat en VIGS del parell d'homeòlegs NibenIDA1 i NbenHAE.1 va suprimir l'abscisió de la corol·la en flors de N. benthamiana, lo qual va ser causat per un bloqueig en la desintegració de la paret cel·lular a la base de la corol·la, probablement degut a la manca d'inducció dels enzims hidrolítics relacionades amb l'abscisió. La sobreexpressió ectòpica de l'homeòleg NbenIDA1A va avançar la senescència i l'abscisió de la corol·la i va afectar negativament el creixement de les plantes de N. benthamiana. Els resultats obtinguts utilitzant l'aproximació VIGS van mostrar que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 i el receptor NbenHAE.1, possiblement actuant com un mòdul de senyalització similar al descrit en Arabidopsis, regulen l'abscisió de la corol·la en les flors de N. benthamiana. Aquest és, per tant, el primer exemple en una espècie vegetal diferent d'Arabidopsis thaliana que indica que el mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE/HSL2 es conserva en les angiospermes. / [EN] Abscission is an active, organized and highly coordinated cell separation process that enables the detachment of entire vegetative and reproductive organs, through the modification of cell-to-cell adhesion and breakdown of cell walls at specific sites on the plant body, known as abscission zones. In Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), abscission of floral organs and cauline leaves is regulated by the interaction of the hormonal peptide (IDA), a pair of redundant receptorlike protein kinases, (HAE and HSL2), and SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE co-receptors. Knowledge about the molecular machinery regulating abscission in economically important plant species of the Solanaceae family is currently scarce. In this PhD research, a functional analysis of the components of the abscission signaling module IDA-HAE in N. benthamiana was carried out. In the first section of this work, the degree of conservation and the phylogeny of the IDA-like and HAE-like gene families in relevant species of the genus Solanum, Capsicumand Nicotiana were determined. The expression of these genes in the allopolyploid N. benthamiana was analyzed, in order to identify members involved in abscission and in the response to abiotic stress conditions, such as drought. In the second section, the effect of the silencing and overexpression of NbenIDA1A and NbenIDA1B, two N. benthamiana IDA-like homeologs, which were associated with corolla abscission in the previous section, was evaluated. Furthermore, the effect on corolla abscission of the silencing of NbenHAE.1 was also determined. The phylogenetic relationships among the IDA-like members of the Solanaceae studied, grouped the two pairs of NbenIDA1 and NbenIDA2 protein homeologs with the Arabidopsis prepropeptides related to abscission. Analysis of promoter regions searching for regulatory elements showed that these two pairs of homeologs contained both hormonal and drought response elements, although NbenIDA2A lacked the hormonal regulatory elements. Gene expression analyses also indicate that the pair of NbenIDA1 homeologs are upregulated during corolla abscission. NbenIDA1 and NbenIDA2 pairs showed tissue differential expression under water stress conditions, since NbenIDA1 homeologs were highly expressed in stressed leaves, while NbenIDA2 homeologs, especially NbenIDA2B, were highly expressed in stressed roots. In non-stressed active growing plants, nodes and internodes were the tissues with the highest expression levels of all members of the IDA-like family and their putative HAE-like receptors. VIGS-based silencing of the pair of NibenIDA1 homeologs and NbenHAE.1 suppressed corolla abscission in flowers of N. benthamiana, which was supported by a blockage in cell wall disassembly at the corolla base, probably due to the lack of upregulation of abscission-related hydrolytic enzymes. Ectopic over-expression of the homeolog NbenIDA1A advanced the timing of both corolla senescence and abscission and negatively affected the growth of N. benthamiana plants. The results obtained using the VIGS approach showed that the pair of NbenIDA1 homeologs and the NbenHAE.1 receptor, possibly acting as a signaling module similar to that described in Arabidopsis, regulate corolla abscission in N. benthamiana flowers. This is therefore the first example in a plant species other than Arabidopsis thaliana that indicates that the IDA-HAE/HSL2 abscission signaling module is conserved in angiosperms. / Ventimilla Llora, D. (2021). The abscission regulatory module INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION (IDA) / HAESA (HAE)-like receptor kinases in Solanaceae species: Functional analysis in Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167777