La maladie d’Huntington (HD) est un désordre neurodégénératif autosomal dominant qui se manifeste suite à une mutation du gène huntingtin. La maladie est caractérisée par une panoplie de signes cliniques qui incluent des problèmes psychiatriques, cognitifs ainsi que des incapacités motrices, en grande partie des mouvements choréiformes. D’un point vue neuropathologique, les cerveaux des patients touchés par la maladie présentent une atrophie majeure du cortex et du striatum où des pertes cellulaires massives sont observées. Il n’existe aucune cure ni traitements efficaces pour cette maladie, et pour ces raisons, plusieurs efforts sont actuellement déployés afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques telle, entre autre, la transplantation cellulaire. Ma thèse de Doctorat a donc porté, en grande partie, sur l’analyse de cerveaux de patients huntingtoniens recrutés pour l’essai clinique de l’University of South Florida. Ces patients, décédés entre 9 et 12 ans post-transplantation, ont reçus des greffes de tissu dérivé de l’éminence ganglionic latérale de fœtus humains âgés entre 8 et 9 semaines post-conception. Des travaux antérieurs menés dans le laboratoire du Dre Ciccheti ont montré que la survie des greffes est compromise à long terme chez ces patients. L’objectif de mon projet était de mieux comprendre les mécanismes responsables de la survie suboptimale des greffes. Nous avons donc formulé l’hypothèse que 1) la faible vascularisation des greffes, 2) la méthode de transplantation (des morceaux de tissu entier vs. des cellules mécaniquement dissociées) ainsi que 3) la présence de la protéine huntingtin mutée (mHtt) au sein du tissu greffé pouvaient contribuer à la dégénérescence des greffes. En effet, nous avons observé que les éléments de l’unité neurovasculaire étaient largement absents au sein des greffes. Les greffes présentaient une plus faible densité de capillaires et l’absence de larges vaisseaux sanguins, comparativement au cerveau hôte. Nous avons de plus observé un nombre réduit d’astrocytes au sein des greffes et une interaction limitée de ces cellules avec les vaisseaux sanguins, suggérant une défaillance des éléments de la barrière hémato-encéphalique. L’absence d’astrocytes était accompagnée par une carence de la sous-unité connexin 43 des gap junctions, importante pour les interactions greffe-hôte. Nous avons ensuite démontré que lorsque des cellules dissociées étaient transplantées dans le striatum de souris YAC128, un modèle murin de la maladie d’Huntington, la survie de la greffe était excellente et ni la vascularisation ou ni l’interaction entre les astrocytes et les vaisseaux était altérée. Finalement, nous avons fait l’extraordinaire découverte d’agrégats de la mHtt au sein du tissu greffé. Nous avons observé ces agrégats exclusivement dans la matrice extracellulaire de la greffe dans les tissus humains tandis qu’ils étaient présents au sein des neurones, de leurs dendrites, de la lame basale des vaisseaux sanguins et de la matrice extracellulaire dans le cerveau du patient. Dans son ensemble, cette thèse met en lumière de nouveaux mécanismes pouvant contribuer à la faible survie des greffes chez les patients souffrant de HD à long-terme. Ces résultats seront fort utiles afin d’améliorer cette approche thérapeutique et aideront à une meilleure compréhension des processus pathologiques de la maladie d’Huntington. / Huntington’s disease (HD) is a devastating autosomal dominant neurodegenerative disorder which manifests because of a mutation in the huntingtin gene. It is characterized by a variety of clinical signs which include psychiatric and cognitive problems as well as motor disabilities, in large part choreiform movements. Neuropathologically, the brains of patients afflicted with this disease present with a major atrophy of the cortex and striatum where massive cell losses are observed. To this day, cures remain unavailable and for this reason, an enormous amount of energy has been put into the development of experimental approaches, and for example into embryonic neuronal cell transplantation, which aims to replace lost cells. A few clinical trials have thus been initiated to evaluate whether such methodologies would be beneficial to patients. My PhD thesis focused, in large part, on the analysis of a number of brains from patients recruited for the University of South Florida trial and who eventually came to autopsy. These patients (4 analyzed post-mortem) received solid pieces of fetal striatal tissue and died between 9 and 12 years post-transplantation. Previous work carried out in Dr. Cicchetti’s laboratory has shown that graft survival is compromised in these patients long-term. The aim of my project was to further understand the mechanisms underlying this suboptimal graft survival. We hypothesized that 1) poor vascularization of the graft, 2) the method of transplantation (solid tissue vs. suspension cells) and 3) the potential presence of mutant huntingtin (mHtt) within the grafted tissue may all contribute to graft demise. Indeed, elements of the neurovascular unit were largely absent within the solid grafts. Grafts presented a lower density of capillaries and absence of large blood vessels compared to the host brain. Moreover, we observed a reduced number of astrocytes within the grafts and a limited interaction of these cells with blood vessels, suggesting impairment in blood brain barrier elements. The absence of astrocytes was accompanied by the lack of the gap junction subunit connexin 43, important for graft-host integration. Interestingly, when dissociated cells were transplanted in the striatum of YAC128 mice, a murine model of HD graft survival was excellent and neither the graft vascularization nor the interaction between astrocytes and vessels was altered. Finally, we describe for the first time the presence of mHtt inclusions within the grafted tissue. In the HD transplanted cases, aggregates were detected only in the extracellular matrix of the graft while in the host brain they co-localized with neurons or other cellular elements, such as the basal lamina of blood vessels. Taken together, this thesis sheds new light onto potential mechanisms contributing to poor long-term graft survival in HD patients. These results will help improve such therapies as well as to better understand disease process in HD.

Afin de permettre l’application chez l’homme de nouvelles technologies médicales comme la thérapie cellulaire régénératrice, il est primordial d’être en mesure de localiser in vivo les cellules transplantées à l’intérieur d'un tissu. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique de choix en raison de son excellente résolution anatomique. Par contre, l’utilisation d’un agent de contraste est nécessaire afin de marquer et de suivre à la trace des cellules implantées puisque leur contraste intrinsèque les rend difficiles à distinguer des tissus environnants. Les agents à effet de contraste négatif tel que les oxydes de fer sont les plus souvent envisagés pour effectuer un suivi cellulaire in vivo. Un problème se pose lorsqu’il est question de quantification ou de localisation précise d’une implantation cellulaire. En effet, la présence d’un artéfact négatif excédant le volume qu’occupent les cellules nuit à la précision de la technique. Pour ces raisons, ce projet porte sur l’élaboration d’une méthodologie de marquage de cellules cancéreuses employant un agent de contraste d’IRM générant un contraste positif. Ce projet de recherche avait pour but d’évaluer le potentiel des nanoparticules d’oxyde de manganèse (MnO) et d’oxyde de gadolinium (Gd2O3) comme agents de contraste pour le marquage cellulaire. Des nanoparticules synthétisées par des collègues ont été utilisées dans le cadre de ce projet. Le projet de maîtrise décrit ici est constitué de trois volets : 1) le développement d’un protocole d’analyse élémentaire des éléments chimiques Mn et Gd dans des cellules marquées d’agent de contraste; 2) l’élaboration d’une procédure de quantification du signal généré par des cellules marquées par un agent de contraste paramagnétique; et 3) la démonstration de la possibilité de suivre in vivo par IRM, des cellules marquées. Ce projet a été ponctué de mesures de viabilité cellulaire ainsi que d’études de microscopie à transmission (MET) cellulaire, permettant de démontrer l’internalisation des agents de contraste dans les cellules. Les cellules marquées ont été visualisées en IRM sous forme de culots de cellules de différentes tailles, puis implantées par stéréotaxie chez des souris afin de réaliser un suivi de la prolifération des cellules in vivo. Ces études ont permis de mesurer le signal d’IRM généré par des cellules cancéreuses marquées de nanoparticules de MnO et de Gd2O3, en utilisant des séquences dites « pondérées en T1». Ces études montrent que les nanoparticules paramagnétiques permettent de détecter plusieurs dizaines de milliers de cellules implantées localement ( 20 000). Cette limite intrinsèque devrait être prise en compte dans les procédures d’implantation utilisant des marqueurs paramagnétiques à base de Gd et de Mn. / To allow the application of new medical technologies such as regenerative cell therapy to humans, it is essential to be able to localize the tissue-implanted cells in vivo. Magnetic resonance imaging (MRI) is a technique of choice because of its excellent anatomical resolution. On the other hand, use of a contrast agent is required to label and keep track of the implanted cells as their intrinsic contrasts make them difficult to distinguish from surrounding tissue. Negative contrast agents like iron oxides are the most often considered tracking cells in vivo. A problem appears when quantification or determination of the exact location of a cell implantation is needed. Indeed, the presence of a negative artifact far exceeding the volume occupied by the cells compromises the accuracy of the technique. For these reasons, this project focuses on developing a methodology to label cancer cells using a positive contrast agent for MRI. This research project aims at evaluating the potential of manganese oxide (MnO) and gadolinium oxide (Gd2O3) nanoparticles as contrast agents for cell labeling. Nanoparticles synthesized by co-workers were used in this project. The master's project described here consists of three (3) components: 1) development of a valid protocol of elemental analysis of Mn and Gd quantification in labeled cells, 2) development of a procedure for quantification of the MRI signal generated by cells labeled with paramagnetic contrast agent, and 3) demonstrating of the in vivo track ability by MRI, cells labeled with a paramagnetic agent. This project was punctuated by measures of cell viability and cell visualisation by transmission electron microscopy (TEM), to demonstrate the internalization of contrast agents into cells. The labeled cells were visualized by MRI in the form of cell pellets of various sizes, and implanted in mice by stereotactic methods to achieve a monitoring of cell proliferation in vivo. These studies measure the MRI signal generated by cancer cells labeled by MnO and Gd2O3 nanoparticles, using "T1 weighted" sequences. These studies show that paramagnetic nanoparticles can detect tens of thousands of locally implanted cells ( 20 000). This inherent limit should be taken into account in the settlement procedures using Gd and Mn based labels.