Les compléments alimentaires à visée oculaire qui envahissent le marché, contiennent dans la majorité des cas des oméga 3, des vitamines, des oligoéléments auxquels sont associés d’autres molécules connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires et/ou anti-oxydantes. Néanmoins, à notre connaissance il n’existait pas d’étude portant sur les formes finalisées complexes de ces compléments. Notre projet a donc pour objectif d’évaluer et de caractériser in-vivo et in-vitro l’effet protecteur sur les cellules rétiniennes d’une supplémentation alimentaire à visée oculaire commercialisée en France et en Tunisie. Ce supplément contient des oméga 3, des caroténoïdes, des vitamines, des oligoéléments et du résvératrol. In-vivo, nous avons utilisé un modèle de dégénérescence rétinienne progressive induite par la lumière et in-vitro un modèle de mort des cellules d’épithélium pigmentaire rétinien (ARPE-19) induite par le peroxyde d’hydrogène (H2O2 ).Dans une première étape nous avons mis en évidence que le complément alimentaire protège la fonction (électrorétinographie, ERG) et la structure (histologie et comptage de cellules apoptotiques) de la rétine contre les lésions induites par la lumière et protège lescellules ARPE-19 contre le stress oxydant induit par le H2O2 (MTT). Dans une deuxième étape, nous avons montré qu’une semaine de supplémentation entraîne une modification du contenu en acides gras dans le plasma et les rétines in-vivo, et dans les cellules ARPE919 in-vitro, caractérisée par une augmentation des taux d’EPA et DPA, deux précurseurs de DHA(HPLC). In-vivo, ni la quantité (spectromètre) ni la vitesse de régénération de la rhodopsine (ERG) ne sont affectées. Au cours de l’exposition à la lumière, l’expression des cytokines (milliplex) est orientée vers un profil anti-inflammatoire et l’expression génique (qPCR) d’iPLA2, PPAR-α, Caspase-12 est maintenue élevée tout au long de l’exposition à la lumière cyclique intense chez les animaux supplémentés. En conclusion, nous avons émis l’hypothèse que l’accumulation préférentielle des acides gras polyinsaturés à longue chaine (EPA et DPA) participe à l’effet protecteur du complément alimentaire en permettant 1/ un renouvellement facilité du DHA rétinien et 2/ ainsi le maintien de l’activité d’iPLA 2. Le DHA libéré des membranes activerait les voies de signalisation anti-inflammatoire et anti-oxydante par l’intermédiaire du récepteur nucléaire PPAR-α. / Dietary supplement for ocular purpose have exploded on the market. In most cases, they contain omega 3, vitamins and trace elements associated with molecules known for their anti-inflammatory and/or anti-oxidant proprieties. However, to our knowledge no studies had evaluated dietary supplements on their finalized complex formulation. In this context, the aim of our project was to evaluate and characterize in-vivo and in-vitro the protective effect on retinal cells of a dietary supplement for ocular purpose marketed in France and Tunisia. This dietary supplement contains omega 3, vitamins, trace elements, carotenoids and resveratrol. Therefore, we have used,an in-vivo experimental model of progressive light-induced retinal damage and an in-vitro model of hydrogen peroxide(H2O2 )-induced retinal pigment cells (ARPE-19) death. First, we have demonstrated that the dietary supplement prevented retinal function (electroretinography, ERG) and structure (histology and detection of apoptotic nuclei) from light-induced retinal damage and protects ARPE-19 cells (MTT) from H2O2 induced oxidative stress. Second, we have shown that one-week supplementation induced modifications in retinal (in-vivo), plasma (in-vivo) and ARPE-19 cells (in-vitro) fatty acids contents, characterized by an increase in EPA and DPA contents, the two synthetic precursors of DHA (HPLC). In addition, in-vivo neither rhodopsin content (spectrometer) nor response recovery (ERG) were affected. Furthermore, during light-exposure cytokines expression (milliplex) were oriented towards an anti-inflammatory profile and gene expression (qPCR) of iPLA2, PPAR-α, Caspase-12 was kept high throughout exposure to intense cyclic light in retina of supplemented animals. In conclusion, we hypothesized that preferential accumulation of long-chain polyunsaturated fatty acids (EPA and DPA ) is involved in the protective effect of dietary supplement allowing : 1 / facilitated renewal of retinal DHA and 2 / maintaining of iPLA 2 activity. DHA released from membranes activate the anti- inflammatory and antioxidant signaling pathways via the nuclear receptor PPAR- α.

Les uvéites non infectieuses sont considérées actuellement comme une des plus importantes cause de déficience visuelle dans la population des jeunes adultes. Les uvéites non infectieuses sont des atteintes inflammatoires de la rétine et de l’uvée et sont généralement considérées comme autoimmunes et initiées par la perte de la tolérance immune aux protéines rétiniennes. Elles sont orchestrées d’une part, systémiquement par deux sous populations lymphocytaires dont la signature cytokinique est l’IFNγ (Th1) et l’IL-17 (Th17) et d’autre part, localement, par l’activation du tissu rétinien. Néanmoins, la vision systémique actuelle est plus complexe et fait intervenir une activation pathologique de l’immunité innée, donnant une composante d’autoinflammation aux uvéites non infectieuses. En plus de ce volet systémique, de nombreux travaux attestent de l’importance de l’activation des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéites non infectieuses. Loin de jouer un rôle passif durant la maladie, elles vont être stimulées par une série de molécules pro-inflammatoires et ainsi permettre le recrutement et l’activation de cellules immunocompétentes. <p>Notre travail de thèse s’inscrit précisément dans ce contexte du rôle de l’activation des cellules rétiniennes et plus spécifiquement de celles de la barrière hémato rétinienne (BHR) dans le développement d’uvéite non infectieuses.<p>Lors de ce travail, nous avons tout d’abord caractérisé in vivo, dans deux modèles expérimentaux, l’expression de la molécule d’adhésion VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule) sur les cellules de la BHR. VCAM-1 est une molécule d’adhésion qui facilite l’extravasation des leucocytes du sang vers les tissus. Nous avons montré que VCAM-1 n’est pas exprimé dans l’œil sain mais est induit progressivement lors de la maladie et que l’intensité et l’extension de son expression étaient dépendantes de la sévérité de la maladie. Par ailleurs, nous avons montré que VCAM-1 pouvait être induit sur l’ensemble des cellules de la BHR. <p>Nous avons ensuite analysé in vitro, sur les cellules de l’EPR (Epithélium Pigmentaire Rétinien) qui forment la partie externe de la BHR, les effets antagonistes du TNFα sur l’induction des molécules de CMH de classe II par l’IFNγ. Durant le processus inflammatoire, l’EPR est la cible d’un ensemble de cytokines secrétées par les cellules inflammatoires. Il a été donc intéressant d’étudier les effets d’autres cytokines présentes lors de l’inflammation sur l’induction du CMHII par l’IFNγ au niveau de l’EPR. Nous avons démontré que le TNFα inhibe l’expression du CMH II induit par l’IFNγ sur les ARPE par régulation négative du CIITA (Class II Transactivator). Comme l’activation des lymphocytes T par les cellules de l’EPR dépend de leur niveau d’expression du CMH II, notre étude soutient l’idée que le TNFα possède des propriétés immunomodulatrices sur l’activation de ces cellules, et participe ainsi à la phase de résolution de l’inflammation.<p>Enfin, nous avons étudié les effets du blocage de l’activation des cellules rétiniennes par l’IFNγ en surexprimant le gène SOCS1 (Suppressor Of Cytokine Signaling) in vivo et in vitro.<p>Nous avons surexprimé le gène SOCS1 au niveau rétinien et étudier l’effet de cette surexpression sur le développement de l’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas montré de différence significative entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP contrôle. Afin de normaliser par rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous avons calculé pour chaque souris un ratio des grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non-injecté. L’analyse de la moyenne de ces ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le groupe SOCS1 et le groupe EGFP en terme de grades cliniques. La différence devient par contre significative lorsque l’analyse de ces ratios est faite sur les grades histologiques. Nos expériences mènent donc plutôt à la conclusion que l’expression de SOCS1, médié par injection intravitréenne de l’AAV2 ne protège globalement pas les yeux du développement d’une UAE.<p>Cette absence d’effet peut avoir comme explication que l’injection intravitréenne conduit à une infection relativement limitée des cellules rétiniennes impliquées dans le développement de l’UAE. Il se pourrait également que le niveau d’expression de la protéine SOCS1 soit trop faible pour obtenir un effet protecteur ou que la surexpression de SOCS1 affecte uniquement l’activation des cellules de la rétine par l’IFNγ mais pas par d’autres cytokines telles le TNFα, l’IL-17, ou l’IL-22 qui jouent aussi un rôle important dans le développement d’UAE. C’est cette dernière hypothèse que nous avons choisi d’investiguer in vitro. Nos résultats montrent que la surexpression de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα.<p>Ce travail met tout d’abord en évidence l’importante expression, in vivo, de VCAM1 par les cellules de la BHR lors d’UAE et in vitro les effets antagonistes du TNFα et de l’IFNγ sur la régulation de l’expression de molécules du CMHII à la surface de l’EPR. Nos expériences démontrent que la surexpression du gène SOCS1 après injection intravitréenne du vecteur AAV-CAG-SOCS1 n’a que peu d’effet sur le développement de la maladie. Par ailleurs, la surexpression de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα et l’IL-17.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le système endocannaboïde (eCB) est constitué des ligands, des récepteurs – les plus étudiés étant les récepteurs CB1 et CB2 – et les enzymes de synthèse et de dégradation. Les ligands étant lipophiles, ils ne sont pas encapsulés dans des vésicules, ce qui place les enzymes de synthèse et de dégradation dans une position de régulateurs clés. Plusieurs études démontrent une participation du système eCB à des processus de développement dans le système nerveux central (SNC). La rétine est un modèle important pour l’étude de ces processus car elle contient plusieurs types cellulaires bien connus, dont le patron de développement est clairement établi. Pour l’instant très peu est connu sur l’expression du système eCB durant le développement rétinien. C’est dans ce cadre que les patrons d’expression du récepteur CB1 et de l’enzyme de dégradation FAAH ont été étudiés pendant le développement rétinien postnatal chez le rat. Pour identifier les types cellulaires exprimant ces protéines, des co-marquages ont été accomplis pour le récepteur CB1 ou FAAH et des marqueurs des types cellulaires rétiniens. À P1, les cellules ganglionnaires, amacrines, horizontales et mitotiques expriment le récepteur CB1. Les cellules ganglionnaires et amacrines cholinergiques sont FAAH-positives. Au cours du développement, certains types cellulaires démontrent une expression transitoire de ces deux protéines, suggérant une implication du système eCB dans les processus de développement. Nos données démontrent également une importante expression du système eCB dans la rétine adulte, ce qui soutient l’hypothèse de son implication dans la réponse rétinienne. En bref, des études fonctionnelles in vitro sur des rétines de non-mammifères ont révélées que le récepteur CB1 modulait la réponse des cônes et des cellules bipolaires. Malgré la récente démonstration de sa présence dans la rétine, il n’existe pas de d’étude sur le rôle du récepteur CB2 dans la rétine. Dans cette thèse, les conséquences fonctionnelles de l’élimination des récepteurs CB1 ou CB2 ont été évaluées chez des souris transgéniques. Les réponses rétiniennes ont été enregistrées par électrorétinographie chez des souris cnr1-/- (CB1R-KO) et cnr2-/- (CB2R-KO). Nos données suggèrent une implication différente pour chaque récepteur dans la formation de la réponse rétinienne / The endocannabinoid (eCBs) system is composed of the ligands, the receptors - the most studied are CB1R and CB2R – and the synthesizing and degradative enzymes. The lipophilic ligands are not stored in vesicles, thereby placing the synthesizing and degradative enzymes as key regulators of the receptor function. The eCB system is thought to participate to developmental processes in the central nervous system (CNS). The rodent retina is a valuable model to study CNS development, as it contains well identified cell types with established developmental timelines. Very little is known about the distribution of this neuromodulationsystem in the developing retina. In this thesis, the expression patterns of CB1R and eCB degradative enzyme FAAH were investigated in the rat retina during postnatal development. To identify the cells expressing these proteins, co-stainings were carried out for CB1R or FAAH and retinal cell type markers. At P1, CB1R was expressed in ganglion, amacrine, horizontal and mitotic cells, whereas FAAH was present in ganglion and cholinergic amacrine cells. In the course of development, both CB1R and FAAH were transiently expressed in some cell type, suggesting a role of the eCB system in developmental processes. Furthermore, our data demonstrated an important expression of both proteins in adult animals, supporting the hypothesis that the eCB system is involved in retinal functions. Briefly, functional in vitro studies on non-mammalian retinae have revealed an effect of CB1R on cone photoreceptors and bipolar cells response. Despite the recent demonstration of CB2R mRNA and protein presence in the retina, there are no data on CB2R functional role in retina have been published. In this thesis, the consequences of removing either CB1R or CB2R from the retina of transgenic mice were evaluated. Retinal response was recorded by electroretinogram in cnr1-/- (CB1R-KO) and cnr2-/- (CB2R-KO) mice. This data suggests that both receptors are involved in shaping the retinal response to light and they have different roles in this process.

Le système endocannaboïde (eCB) est constitué des ligands, des récepteurs – les plus étudiés étant les récepteurs CB1 et CB2 – et les enzymes de synthèse et de dégradation. Les ligands étant lipophiles, ils ne sont pas encapsulés dans des vésicules, ce qui place les enzymes de synthèse et de dégradation dans une position de régulateurs clés. Plusieurs études démontrent une participation du système eCB à des processus de développement dans le système nerveux central (SNC). La rétine est un modèle important pour l’étude de ces processus car elle contient plusieurs types cellulaires bien connus, dont le patron de développement est clairement établi. Pour l’instant très peu est connu sur l’expression du système eCB durant le développement rétinien. C’est dans ce cadre que les patrons d’expression du récepteur CB1 et de l’enzyme de dégradation FAAH ont été étudiés pendant le développement rétinien postnatal chez le rat. Pour identifier les types cellulaires exprimant ces protéines, des co-marquages ont été accomplis pour le récepteur CB1 ou FAAH et des marqueurs des types cellulaires rétiniens. À P1, les cellules ganglionnaires, amacrines, horizontales et mitotiques expriment le récepteur CB1. Les cellules ganglionnaires et amacrines cholinergiques sont FAAH-positives. Au cours du développement, certains types cellulaires démontrent une expression transitoire de ces deux protéines, suggérant une implication du système eCB dans les processus de développement. Nos données démontrent également une importante expression du système eCB dans la rétine adulte, ce qui soutient l’hypothèse de son implication dans la réponse rétinienne. En bref, des études fonctionnelles in vitro sur des rétines de non-mammifères ont révélées que le récepteur CB1 modulait la réponse des cônes et des cellules bipolaires. Malgré la récente démonstration de sa présence dans la rétine, il n’existe pas de d’étude sur le rôle du récepteur CB2 dans la rétine. Dans cette thèse, les conséquences fonctionnelles de l’élimination des récepteurs CB1 ou CB2 ont été évaluées chez des souris transgéniques. Les réponses rétiniennes ont été enregistrées par électrorétinographie chez des souris cnr1-/- (CB1R-KO) et cnr2-/- (CB2R-KO). Nos données suggèrent une implication différente pour chaque récepteur dans la formation de la réponse rétinienne / The endocannabinoid (eCBs) system is composed of the ligands, the receptors - the most studied are CB1R and CB2R – and the synthesizing and degradative enzymes. The lipophilic ligands are not stored in vesicles, thereby placing the synthesizing and degradative enzymes as key regulators of the receptor function. The eCB system is thought to participate to developmental processes in the central nervous system (CNS). The rodent retina is a valuable model to study CNS development, as it contains well identified cell types with established developmental timelines. Very little is known about the distribution of this neuromodulationsystem in the developing retina. In this thesis, the expression patterns of CB1R and eCB degradative enzyme FAAH were investigated in the rat retina during postnatal development. To identify the cells expressing these proteins, co-stainings were carried out for CB1R or FAAH and retinal cell type markers. At P1, CB1R was expressed in ganglion, amacrine, horizontal and mitotic cells, whereas FAAH was present in ganglion and cholinergic amacrine cells. In the course of development, both CB1R and FAAH were transiently expressed in some cell type, suggesting a role of the eCB system in developmental processes. Furthermore, our data demonstrated an important expression of both proteins in adult animals, supporting the hypothesis that the eCB system is involved in retinal functions. Briefly, functional in vitro studies on non-mammalian retinae have revealed an effect of CB1R on cone photoreceptors and bipolar cells response. Despite the recent demonstration of CB2R mRNA and protein presence in the retina, there are no data on CB2R functional role in retina have been published. In this thesis, the consequences of removing either CB1R or CB2R from the retina of transgenic mice were evaluated. Retinal response was recorded by electroretinogram in cnr1-/- (CB1R-KO) and cnr2-/- (CB2R-KO) mice. This data suggests that both receptors are involved in shaping the retinal response to light and they have different roles in this process.