Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente et mortelle chez les jeunes enfants. Il se caractérise par une résistance à la chimiothérapie possiblement en partie dû à la présence de cellules initiatrices de tumeurs (TICs). Des études ont mis en évidence le rôle de CD133 comme un marqueur des TICs dans divers types de cancers. Les buts de notre travail étaient d’abord de démontrer les vertus de TICs des cellules exprimant CD133 et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome avec des polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs), d’effectuer une analyse différentielle entre les TICs et les autres cellules du NB afin d’en identifier les anomalies génétiques spécifiques. Des lignées cellulaires de NB ont été triées par cytométrie de flux afin d’obtenir deux populations: une enrichie en CD133 (CD133high), l’autre faible en CD133 (CD133low). Afin de déterminer si ces populations cellulaires présentent des propriétés de TICs, des essais sur les neurosphères, les colonies en agar mou et les injections orthotopiques de 500 cellules sélectionnées dans 11 souris ont été réalisées. Après une isolation de l’ADN des populations sélectionnées, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 ». Pour vérifier l’expression des gènes identifiés, des Western Blots ont été réalisés. Nos résultats ont démontré que la population CD133 avait des propriétés de TICs in vitro et in vivo. L’analyse génotypique différentielle a permis d’identifier deux régions communes (16p13.3 and 19p13.3) dans la population CD133high ayant des gains et deux autres régions (16q12.1 and 21q21.3) dans la population CD133low possédant des pertes d’hétérozygoties (LOH). Aucune perte n’a été observée. Parmi les gènes étudiés, l’expression protéique d’éphrine-A2 était corrélée à celle de CD133 dans 6 tumeurs et 2 lignées cellulaires de NB. De plus, l’augmentation de la concentration d’anticorps anti-éphrine-A2 dans le milieu diminue la taille des neurosphères. Ainsi, la population CD133high, qui a des vertus de TICs, possède des caractéristiques génotypiques différentes par rapport à celle CD133low. La présence d’éphrine-A2 dans les cellules exprimant CD133 souligne son importance dans le développement des TICs. Ces résultats suggèrent la présence de potentielle cible pour de nouvelles thérapeutiques ciblant les TICs mise en évidence par l’étude génomique. / Neuroblastoma (NB) is the most common and deadly extracranial solid tumor of childhood characterized by a resistance to chemotherapy possibly due to the presence of tumor initiating cells (TICs). Studies showed the role of CD133 as a marker of TICs in various types of cancers. Our goals were first to demonstrate the stemness of TICs expressing CD133 and then, using a global genomic analysis with single nucleotide polymorphism (SNPs), to perform a differential analysis between TICs and other cells of NB to identify the specific genetic abnormalities. NB cell lines were sorted by flow cytometry to obtain two populations: one enriched in CD133 (CD133high), the other low in CD133 (CD133low). To determine whether these cell populations have TICs properties, we test the ability of cells to form either neurosphères or, colonies in soft agar and we also test their carcinogenic properties by orthotopic injections of 500 selected cells in 11 mice. After a DNA extraction on selected populations, a differential genotyping analysis has been made with Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. To verify the expression of the genes identified, Western blots had been made. Our results have demonstrated that CD133high population presented TICs properties in vitro and in vivo. The differential genotyping analysis allowed identifying two gains common regions (16p13.3 and 19p13.3) in CD133high population and two others loss of heterozygosity (LOH) (16q12.1 and 21q21.3) in CD133low population . No losses were observed. Among the genes studied, ephrin-A2 protein expression was correlated to CD133 expression in 6 NB tumors and 2 NB cell lines. Also, ephrin-A2’s increased concentration influenced the neurospheres by decreasing their size. Thereby, CD133high population, which had TICs properties, possess different genotyping characteristics compared to CD133low population. The presence of ephrine-A2 in cells expressing CD133 emphasizes its importance in the development of TICs. These results suggest the presence of potential target for new therapies targeting the TICs demonstrated by the genomic study.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente et mortelle chez les jeunes enfants. Il se caractérise par une résistance à la chimiothérapie possiblement en partie dû à la présence de cellules initiatrices de tumeurs (TICs). Des études ont mis en évidence le rôle de CD133 comme un marqueur des TICs dans divers types de cancers. Les buts de notre travail étaient d’abord de démontrer les vertus de TICs des cellules exprimant CD133 et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome avec des polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs), d’effectuer une analyse différentielle entre les TICs et les autres cellules du NB afin d’en identifier les anomalies génétiques spécifiques. Des lignées cellulaires de NB ont été triées par cytométrie de flux afin d’obtenir deux populations: une enrichie en CD133 (CD133high), l’autre faible en CD133 (CD133low). Afin de déterminer si ces populations cellulaires présentent des propriétés de TICs, des essais sur les neurosphères, les colonies en agar mou et les injections orthotopiques de 500 cellules sélectionnées dans 11 souris ont été réalisées. Après une isolation de l’ADN des populations sélectionnées, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 ». Pour vérifier l’expression des gènes identifiés, des Western Blots ont été réalisés. Nos résultats ont démontré que la population CD133 avait des propriétés de TICs in vitro et in vivo. L’analyse génotypique différentielle a permis d’identifier deux régions communes (16p13.3 and 19p13.3) dans la population CD133high ayant des gains et deux autres régions (16q12.1 and 21q21.3) dans la population CD133low possédant des pertes d’hétérozygoties (LOH). Aucune perte n’a été observée. Parmi les gènes étudiés, l’expression protéique d’éphrine-A2 était corrélée à celle de CD133 dans 6 tumeurs et 2 lignées cellulaires de NB. De plus, l’augmentation de la concentration d’anticorps anti-éphrine-A2 dans le milieu diminue la taille des neurosphères. Ainsi, la population CD133high, qui a des vertus de TICs, possède des caractéristiques génotypiques différentes par rapport à celle CD133low. La présence d’éphrine-A2 dans les cellules exprimant CD133 souligne son importance dans le développement des TICs. Ces résultats suggèrent la présence de potentielle cible pour de nouvelles thérapeutiques ciblant les TICs mise en évidence par l’étude génomique. / Neuroblastoma (NB) is the most common and deadly extracranial solid tumor of childhood characterized by a resistance to chemotherapy possibly due to the presence of tumor initiating cells (TICs). Studies showed the role of CD133 as a marker of TICs in various types of cancers. Our goals were first to demonstrate the stemness of TICs expressing CD133 and then, using a global genomic analysis with single nucleotide polymorphism (SNPs), to perform a differential analysis between TICs and other cells of NB to identify the specific genetic abnormalities. NB cell lines were sorted by flow cytometry to obtain two populations: one enriched in CD133 (CD133high), the other low in CD133 (CD133low). To determine whether these cell populations have TICs properties, we test the ability of cells to form either neurosphères or, colonies in soft agar and we also test their carcinogenic properties by orthotopic injections of 500 selected cells in 11 mice. After a DNA extraction on selected populations, a differential genotyping analysis has been made with Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. To verify the expression of the genes identified, Western blots had been made. Our results have demonstrated that CD133high population presented TICs properties in vitro and in vivo. The differential genotyping analysis allowed identifying two gains common regions (16p13.3 and 19p13.3) in CD133high population and two others loss of heterozygosity (LOH) (16q12.1 and 21q21.3) in CD133low population . No losses were observed. Among the genes studied, ephrin-A2 protein expression was correlated to CD133 expression in 6 NB tumors and 2 NB cell lines. Also, ephrin-A2’s increased concentration influenced the neurospheres by decreasing their size. Thereby, CD133high population, which had TICs properties, possess different genotyping characteristics compared to CD133low population. The presence of ephrine-A2 in cells expressing CD133 emphasizes its importance in the development of TICs. These results suggest the presence of potential target for new therapies targeting the TICs demonstrated by the genomic study.

La littérature récente suggère que certaines sous populations cellulaires appelées cellules initiatrices de tumeurs (CIT) seraient particulièrement résistantes aux traitements actuels qui visent préférentiellement les cellules prolifératives et, de ce fait, participeraient activement à l'initiation de récidives tumorales et à la formation des métastases. La caractérisation de ces cellules ainsi que de leurs régulateurs revêt par conséquent un intérêt considérable pour la recherche fondamentale et translationnelle. La progastrine est une pro-hormone sécrétée en quantité anormalement importante par la majorité des tumeurs colorectales et qui joue un rôle important dans la promotion du développement tumoral. Les données publiées du laboratoire montrent en effet que l'inhibition de la PG conduit à la baisse des activités WNT/b-caténine et Notch qui sont des voies de signalisations anormalement activées dans les cancers colorectaux (CCR) et nécessaires au maintien des CIT coliques. Ainsi, le but de ce travail de thèse a été de déterminer si la PG possède un rôle régulateur des CIT coliques. Nos résultats indiquent que la PG est fortement exprimée dans des modèles cellulaires enrichis en CIT tels que le sont les colosphères ou les cellules exprimant fortement l'activité enzymatique des aldéhydes déshydrogénases (ALDH+). Le ciblage de la PG, soit par ARN interférent soit par l'utilisation d'anticorps neutralisant la PG dans des lignées cellulaires ou dans des cellules fraichement isolées de biopsies d'adénocarcinomes coliques humains, altère fortement la capacité d'initiation de colosphères sur plusieurs générations alors que le phénotype est sauvé par l'ajout de PG exogène. Ces résultats reflètent un potentiel d'autorenouvellement moindre des CIT in vitro en absence de PG. Le nombre de cellules ALDH+ diminue aussi significativement en absence de PG. À l'inverse, l'ajout de PG exogène stimule da capacité d'initiation des colosphères et augmente le nombre de cellules ALDH+. In vivo, la diminution de l'expression de la PG dans les cellules ALDH+ permet un délai dans l'initiation tumorale et diminue de 16x la propagation des CIT lors du deuxième passage chez la souris immunodéprimée. Ainsi, la PG est sécrétée par les CIT coliques, et, en retour, cette pro-hormone régule le maintien de ces cellules. Enfin, même si le rôle de la PG dans le tissu intestinal sain n'est pas primordial, nos résultats montrent qu'elle est produite par des cellules situées au fond des cryptes intestinales. Nos résultats viennent conforter l'idée selon laquelle le ciblage de la PG représente une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement du CCR. / Recent literature strongly suggests that tumor initiating cells (TIC), resistant to chemotherapies, would be responsible for recurrence and metastasis development in colorectal cancer. Discovering new targets to eradicate these cells become urgent. Our team has shown that Progastrin (PG), a hormonal precursor abnormally secreted by most of colorectal tumors, would be a promising therapeutic target for colorectal cancer (CRC). In a mouse model developing spontaneously intestinal tumors, PG expression reduction leads to tumor growth decrease and remaining tumors display an increase of cell differentiation. Interestingly, tumorigenesis diminution is mediated by WNT-bcatenin and Notch transcriptional activity inhibition. These pathways being abnormally activated in CRC and essential for TIC survival and self-renewal, the aim of this work is thought to characterize PG involvement in TIC phenotype. Our results indicate that Progastrin is produced in TIC enriched models such as in colonospheres and in cells that highly expressed Aldehyde Dehydrogenase (ALDH+) activities. Targeting PG by RNAi or using neutralizing antibodies in cell lines or in cells that were freshly isolated from human's colon adenocarcinoma leads to decrease colonosphere number and self-renewal. Moreover, ALDH+ cells number decline after PG downregulation. In contrast, PG supplementation increases colonospheres initiation as well as ALDH+ cell number. In vivo, PG downregulation in ALDH+ cells that usually secretes PG leads to tumor initiation delay even after a second passage of bulk cells in immunodeficient mice. These results suggest also TIC frequency decrease in absence of PG. Thus, we show that PG is secreted by TIC and regulates their activities. Finally, PG role is not primordial for intestinal tissue homeostasis but our results show that this pro-hormonal precursor is preferentially produced at the bottom of intestine crypt cells. To conclude, our results strongly consolidate the idea of targeting Progastrin as a promising therapeutic strategy for colorectal cancer management.

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à une population cellulaire rare et peu étudiée de l’épithélium intestinal ; les cellules tuft. La fonction de ces cellules fut longtemps débattue dans la littérature, jusqu’à ce que nous découvrions leur fonction dans l’initiation de la réponse immune de type II en réponse à une infection parasitaire. De manière intéressante, ces cellules sont présentes de manière massive et transitoire au sein des lésions adénomateuses précoces et certains groupes ont suggéré l’implication de ces cellules en tant que cellules souches tumorales. Les principaux objectifs de ma thèse ont été de déterminer le rôle des cellules tuft au cours de la tumorigenèse intestinale et colorectale.Nous avons montré que l’absence de cellules tuft impacte le processus de tumorigenèse à la fois dans l’intestin grêle, dans des souris de la lignée Apc14/+, et au niveau du colon, après traitement avec un agent carcinogène. Nos données indiquent que si les cellules tuft n’agissent pas en tant que cellules souches tumorales, leur absence impacte certaines populations de cellules immunitaires. Afin de déterminer les mécanismes permettant aux cellules tuft de moduler le microenvironnement immunitaire, nous avons identifié par analyse transcriptomique de cellules tuft isolées par cytométrie en flux, des gènes codant pour des médiateurs connus pour être impliqués dans la communication avec le système immunitaire. Des analyses in-vivo, permettront de valider d’un point de vue fonctionnel l’implication de ces médiateurs immunitaires dans la fonction immuno-régulatrice des cellules tuft ainsi que dans le développement tumoral.L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier une fonction immuno-régulatrice des cellules tuft au cours d’une infection parasitaire, mais aussi très probablement lors du développement tumoral. La compréhension des mécanismes permettant aux cellules tuft de moduler certaines populations de cellules immunitaires permettra d’identifier des cibles d’intérêt thérapeutique potentiel pour le traitement de patients atteints d’un cancer colorectal. / I focused my PhD project on a scare epithelial cell population referred as tuft cells. Their function has been debated for decades in the literature, until we discovered their crucial role in the initiation of the so-called type-2 immune response following parasitic infection. Interestingly, tuft cells are present in early adenomatous intestinal lesions and literature suggested that these cells could act as cancer stem cells. The main objective of my PhD was to determine the tuft cell function during intestinal and colorectal cancer.We showed that tuft cells deficiency impacts both intestinal and colorectal tumorigenesis process, using Apc14/+ mouse strain and chemically induced carcinogenesis model, respectively. Our data indicate that tuft cells are not cancer stem cells, but that these cells are able to regulate immune cell populations. To get more insights into mechanisms allowing tuft cells to modulate the immune microenvironment, we identified, by transcriptomic analysis of FACS-isolated tuft cells, specific genes encoding mediators involved in the crosstalk with the immune system. Functional in-vivo validation of the most relevant candidates will identify tuft cells derived factors crucial for the immune-regulatory tuft cell function and for tumor development.This work allowed to highlight the immune-regulatory function of tuft cells during parasitic infection and likely during tumor development. A better knowledge of the mechanisms allowing tuft cells to shape either a pro- or an anti-tumoral microenvironment, will potentially paves the way for new therapeutic strategies regarding intestinal and colorectal tumorigenesis.