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Heteroplasmy in mammal mitochondrial deoxyribonucleic acidViramontes Martínez, Francisco 12 1900 (has links)
La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris.
Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt.
Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement.
Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire. / Nature has developed strategies to ensure the beginning of life in conditions of homoplasmy, i.e. cells harboring the same mitochondrial DNA (mtDNA). However, novel mtDNA haplotypes can arise by many means during life, leading to heteroplasmy. For instance, mtDNA heteroplasmy can originate artificially through assisted reproductive technologies and naturally by the process of aging. Therefore, this doctoral thesis was divided into two general objectives: Firstly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) during development from embryos, to fetuses and adult tissues, in cattle. Secondly, to analyze the changes in mtDNA heteroplasmy caused by aging in adult germinal and somatic tissues, during oogenesis and early embryogenesis, and in in vitro culture procedures in mice.
In the first series of experiments in cattle, fetal fibroblasts carrying an mtDNA mutation (insertion of 66 bp) were fused to host oocytes carrying wild type mtDNA. The presence of mtDNA from the donor cell was analyzed in 30 SCNT clones at different stages of development: 17-day-old embryos (n=17); 40-day-old fetuses (n=3); 60-day-old fetuses (n=3); one 240 day-old fetus; and 3 post-natal clones (18-24 months). Every individual clone proved to be heteroplasmic and 99% (103/104) of the analyzed tissue samples were heteroplasmic as well. Only the ovary coming from a 240 day old fetus was homoplasmic for the mtDNA of the recipient oocyte. In most (95.2%) of the analyzed tissue samples (99/104) the mean of heteroplasmy was 1.46%. In contrast, one 40-day-old fetus presented high levels of heteroplasmy (20.9%) indicating rare events of donor mtDNA increases. Since most SCNT clones showed heteroplasmy at proportions comparable to the donor mtDNA at the moment of embryo reconstruction, we concluded that heteroplasmy produced by nuclear transfer techniques using somatic cells is due to the neutral segregation of the mtDNA.
In the second series of experiments, performed in mice, females of different ages, i.e. young (0-8 months), middle (8-16 months) and old (16-24 months), were synchronized (gonadotropins) and sacrificed to obtain germinal vesicle oocytes, metaphase-II oocytes in vivo and in vitro. Also, 2-cell and blastocyst stage embryos were obtained from young females in vivo and in vitro. Somatic tissues from females of the three age periods were obtained: brain, granulosa, liver and muscle and the effect of aging was measured on fertility. The effects of aging, stage of development and in vitro culture on the heteroplasmy were measured in oocytes and embryos. Also, the effects of aging were measured in somatic and germinal tissues on total copies of mtDNA, percentage of mtDNA common deletion and the expression of three genes: Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. We observed that female fertility in the mouse colony decreases with age. Aging affected mtDNA in somatic tissues but no effect was observed in granulosa, oocytes and embryos. MtDNA deletions increased during the resumption of meiosis and decreased during early embryo development; and culture in vitro did not affect the mtDNA in most germinal tissues. Because we did not find effects of age in most mitochondrial parameters analyzed in oocytes and embryos, we suggest that mtDNA common deletion in germinal tissues is more related with the cellular status of energy production than with the process of aging.
Two different sources of mutations in the mtDNA generated in normal or reconstructed oocytes produced different heteroplasmy outcomes at the beginning of embryogenesis. In cattle, artificial heteroplasmy involving a small insertion (66 bp) in the non coding region (D-loop) of the mitochondrial DNA was apparently not harmful to the embryo, allowing persistence of the foreign mtDNA during the different stages of clonal development. In mice, the natural heteroplasmy of a large deletion (4974 bp, common deletion) in the coding region of the mtDNA was apparently harmful to the embryo and, therefore, may have been eliminated to ensure homoplasmy at the beginning of embryonic development.
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Traitement antibiotique sélectif au tarissement des vaches laitièresKabera, Fidèle 07 1900 (has links)
Le traitement sélectif (TS) des vaches laitières au tarissement (où seuls les quartiers ou les vaches infectées sont traités avec des antimicrobiens) constitue une alternative potentielle au traitement universel (TU, où tous les quartiers de toutes les vaches reçoivent des antimicrobiens, quel que soit leur statut infectieux), pour une utilisation plus judicieuse des antimicrobiens. L'objectif de cette thèse était d’apporter plus de lumière sur les décisions de traitement antimicrobien ciblant les quartiers ou vaches infecté(e)s au tarissement. Différents devis et méthodologies ont été utilisés pour répondre à cet objectif.
Un essai contrôlé randomisé a été conçu et 569 vaches (2,251 quartiers) provenant de 9 troupeaux laitiers du Québec avec un comptage de cellules somatiques (CCS) du réservoir <250 000 cellules/mL ont été systématiquement enrôlées et réparties au hasard dans 4 groupes : 1) traitement antimicrobien seul pour tous les quartiers ; 2) traitement antimicrobien combiné avec un scellant interne à trayon pour tous les quartiers ; 3) traitement antimicrobien sélectif seul basé sur les résultats de la culture bactériologique du lait sur Petrifilm® ; et 4) traitement antimicrobien sélectif combiné avec un scellant interne à trayon basé sur les résultats de la culture du lait sur Petrifilm®. Dans les groupes de TS, les quartiers non infectés n'ont reçu qu'un scellant interne à trayon. Aucune différence significative n'a été détectée entre le TS par quartier et le TU des vaches laitières au tarissement, en termes d'élimination des infections intramammaires (IIM) et de prévention de nouvelles IIM pendant la période de tarissement, de risque d'un premier cas de mammite clinique (MC), de production laitière moyenne quotidienne et de CCS au cours des 120 premiers jours de la lactation suivante. Un TS reposant sur les résultats d'une culture de lait de quartier sur Petrifilm® au tarissement a permis de réduire l'utilisation d'antimicrobiens de 52% (IC à 95%: 39 – 64) par rapport à un TU.
En plus de cet essai contrôlé randomisé, la culture du lait par quartier à l'aide de Petrifilm® a été comparée à l'historique du CCS par une estimation bayésienne de leur précision pour identifier les quartiers ou les vaches qui devraient être traités avec des antimicrobiens dans des protocoles de TS au tarissement. Compte tenu de la disponibilité des données de CCS, de la facilité d'utilisation du dernier test de CCS pré-tarissement et de la valeur prédictive négative élevée qui pourrait être obtenue, les producteurs pourraient envisager d'utiliser uniquement le dernier test de CCS pré-tarissement comme outil potentiel pour identifier les vaches qui devraient être traitées avec des antimicrobiens au tarissement. Le dernier test de CCS pré-tarissement peut être utilisé seul ou en combinaison avec la culture de lait par quartier sur Petrifilm® sur les vaches avec un CCS élevé pour identifier encore plus spécifiquement les quartiers qui doivent être traités. L'ajout d'une culture de lait par quartier à la ferme sur Petrifilm® pour les vaches identifiées comme infectées à l'aide des données du CCS améliorerait la précision du test (principalement la valeur prédictive positive) et réduirait davantage l'utilisation d'antimicrobiens.
Également, une revue systématique et une série de méta-analyses ont été menées pour étudier l'efficacité du TS par rapport au TU, afin de guider les décideurs et les utilisateurs qui s'engagent dans une utilisation plus efficace et judicieuse des antimicrobiens au moment du tarissement. Treize articles représentant 12 essais contrôlés, randomisés ou non, étaient disponibles pour les analyses. Le TS a permis de réduire de 66% (IC à 95%: 49 – 80) l'utilisation d'antimicrobiens au moment du tarissement. Les résultats appuient fortement l'idée que le TS réduirait l'utilisation d'antimicrobiens au moment du tarissement, sans effet négatif sur la santé du pis ou la production laitière au cours des premiers mois de la lactation subséquente, si, et seulement si, les scellant internes à trayons sont utilisés pour les quartiers non traités avec des antimicrobiens.
Enfin, le suivi de l'utilisation d'un scellant interne à trayon a été effectué pour déterminer la proportion de quartiers qui ont conservé le bouchon de scellant jusqu’à la première traite après le vêlage et la persistance de résidus de scellant dans le lait après le vêlage. Un bouchon de scellant était présent jusqu'à la première traite pour 83% des quartiers, et nous pourrions émettre l'hypothèse que la perte du bouchon s'est produite près du vêlage secondaire à la tétée ou pour une autre raison (ex., la pression hydrostatique du lait), étant donné que les associations observées entre la présence ou non d'un bouchon de scellant observable et les chances de nouvelles IIM étaient relativement faibles. Les résidus de scellant pouvaient être observés dans le lait jusqu'à 12 jours après le vêlage, quoique 75% des quartiers n’excrétaient plus de scellant au bout de 5 jours en lait. / Selective dry cow therapy (SDCT, in which only infected quarters or cows are treated with antimicrobials) represents an alternative to blanket dry cow therapy (BDCT, in which all quarters of all cows at dry off are treated with antimicrobials, regardless of their infection status), for a more judicious use of antimicrobials. The objective of this thesis was to shed more light on targeted antimicrobial treatment decisions of infected quarters or cows at dry-off. Different study designs and methodologies were used to meet this objective.
A randomized controlled trial was designed and a total of 569 cows (2,251 quarters) from 9 dairy herds in Québec with bulk tank somatic cell count (SCC) <250,000 cells/mL were systematically enrolled and randomly allocated to 4 groups: 1) antimicrobial treatment alone of all quarters; 2) antimicrobial treatment combined with an internal teat sealant (ITS) of all quarters; 3) selective antimicrobial treatment alone based on milk bacteriological culture results on Petrifilm®; and 4) selective antimicrobial treatment combined with an ITS based on milk culture results on Petrifilm®. In the selective antimicrobial treatment groups, uninfected quarters received only an ITS. No significant differences were detected between quarter-based selective and blanket dry cow therapies, in terms of elimination of intramammary infections (IMI) and prevention of new IMI during the dry period, risk of a first case of clinical mastitis (CM), daily average milk yield and somatic cell count in the first 120 days of the subsequent lactation. A selective antimicrobial treatment relying on results of quarter milk culture using Petrifilm® at dry off enabled a reduction in antimicrobial use of 52% (95% CI: 39 – 64) as compared to blanket dry cow treatment.
In addition to this randomized controlled trial, quarter milk culture using Petrifilm® was compared with SCC history through a Bayesian estimation of diagnostic accuracy to identify quarters or cows that should be treated with antimicrobials in selective treatment protocols at dry off. Considering the availability of SCC data, the easiness of using just the last Dairy Herd Improvement (DHI) test before dry off, and the high negative predictive value that could be achieved, producers may consider using just the last DHI test before dry off results as a potential tool to identify cows that should be treated with antimicrobials at dry off. The last SCC test before
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dry off may be used alone or in combination with quarter-level on-farm Petrifilm® milk culture on high SCC cows to more specifically identify quarters that need to be treated. Adding quarter-level milk culture using Petrifilm® to cows identified as unhealthy using cow-level SCC data could improve the test accuracy (mainly the positive predictive value) and further reduced the use of antimicrobials.
Also, a systematic review and a series of meta-analyses were conducted to investigate the efficacy of SDCT compared with BDCT, to guide decision-makers and users to engage in a more effective and judicious use of antimicrobials at dry-off. Thirteen articles representing 12 controlled trials, randomized or not, were available for analyses. SDCT reduced the use of antimicrobials at dry off by 66% (95% CI: 49 – 80). Evidences strongly support that SDCT would reduce the use of antimicrobials at dry off, without any detrimental effect on udder health or milk production during the first months of the subsequent lactation, if, and only if, ITS are used for healthy quarters untreated with antimicrobials.
Finally, a follow up on the use of ITS was performed to determine the proportion of quarters that had retained the sealant plug until the first milking after calving and the persistence of ITS residues in milk after calving. A sealant plug was present at first milking after calving for 83% of the quarters, and we could hypothesize that the loss of the plug occurred closely around calving due to suckling or for another reason (e.g., milk hydrostatic pressure), since the observed associations between the presence or not of an observable sealant plug and the odds of new IMI were relatively small. The sealant residues could be observed in milk up to 12 days in milk, although 75% of the quarters had expelled the last ITS residues by 5 days in milk.
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Impacts de l’utilisation de litière de fumier recyclé sur la santé des vaches laitières et la qualité du laitFréchette, Annie 12 1900 (has links)
La litière de fumier recyclé (LFR) est utilisée dans les fermes laitières québécoises depuis quelques années, et ce, malgré le manque de connaissances scientifiques quant aux risques reliés à l’utilisation de ce produit pour la santé des animaux. Le premier objectif de cette thèse était de décrire les méthodes de production de LFR dans un contexte québécois et les pratiques de régie associées. Le deuxième objectif du projet consistait à déterminer le potentiel de recroissance de certaines espèces bactériennes dans la LFR lorsqu’elle est contaminée. Par la suite, le niveau de propreté et la prévalence de lésions aux jarrets chez les vaches laitières exposées ou non à ce produit ont été estimés. Finalement, l’association entre l’utilisation de LFR et l’incidence de mammite sous-clinique et clinique a été évaluée.
Des études observationnelles cohorte ou transversale (selon l’objectif de recherche) ont été réalisées en 2018-2019 sur 27 fermes utilisant de la LFR et 61 fermes utilisant de la litière de paille, à titre comparatif. Les visites de fermes ont permis de constater que les méthodes utilisées pour produire de la LFR n’étaient pas standardisées et qu’elles ne permettaient pas un réel compostage de la fraction solide du fumier. Les essais de recroissance ont permis de démontrer que les différentes LFR (traitée en tas, contenant fermé ou cuve rotative) ne réagissaient pas de la même façon à une inoculation par des coliformes. La LFR de cuve rotative contenait une plus faible concentration initiale de Klebsiella spp. et a montré une croissance bactérienne significative dans les premières 24 h post-inoculation. Les LFR conditionnées dans des tas ou contenants avaient quant à elles une concentration initiale importante de Klebsiella spp. et n’ont pas démontré de croissance bactérienne significative suivant leur inoculation, ce qui suggère un effet de saturation de croissance bactérienne. Au cours de l’étude transversale, 30 vaches par troupeau, en moyenne, ont été notées à l’aide d’un score de propreté sur trois zones du corps ainsi que d’un score sur l’état des jarrets, afin d’estimer leur propreté et la présence de lésions aux jarrets. Le score de propreté attribué à chaque zone du corps des vaches allait de 1 à 4, 1 étant très propre et 4 très sale. Nous avons observé que les vaches logées sur LFR avaient, en général, une meilleure propreté du pis et du bas des pattes que celles logées sur paille. La LFR avait un effet protecteur pour le risque d’avoir un score de propreté du pis ≥ 3 (rapport de cotes (RC) : 0,43) ou d’avoir un score de 4 (RC : 0,29). Les vaches logées sur LFR avaient aussi le bas des membres plus propres que celles logées sur paille avec de plus faibles cotes d’avoir un score ≥ 2 (RC : 0,45), un score ≥ 3 (RC : 0,16) ou un score de 4 (RC : 0,07). Cependant, nous n’avons pas trouvé de différence entre les deux groupes d’animaux au niveau de la propreté du flanc et du haut des pattes. Lors de leur évaluation pour la propreté, les vaches ont aussi été notées à l’aide d’un score de lésions aux jarrets allant de 0 à 3. Un score de 0 représentait un jarret parfaitement sain alors qu’un score de 3 était attribué à un jarret présentant une enflure de plus de 2,5 cm. Les deux jarrets étaient évalués et le jarret ayant reçu le score le plus élevé était inclus dans les analyses. Nous n’avons pas identifié de différence quant aux scores de jarret entre les deux groupes d’animaux. Afin d’évaluer la santé de la glande mammaire, une étude cohorte d’une durée d’un an a été mise en place à partir de la visite de la ferme. Les dynamiques de comptages de cellules somatiques ont été suivies sur 11 031 vaches durant cette période afin d’analyser l’incidence de mammite sous-clinique. Nous n’avons pas été en mesure de détecter une différence d’incidence entre les deux groupes d’animaux. Au cours de l’étude cohorte, les producteurs laitiers ont identifié et fait parvenir au laboratoire 1 144 échantillons de lait provenant de vaches atteintes de mammites cliniques. L’incidence totale de mammite clinique n’était pas plus élevée dans les fermes LFR qu’au sein des fermes paille. Cependant, lorsque nous avons analysé l’incidence de mammite clinique par agent pathogène spécifique, nous avons pu constater que les vaches logées sur LFR étaient 7,0 fois plus à risque d’expérimenter une mammite clinique causée par Klebsiella pneumoniae que celles du groupe comparatif. / Recycled manure solids (RMS) bedding has been used on Quebec dairy farms for a number of years, despite the lack of scientific knowledge about the health risks associated with the use of this product for animals. The first objective of this thesis was to describe the RMS production methods in a Quebec context and the associated management practices. The second objective of the project was to determine the potential for regrowth of certain bacterial species in the RMS when it is contaminated. Subsequently, the level of cleanliness and prevalence of hock lesions in dairy cows exposed or not to this product were estimated. Finally, the association between RMS use and the incidence of subclinical and clinical mastitis was evaluated.
Observational cohort or cross-sectional studies (depending on the research objective) were conducted in 2018-2019 on 27 farms using RMS and 61 farms using straw bedding for comparison. The farm visits highlighted that the methods used to produce RMS were not standardized and did not allow for true composting of the manure solid fraction. The regrowth trials showed that different RMS (treated in heap, closed container or rotating drum) did not react in the same way to coliform inoculation. The rotating drum RMS contained a lower initial concentration of Klebsiella spp. and experienced significant bacterial growth in the first 24 hours post-inoculation. The heap or closed container RMS had a high initial concentration of Klebsiella spp. and did not show significant bacterial growth following inoculation, suggesting a saturation effect on bacterial growth. In the cross-sectional study, an average of 30 cows were measured using a cleanliness score on three body areas as well as a hock lesion score to estimate their cleanliness and the presence of hock lesions. The cleanliness score assigned to each area of the cows' body ranged from 1 to 4, with 1 being very clean and 4 being very dirty. We found that cows housed on RMS generally had better udder and lower leg cleanliness than those housed on straw. Recycled manure solids bedding had a protective effect for the risk of having an udder cleanliness score ≥ 3 (odds ratio (OR): 0,43) or having a score of 4 (OR: 0,29). Cows housed on RMS also had cleaner lower legs than those housed on straw with lower odds of having a score ≥ 2 (OR: 0,45), a score ≥ 3 (OR: 0,16) or a score of 4 (OR: 0,07). However, we found no difference between the two groups of animals in flank and upper leg cleanliness. When they were evaluated for cleanliness, cows were also measured using a hock lesion score ranging from 0 to 3. A score of 0 represented a perfectly healthy hock, while a score of 3 was assigned to a hock with swelling greater than 2.5 cm. Both hocks were scored and the hock with the higher score was included in the analyses. We did not identify any difference regarding hock lesions between the two groups of animals. To assess mammary gland health, a one-year cohort study was set up from the farm visit. Somatic cell count dynamics were followed on 11 031 cows during this period to analyze the incidence of subclinical mastitis. We were not able to detect a difference in incidence between the two groups of animals. During the cohort study, dairy farmers identified and sent to the laboratory 1 144 milk samples from cows with clinical mastitis. The total incidence of clinical mastitis was not higher on RMS farms than on straw farms. However, when we analyzed the incidence of clinical mastitis by specific pathogen, we found that cows housed on RMS were 7.0 times more likely to experience clinical mastitis caused by Klebsiella pneumoniae than those in the comparison group.
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