La connaissance des mécanismes qui contrôlent la transcription des gènes, comme l’interaction de facteurs protéiques au niveau des promoteurs, est essentielle pour comprendre plusieurs fonctions biologiques et espérer traiter certaines pathologies. Nous nous sommes attardés à mieux comprendre les mécanismes qui régulent trois gènes humains dont les patrons d’expression sont différents et qui sont impliqués dans diverses pathologies en tentant de mettre en parallèle les différences structurales et fonctionnelles entre ceux-ci. Les gènes AβPP et p21 sont exprimés chez l’adulte alors que GPC3 est exprimé uniquement chez l’embryon de façon spécifique aux tissus. L’expression d’AβPP est aussi spécifique aux tissus et sa surexpression fait partie des mécanismes mis en cause chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et du syndrome de Down. Le gène p21 est quant à lui exprimé dans plusieurs types cellulaires et est fortement induit suite à des dommages à l’ADN. Enfin, nous avons montré que GPC3 est exprimé de manière différentielle dans le neuroblastome (NB) et la tumeur de Wilms (WT), deux tumeurs embryonnaires. p21 : La caractérisation du promoteur proximal de p21 dans les fibroblastes humains normaux en prolifération nous a permis de localiser sept empreintes protéiques dont une au niveau de la séquence consensus pour NFI. Les études de retard sur gel, de transfection transitoire, d’immunoprécipitation de la chromatine et d’anti-ARN ont permis de confirmer la liaison de NFI et de le définir comme répresseur important de la transcription de p21. AβPP : Nous avons montré que USF et Sp1 se lient au promoteur de AβPP et que leur liaison est essentielle pour générer une activité maximale du promoteur. La caractérisation in cellulo du promoteur dans les neurones et les astrocytes normaux a révélé huit sites d’interaction ADN-protéine, entre-autres au niveau des sites de liaison des facteurs de transcription CTCF, USF et Sp1. GPC3 : La caractérisation du promoteur de GPC3 nous a permis de montrer 1) une struture chromatinienne particulière tout le long du promoteur et 2) plusieurs empreintes protéiniques putatives dont certaines spécifiques à la lignée SJNB-7 qui exprime GPC3. Parmi ces dernières, nous avons mis en évidence la liaison possible d’un facteur de transcription de type NF-Y. / Gene transcription is the first step to the production of any given protein. Understanding of the molecular mechanisms regulating gene expression, such as the binding of transcription factors to genes promoters, is essential to the understanding of biological functions and to develop new powerful therapies against many clinically documented pathologies. We investigated the transcriptional regulatory mechanisms of three human genes very differently expressed and involved in diverse pathologies in an attempt to reveal structurals and functionals differencies between these mechanisms. AβPP and p21 genes are both expressed in adult while GPC3 is only transcribed in a tissus specific manner before birth. The expression of the AβPP gene is also specific to tissue and its over-expression may be involved in Alzheimer disease and Down syndrome. P21 gene is expressed in many types of cells and is strongly induced by DNA damage. Finally, we demonstrated that GPC3 is differently expressed in neuroblastoma and Wilms' tumor. P21 : The characterization of the proximal promoter from the p21 gene in normal human proliferating fibroblasts revealed seven DNA-protein footprints of which one bears a perfect consensus sequence for the NFI family of transcription factors. EMSA, CHIP, anti-RNA and transient transfection of recombinant constructs analyses clearly demonstrated that NFI interact with the most proximal LMPCR footprint on the p21 promoter and functions as a repressor. Upon serum starvation, a change in the electrophoretic mobility of the NFI DNA-protein complex was observed that may contribute to the activation mechanistic of the p21 gene throughout cell senescence and differentiation. AβPP : We demonstrated that Sp1, like USF, recognizes an element in the human AβPP gene that is necessary for full promoter activity. In cellulo footprinting analysis revealed at least eight DNA-protein interactions including CTCF, USF and many Sp1 target sites. These results were further supported by EMSA and transient transfection analysis. GPC3 : The characterisation of the entire GPC3 gene promoter revealed 1) a particular DNA structure in the promoter and 2) eight large protected regions. The use of competitor oligos in EMSA experiments and super-shift assays showed that an NFY-type transcription factor (TF) may explain the GPC3 aberrant expression in SJNB-7.

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La vessie est un organe qui est sujet à diverses maladies ou malformations nécessitant parfois des chirurgies pour remédier aux problèmes. Ces chirurgies ont souvent pour but d’augmenter le volume utile de la vessie pour protéger les reins. Plusieurs substituts de tissu urologique existent, mais aucun ne possède les qualités suffisantes pour répondre aux conditions physiologiques auxquelles ces tissus seront soumis. L’objectif du projet consiste à créer un substitut entièrement humain par la méthode d’auto-assemblage et à caractériser ce tissu. De plus, la possibilité de produire ce substitut à l’aide des cellules stromales isolées du tissu adipeux a été étudiée. Le potentiel de ces cellules pourrait permettre d’optimiser la greffe de ces substituts. Nos résultats montrent qu’il est possible de reconstruire un substitut entièrement humain par la méthode d’auto-assemblage et que les cellules stromales isolées du tissu adipeux peuvent être utilisées pour participer à la reconstruction d’un substitut vésical.

La peau est un organe densément innervé et vascularisé. L’établissement du réseau nerveux dépend de la sécrétion de signaux diffusibles dans la peau qui instruisent à distance certains neurones de s’y arboriser. Ces signaux sont les facteurs neurotrophiques. L’établissement du réseau vasculaire dépend aussi de la présence de signaux instructifs. Notre objectif général était de mieux comprendre l’influence des signaux neurotrophiques et aussi nerveux dans le contexte cutané. Les travaux présentés dans cette thèse décrivent de nouvelles interactions paracrines. Alors que certaines de ces interactions depuis la peau vers les neurones sensoriels et certaines depuis les neurones sensoriels vers le réseau vasculaire pour la vasodilatation sont déjà établies, nous décrivons l’influence des facteurs neurotrophiques sur le réseau vasculaire et l’influence des neurones sensoriels sur la réépithélialisation. Nous avons premièrement émis l’hypothèse qu’en plus d’influencer les neurones, les facteurs neurotrophiques influencent le réseau vasculaire. Nous montrons que le NGF, le BDNF, le NT-3 et le GDNF sont tous exprimés dans l'épiderme, que le NGF et le NT-3 sont exprimés par les fibroblastes et que le BDNF est produit par les cellules endothéliales. Les cellules de Schwann, également retrouvées dans la peau, produisent du NGF, BDNF et GDNF. Nous montrons que ces peptides sont de très puissants facteurs angiogéniques en utilisant un modèle de derme endothélialisé humain reconstruit par génie tissulaire. Une augmentation de 40 à 80 % du nombre de pseudocapillaires fut observée après l'addition de 10 ng/ml de NGF, 0,1 ng/ml de BDNF, 15 ng/ml de NT-3, et 50 ng/ml de GDNF. Cet effet angiogénique dépend de la liaison aux récepteurs de facteurs neurotrophiques TrkA, TrkB, GFRa-1 et c-ret, qui sont tous exprimés par les cellules endothéliales humaines. Cet effet a été bloqué pour les récepteurs Trk par l’addition de l'inhibiteur compétitif K252a. Ensuite, nous avons dans un deuxième temps émis l’hypothèse que les neurones sensoriels influencent directement la réépithélialisation. Pour vérifier cela, nous avons développé un nouveau modèle de réépithélialisation par génie tissulaire. Il est constitué d’un équivalent épidermique troué exprimant une protéine fluorescente verte qui a été empilé sur un équivalent dermique servant de substrat pour l’épiderme qui referme alors naturellement la plaie. L’équivalent est endothélialisé et innervé ou non par les neurones sensoriels de souris. Nous avons observé que la réépithélialisation est plus rapide en présence de neurones sensoriels. Nous avons démontré que les neurones sensoriels sécrètent une petite protéine dans notre modèle, soit de la substance P, et que les kératinocytes expriment le récepteur cellulaire NK1 de la substance P. Enfin, nous montrons que la substance P contribue à augmenter la vitesse de fermeture des plaies induites par les neurones à l'aide d’un agoniste et d’un antagoniste du récepteur NK1. L'ensemble des résultats procure une meilleure compréhension de l’importance des contextes neurotrophiques et nerveux dans la peau. Nos résultats pourraient laisser présager que d’améliorer la régénération nerveuse cutanée lorsqu’elle est déficiente améliorerait aussi l’homéostasie du tissu cutané. / The skin is an organ densely innervated and vascularized. The establishment of the cutaneous nervous system depends on the secretion of neurotrophic factors by the skin. Meanwhile, the establishment of the vascular network also depends on soluble instructive cues. The work presented in this thesis describes new paracrine interactions. While interactions from skin to sensory neurons for the development of innervation and interactions from sensory neurons to blood vessel for vasodilation of the vasculature are described elsewhere, we demonstrate here the influence of neurotrophic factors on the vascular network and the influence of sensory neurons on the reepithelialization of wounds. Our overall goal was to clarify the influence of the neurotrophic and nervous contexts on the homeostasis of the skin. First, we hypothesized that in addition to their neuronal contribution, neurotrophic factors also influence the vascular network. We show that NGF, BDNF, NT-3 and GDNF are expressed in the epidermis, while NGF and NT-3 are expressed by fibroblasts and BDNF by endothelial cells. Finally, Schwann cells produce NGF, BDNF and GDNF. We show that these peptides are very potent angiogenic factors using a model of human endothelialized reconstructed dermis by tissue engineering. An increase of 40 to 80% of the number of capillary-like tubes was observed after the addition of 10 ng/ml NGF, 0.1 ng/ml of BDNF, 15 ng/ml of NT-3, and 50 ng/ml of GDNF. This angiogenic effect depends on the neurotrophic factor receptor TrkA, TrkB, GFRa-1 and c-ret that are all expressed by human endothelial cells. This effect was blocked by adding the Trk inhibitor K252a for NGF, BDNF and NT-3. Second, we hypothesized that sensory neurons directly influence reepithelialization by secreting the neuropeptide substance P. To verify this, we developed a new model of reepithelialization. It consists of a perforated epidermal equivalent expressing a green fluorescent protein stacked on a dermal equivalent that is used as a bed for reepithelialization. The reconstructed skin is endothelialized and innervated or not with sensory neurons of mouse. Sensory neurons produce substance P in the model and keratinocytes express the NK1 cell receptor for substance P. Keratinocyte migration was quantified by fluorescence. Reepithelialization was faster in presence of sensory neurons and we show that substance P contributes to this effect with agonist and antagonist of the NK1 cell receptor. The overall results provide a better understanding of the importance of the neurotrophic and sensory contexts in the skin. Thus, cutaneous innervation does not only contribute to the sensory detection. Our findings may suggest that improving nerve regeneration would improve skin long term tissue homeostasis.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique caractérisée par une insuffisance médullaire, un risque augmenté de cancers et plusieurs types de malformations. FANCC constitue la seule des 15 protéines FA qui se localise principalement au cytoplasme. De ce fait, en plus de son rôle dans la réparation de l’ADN, FANCC pourrait intervenir dans d’autres mécanismes régulant la croissance des cellules hématopoïétiques. Pour mieux comprendre ses fonctions, nous avons cherché de nouveaux partenaires de FANCC. Le corépresseur de la transcription CtBP1 a été retenu pour analyse. L’étude des interactions a confirmé le lien physique FANCC CtBP1 et révélé que CtBP1 est un membre du complexe FA. Afin d’éclaircir la fonction des interactions, nous avons analysé le profil d’expression génique de cellules réprimées pour les gènes FA ou CtBP1. Les résultats ont montré une expression augmentée de l’antagoniste de la voie Wnt Dickkopf 1 (DKK1). Ainsi, les essais de gènes rapporteurs ont établi que CtBP1 et FANCC agissent comme répresseur transcriptionnel du promoteur DKK1. Nous avons aussi observé que FANCD2 réprime indirectement DKK1 en favorisant l’expression de l’oncogène c Myc. Le mécanisme pourrait dépendre d’interactions entre les protéines FA, incluant FANCC, et les protéines de l’appareil transcriptionnel Wnt, CtBP1 et  caténine. Par ailleurs, nous avons montré que FANCC s’accumule au noyau en réponse à la signalisation Wnt et qu’elle participe avec d’autres protéines FA à l’activation de la  caténine. Ainsi, nous avons trouvé des niveaux élevés de DKK1 dans le surnageant des cellules appauvries en protéines FA et CtBP1, de même que dans les sérums de souris knockout FancA et FancC. Notre étude a permis de montrer que FANCC et les protéines FA, de concert avec CtBP1, agissent dans la régulation transcriptionnelle de l’antagoniste DKK1. Ces résultats suggèrent que FANCC est une protéine clé impliquée dans la signalisation Wnt. Puisque DKK1 est impliqué dans des processus connus pour être perturbés dans la FA, la régulation de DKK1 par FANCC et CtBP1 représente un mécanisme pouvant expliquer la perte progressive des cellules souches hématopoïétiques et représente une étape cruciale pour la découverte de stratégies visant à prévenir l’insuffisance médullaire chez les patients FA. / Fanconi anemia (FA) is a genetic disease characterized by bone marrow failure, excess cancer risk, as well as a broad array of malformations. FANCC is one of fifteen genes linked to the FA disease and encodes a protein that, unlike other FA proteins, is localized primarily to the cell cytoplasm. Because of this, in addition to its role in DNA crosslink repair, FANCC is proposed to function in other mechanisms that can regulate hematopoietic progenitor cell fate. To better understand its functions, we investigated for new partners of the FANCC protein. One candidate, the transcriptional corepressor CtBP1, was selected for further analyses. Interatomic studies confirmed the physical link between FANCC and CtBP1 and revealed that CtBP1 is a member of the FA core complex. To investigate biological function of these interactions, we used a microarray strategy and found that the Wnt antagonist Dickkopf 1 (DKK1) is upregulated in FA and CtBP1 depleted cells. Accordingly, CtBP1 and FANCC were found to act as transcriptional repressor on DKK1 promoter in reporter gene assays. We also observed that FANCD2 indirectly represses DKK1 in promoting the expression of c Myc. Functional mechanism of these repressions may be explained on the observation that FANCC and FA core complex proteins interact with the Wnt transcriptional machinery proteins including CtBP1 and  catenin. Furthermore, we showed that FANCC accumulates into the nucleus in response to Wnt signalisation and participates with other FA proteins in  catenin activation. Therefore, we found increased levels of DKK1 in FA and CtBP1 depleted cells supernatant as well as in sera from FancA and FancC knockout mice. Functional interaction studies showed that FANCC and FA proteins with CtBP1 act in transcriptional regulation of the Wnt antagonist DKK1. These findings suggest that FANCC is a key protein involved in the Wnt signalling response. Because DKK1 is implicated in biological processes similar to those involved in FA pathogenesis, linking FANCC with CtBP1 to the regulation of DKK1 suggests a possible mechanism explaining the progressive loss of bone marrow cells and represents a crucial step for the development of novel strategies aimed at preventing bone marrow failure in FA patients.

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Résumé Les plaquettes jouent un rôle central dans le maintien de l’hémostase et sont impliquées dans les maladies cardiovasculaires. Ces éléments sont anucléés, mais contiennent des ARN messagers (ARNm), dont la traduction pourrait être régulée par leurs microARN. Au cours de ce projet, je me suis concentrée à mieux caractériser ces microARN, afin de déterminer leur rôle dans la fonction plaquettaire. L’étude du répertoire complet des microARN plaquettaires humains, réalisée par séquençage à haut débit, montre un profil caractérisé par la forte expression de microARN impliqués dans la différentiation cellulaire et la mégacaryopoïèse. La diversité des microARN plaquettaires est enrichie par l’expression d’isoformes décalées en 5’, tel que miR-140-3p, ce qui leur confère la capacité de réguler des ARNm différents de l’isoforme principale. Beaucoup de microARN plaquettaires sont modifiés en 3’, ce qui peut altérer leur stabilité et influencer leur fonction. La présence de deux nucléotidyl-transférases et l’activité d’uridylation, observées dans des extraits protéiques de plaquettes in vitro, démontrent la capacité des plaquettes à modifier et à réguler leurs microARN. Dans un second temps, j’ai étudié l’implication des microARN dans les défauts plaquettaires observés chez les patients urémiques, dialysés ou non. Bien que les complexes impliqués dans la biogenèse et la fonction des microARN demeurent fonctionnels, le profil des microARN plaquettaires est altéré chez les patients urémiques, et semble rétabli par la dialyse. Deux gènes ont été identifiés comme étant régulés par des microARN altérés chez les patients urémiques, suggérant que l’altération de la régulation de certains ARNm par les microARN pourrait contribuer aux défauts plaquettaires chez ces patients. Militant en faveur d’un rôle des microARN dans la traduction des ARNm plaquettaire, j’ai mis en évidence (i) l’association des complexes effecteurs Argonaute 2 (Ago2)•microARN avec les ARNm, et (ii) la régulation de certains ARNm, traduits dans les plaquettes, par des microARN abondamment retrouvés dans celles-ci. Suite à l’activation des plaquettes, ces dernières sécrètent des microARN, essentiellement dans des microparticules, à l’intérieur desquelles ils sont associés à Ago2. Globalement, mes résultats laissent entrevoir un rôle important pour les microARN plaquettaires dans la régulation de leurs ARNm et la communication intercellulaire. / Platelets play a central role in hemostasis and are involved in cardiovascular diseases. Devoid of a nucleus, platelets nevertheless contain messenger RNAs (mRNAs) and are capable of de novo protein synthesis. MicroRNAs are particularly abundant in platelets, suggesting that they may regulate mRNA translation. In this project, I characterized further the microRNA repertoire and pathway of human platelets in order to gain more insights into their role in platelet function. High-throughput sequencing analysis of human platelet small RNAs revealed an abundant array of microRNAs involved in cell differentiation or megakaryopoiesis. The diversity of platelet microRNAs is expanded by the expression of 5’ shifted isoforms, as observed with miR-140-3p that may regulate mRNAs different than the reference sequence. Most platelet microRNAs are extensively modified at their 3’ extremity, a process that is thought to alter their stability and function. The detection of two nucleotidytranferases, as well as uridylation activity in platelets, demonstrate their ability to modify and regulate their microRNAs. I then studied the implication of microRNAs in the platelet defects observed in uremic patients, undergoing dialysis or not. Although the complexes involved in microRNA biogenesis and function remain functional, the platelet microRNA profile of uremic patients was altered, but seems to be restored by dialysis. The identification of two genes that are regulated by microRNAs altered in uremic patients suggests that an alteration of microRNA-based mRNA regulatory mechanisms may underlie the platelet response to uremia. Consistent with a role for microRNAs in regulating platelet mRNAs, Ago2•microRNA complexes are associated with platelet mRNAs. In addition, certain mRNAs translated in platelets can be regulated by microRNAs that are particularly abundant in platelets. Following their activation, platelets secrete microRNAs, mainly via microparticles, in which they are found associated with Ago2. Altogether, my results suggest that platelet microRNAs may play an important role in the regulation of platelet mRNAs as well as in intercellular communications.