Mad1 est une protéine clé du point de contrôle du fuseau en mitose. Associée à Mad2,elle est recrutée aux kinétochores non-attachés où elle y catalyse la production du complexe inhibiteur d’anaphase. La protéine Mad1 a longtemps été décrite comme étant un simple récepteur de Mad2 aux kinétochores. Certaines études laissaient toutefois entrevoir des rôles additionnels de cette protéine en mitose comme en interphase.Afin d’explorer ces fonctions additionnelles de Mad1, j’ai étudié le phénotype mitotique associé à une déplétion de la protéine par ARN interférence dans des lignées cellulaires S2 de drosophile. J’ai également analysé des mutations et délétions du domaine N-terminal de Mad1, celui-ci présentant certaines particularités de structures primaires et secondaires tels que des sites de phosphorylation, un putatif NLS et des hélices amphipathiques. J’ai ainsi montré que le recrutement de Mad1 aux kinétochores en mitose nécessitait la phosphorylation de son domaine N-terminal. Mes analyses cytologiques ont de plus permis de déterminer que le NLS, situé dans ce même domaine N-terminal, est non seulement fonctionnel mais également essentiel à la localisation de Mad1 à l’enveloppe nucléaire et dans le nucléoplasme en interphase.J’ai finalement étudié une protéine Mad1 déplétée de son domaine N-terminal (Mad1Δ71) en spermatocytes de drosophile. Notre laboratoire a récemment montré que dans ces cellules, la protéine Mad1 fait partie d’un territoire nucléaire associé à la chromatine, appelé MINT (Mad1 containing Intranuclear Territory). Ce nouveau territoire, comportant au moins quatre autres protéines (Mad2, Mtor/Tpr, Ulp1 et Raf2), est impliqué dans la régulation de la conformation de la chromatine. Mes analyses ont révélé que la protéine Mad1 Δ71 se localisait anormalement dans le noyau, restant accolée à l’enveloppe nucléaire, et entraînait avec elle l’ensemble de ses partenaires. Ceci suggère que Mad1 est essentielle à l’organisation de ces protéines dans le nucléoplasme, mais également qu’elle pilote la mise en place du territoire MINT. / Mad1 is a key component of the spindle assembly checkpoint in mitosis. Recruitedwith Mad2 to unattached kinetochores, they catalyze the formation of the anaphase inhibitor.Mad1 has long been described as a simple receptor for Mad2 at kinetochores. However,studies are pointing toward additional roles of this protein in mitosis as well as in interphase. To explore these additional functions of Mad1, I studied the mitotic phenotypeassociated with a depletion of the protein by RNA interference in Drosophia S2 cell lines. Ialso analyzed mutations and deletions of the N-terminal domain of Mad1, this one havinginteresting features in its primary and secondary structures, namely phosphorylation sites, aputative NLS and amphipathic helices. I have shown that Mad1 recruitment to kinetochore inmitosis depends on phosphorylations of its N-terminal domain. Moreover, my cytologicalanalyses allowed me to determine that the N-terminal NLS was not only functional but alsoessential for the localization of Mad1 into the nucleus in interphase. Finally, I studied a Mad1 mutant depleted for its N-terminal region (Mad1 Δ71) indrosophila spermatocytes. Our laboratory recently showed that in these cells, Mad1 is part ofa nuclear territory associated with chromatin, named MINT (Mad1 containg IntranuclearTerritory). This new territory, composed of at least four other proteins (Mad2, Mtor/Tpr,Ulp1, Raf2), is involved in chromatin conformation regulation. My studies revealed that inthese cells, Mad1 Δ71 is abnormally localized in the nucleus, staying closed to the nuclearenvelope, and carry with it all its partners. This suggests that Mad1 is essential for the nuclearorganization of these proteins, but also that it pilots the establishment of the MINT territory.

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates. In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays. Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates. In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays. Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.

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