京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第18703号 / 生博第322号 / 新制||生||43(附属図書館) / 31636 / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 豊島 文子, 教授 西田 栄介, 教授 松本 智裕 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Chromosomal Instability (CIN) occurs in over 90% of all sporadic tumors and manifests as whole chromosome loss or gain, gene deletions, amplifications, inversion, and translocations. CIN is not only a hallmark of cancer but promotes tumorigenesis. CIN is caused by errors during mitosis and one major CIN-promoting mechanism is centrosome over-duplication (amplification); another cancer hallmark. Centrosome amplification causes abnormal mitotic spindle assembly, directly promoting chromosome mis-segration with consequent aneuploidy and other forms of CIN. Central to controlling centrosome numbers and function are the Polo kinases, including Polo-like kinase 4 (Plk4). Plk4 is a component of centrosomes and recognized as the master-regulator of centrosome function and duplication. Plk4 is a mitotic kinase whose levels increase throughout S-phase and G2 to peak in mitosis. During late mitosis, Plk4 localizes to a spot on parent centrioles, licensing this single site for future daughter centriole assembly. Plk4 activity initiates the hierarchial recruiment of two conserved essential centriole proteins: Ana2, followed by the cartwheel protein Sas6. By analysis in a yeast-2-hybrid screen, we identified several novel interactions of centriole proteins, including the interaction of Ana2 and Plk4. Plk4 phosphorylates Ana2 to both positively and negatively regulate centriole duplication. Our preliminary data suggests that Plk4 recruits Ana2 by phosphorylating a protein on the outer centriole surface, generating a phospho-landing platform, and that this Plk4 target is Sas4 (CPAP in humans). Notably, the Sas4 pattern on centrioles is complex, forming both a ring and an asymmetric spot during mitotic progression. Like Sas4, Ana2 is a Plk4 substrate, and when mixed with purified Ana2, Sas4 stimulates Ana2 hyperphosphorylation in vitro. Thus, Plk4 influences centriole assembly on multiple platforms.

Pericentriolar satellites (PS) are electron dense granules surrounding the centrosome, the major microtubule-organizing centre in eukaryotic cells. In cycling cells the centrosome promotes spindle assembly and the faithful execution of mitosis. In non-cycling cells it is involved in forming the cilium, a plasma membrane-resident organelle, which mediates crucial signalling pathways in development and tissue homeostasis. PS are thought to contribute to centrosome formation, through the microtubule-dependent transport of centrosome components, and they are involved in ciliogenesis and stress response. Moreover, several proteins that localize to PS are mutated in human ciliopathies and neurodevelopmental disorders. The precise roles of PS in the various molecular pathways and diseases are however poorly understood, in part due to the limited knowledge of their composition. In the first part of my study I performed a comprehensive analysis of the pericentriolar satellite proteome. This was achieved by sucrose sedimentation of PS, combined with affinity purification of a key PS component, PCM1. To eliminate contamination by centrosomes, the PS proteome was determined from wild-type cells as well as from two cell lines genetically engineered to lack centrosomes. Mass spectrometry identified 170 PS components including most of the previously described PS proteins, confirming the validity of the approach. Having determined the proteomic composition of PS from DT40 cells, I then performed validation studies both in chicken and human cell lines. In the second part of my study, I aimed to use the list of PS proteins to uncover new biological roles for pericentriolar satellites. I devised two distinct approaches to gain functional insights. First, I generated a cell line lacking PCM1 as a tool to study the role(s) of PS and PS components. Second, I performed loss-of-function studies on a set of new PS proteins to determine their function(s) in maintaining the canonical PS distribution and in forming primary cilia.

Les cils et les flagelles sont des organites conservés chez les eucaryotes où ils jouent des rôles essentiels et variés comme la motilité et la signalisation cellulaire. La zone de transition (ZT) est une structure complexe, localisée à la base des cils, indispensable à leur assemblage et pour la sélection des constituants ciliaires. Chez l'Homme, de nombreuses pathologies appelées ciliopathies sont associées à des défauts d'assemblage ou de fonctionnement des cils. Les plus sévères sont liées à des défauts de protéines de la ZT. Cette dernière est composée principalement de trois complexes protéiques nommés MKS, NPHP et CEP290 interagissant étroitement entre eux. D'autres protéines, dont CBY conservée des mammifères à la drosophile, s'ajoutent à ces modules mais leur interconnections ne sont pas connues Deux modes d'assemblage ciliaire ont été décrits : la ciliogenèse compartimentée et cytosolique. La fonction de la ZT au cours de la ciliogenèse compartimentée a fait l'objet de nombreuses études mais son rôle dans la ciliogenèse cytosolique reste peu connu. Au cours de ma thèse j'ai analysé la fonction de nouvelles protéines de la ZT en utilisant le modèle de la drosophile qui présente les 2 types de ciliogenèse. J'ai d'une part réalisé un crible protéomique en cellules murine IMCD3 et caractérisé le module protéique CBY, composé de CBY, FAM92A et DZIP1L. Ce module est conservé chez la drosophile à la ZT. Il est nécessaire à la ciliogenèse notamment pour l'assemblage de la ZT et pour l'ancrage du corps basal à la membrane plasmique. L'absence de ces protéines entraine des défauts ciliaires importants dans l'assemblage des flagelles de spermatozoïde et des cils des neurones sensoriels chez les drosophiles.En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l'assemblage de la ZT et sur le rôle de CBY dans les mécanismes qui contrôlent la ciliogenèse / Cilia and flagella are highly conserved organelles among eukaryotes species. They are composed of a microtubular cytoskeleton and play essential functions during development and in numerous physiological processes. As a result, in humans, cilia dysfunction leads to a wide range of pathologies, called ciliopathies.At the ciliary base, the transition zone (TZ), a complex structure, is required for proper cilia assembly and regulates the traffic of ciliary components in and out cilia. Defects in TZ proteins lead to severe ciliopathies. The TZ is composed of 3 protein complexes, MKS, NPHP et CEP290 that closely interact. Additional proteins, like CBY, conserved between mammals and Drosophila, have been described at the TZ but their precise role and relationships with the other TZ complexes are unknown. Two modes of cilia assembly have been described: compartmentalized and cytosolic ciliogenesis. Whereas the function of the TZ in compartmentalized ciliogenesis is well documented, its role in cytosolic ciliogenesis remains poorly characterized. During my PhD, I characterized new TZ proteins conserved in mammals and Drosophila and analyzed their function during cilia assembly in Drosophila. First, I performed a proteomic screen in murine IMCD3 cells and characterized the CBY module composed of CBY, FAM92A1 and DZIP1L. This complex is conserved in Drosophila and locates at the TZ. Moreover, I showed that this module is necessary for TZ assembly and centriolar docking to the plasma membrane and hence required for cilia and flagella assembly. In absence of these proteins, Drosophila show severe ciliogenesis defects both in sperm cells and in sensory neurons.In conclusion, this work brings new insights into the understanding of TZ assembly and of the mechanisms, that control ciliogenesis

La nucléoline est une des protéines les plus abondantes des nucléoles. Ses fonctions ne sont cependant pas restreintes à la biogénèse des ribosomes. En absence de nucléoline, un phénotype d’amplification du nombre de centrosomes en mitose, associé à des fuseaux multipolaires a été récemment rapporté. Notre étude vise à comprendre l’implication de la nucléoline dans l’apparition de ce phénotype et notamment ses conséquences sur l’organisation des microtubules.Par immunofluorescence, nous mettons en évidence que la fraction centrosomale de la nucléoline est spécifiquement associée au centriole mature en interphase, alors qu’en mitose seule une forme phosphorylée y est détectée.En interphase, les cellules déplétées en nucleoline présentent une amplification de leurs centrioles immatures, entourés par un réseau anormal de péricentrine, dénotant une perte de structuration de la matrice péricentriolaire. De plus, une désorientation du réseau microtubulaire causée par une capacité de nucléation ralentie et une perte d’ancrage des microtubules au centrosome mature est observée. Par des expériences de co-immunoprécipitation avec la tubuline γ, un lien avec le complexe d’initiation de la nucléation des microtubules est dévoilé.En conclusion, les résultats de ma thèse révèlent que structurellement la nucléoline est associée au centriole mature des cellules en interphase et que fonctionnellement elle stimule la nucléation des microtubules et participe à leur ancrage au centrosome mature pour orienter le réseau microtubulaire en interphase. La nucléoline pourrait ainsi être un des acteurs de la synchronicité entre centrosomes et nucléoles pour la régulation du cycle cellulaire. / Nucleolin is an abundant non-ribosomal protein of the nucleolus. Nevertheless its functions are not restricted to ribosome biogenesis. Without nucleolin, a phenotype of abnormally high centrosome numbers was recently reported in mitosis, associated with multipolar spindle formation. The purpose of our study is to understand nucleolin’s involvement in the appearance of this phenotype and specifically consequences on microtubule network organisation. By immunofluorescence, visual evidences of a centrosomal fraction of nucleolin are provided, specifically associated with the mature centriole of interphase cells. In mitosis, only a phosphorylated form of nucleolin is detected at the spindle poles.In interphase, nucleolin depleted cells exhibit immature centriole amplification surrounded by an abnormal mesh of pericentrine, showing a loss of pericentriolar matrix structuration. Furthermore, in most nucleolin depleted cells, a complete disorganisation of microtubule network is observed, caused by a slower microtubule nucleation capacity and a loss of microtubule anchoring at the mature centriole. Using co-immunoprecipitation with γ-tubulin, a major centrosomal protein, a link with the microtubule nucleation complex was highlighted.Taken together my thesis results reveal that in interphase cells, nucleolin is structurally associated with the mature centriole, and functionally stimulates microtubule nucleation and participates in their anchoring at the mature centrosome to orient microtubule network. Thus, nucleolin could be a major actor in the synchronicity between centrosome and nucleoli for cell cycle regulation.

Le centrosome est le centre organisateur des microtubules dans les cellules animales, il nucléé les microtubules interphasiques ainsi que le fuseau mitotique. Les centrosomes sont produits par duplication, mécanisme rigoureusement régulé au cours du cycle cellulaire. En effet, un centrosome comporte deux centrioles qui se dupliquent une fois par cycle cellulaire. Des erreurs de duplication conduisant à plus de deux centrosomes induisent la formation de fuseaux multipolaires et provoquent des défauts de ségrégation des chromosomes. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, un organisme modèle pour l’étude de la division cellulaire, les homologues des centrosomes sont les SPBs (pour Spindle Pole Body). Une structure annexe spécifique liée aux SPBs est appelée demi-pont (quand les SPBs ne sont pas dupliqués) puis pont (quand elle relie les deux SPBs dupliqués). Les deux principaux composants du pont chez la levure S. pombe sont Cdc31 et Sfi1. Sfi1 est une protéine linéaire formée de répétitions en hélice α formant des sites de liaison pour la Centrine/Cdc31. Sfi1 s’assemble en réseau de molécules parallèles interagissant avec le SPB via leur domaine N-terminal. Lors de la première partie de ma thèse, j’ai démontré que Sfi1 est requis pour la duplication et la séparation des deux SPBs. Dans la première partie de ma thèse, je me suis intéressée aux fonctions de Sfi1 chez la levure. Cette étude a permis de démontrer que Sfi1 est un composant du demi-pont et qu’il est essentiel pour la duplication des SPBs et l’assemblage d’un fuseau bipolaire. De plus, nous avons déterminé que le pont est dupliqué en fin de mitose. Enfin, nous avons aussi montré que la déstabilisation du pont menant à sa rupture en mitose, dépend de la phosphorylation de Cdc31 par la kinase mitotique Cdk1. Lors de la seconde partie de ma thèse, je me suis intéressée au complexe Sfi1/Centrine dans les cellules humaines. J’ai confirmé que Sfi1 est localisée aux centrioles. De plus, j’ai montré que la déplétion de Sfi1 dans les cellules RPE1, conduit à une perte de localisation de la Centrine, suggérant soit un défaut de recrutement, soit une déstabilisation. De plus, en absence de Sfi1, les cellules RPE1 ne sont plus capables de former de cil primaire. Ce résultat suggère que Sfi1 et la Centrine sont requis pour la ciliogénèse. Enfin, j’ai aussi démontré que la déplétion deSfi1 induit un arrêt de cycle cellulaire dans les cellules non tumorales RPE1. Dans les cellules cancéreuses, HeLa, le cycle n’est pas arrêté mais j’ai pu observer une prolongation du temps de mitose. En conclusion mes travaux montrent que bien que la fonction de Sfi1/Centrin ne soit pas conservée, le complexe reste essentiel pour l’intégrité structurale et fonctionnelle du centrosome. / The centrosome is the main microtubule organizing center. It nucleates and organizes interphase microtubule and contributes to the assembly of the bipolar mitotic spindle. To do so, the centrosome, present in one copy at the beginning of the cell cycle, duplicates to produce a second copy. The duplication process is tightly controlled and regulated since centrosome over-duplication can lead to multipolar mitotic spindles and promote genome instability and tumorigenesis. The duplication of the yeast centrosome, the SPB (Spindle pole body), begins with the duplication of the half bridge. This appendage is composed of Sfi1/Cdc31 complex organized in a parallel array attached to the core SPB. SPB duplication relies on the assembly of a second array of Sfi1/Cdc31, anti-parallel to the first one, creating thereby an assembly site for the new SPB. Therefore Sfi1 is essential for SPB duplication and our work defined the timing of half-bridge duplication and some of the regulatory mechanisms that favor bridge splitting to release duplicated centrosomes and allow spindle assembly at mitotic onset. Sfi1 and Cdc31/Centrins are conserved in human cells where the centrosome is composed of two centrioles surrounded by the pericentriolar material. Centrins are concentrated in the distal end of centrioles. Sfi1 has also been localized to centrioles, but its function remained unknown. Thus, we started investigating Sfi1 function in human cells. We found that Sfi1 depletion leads to a decrease in Centrin recruitment to the centrioles. It also leads to a cell cycle arrest in G1 in RPE1 cells, an event previously observed in presence of defects in centriole biogenesis. In HeLa cells where the cell cycle is not affected, Sfi1 depletion leads to a mitotic delay. Moreover, Sfi1 depletion leads to cilium assembly. To conclude, these results altogether point towards a role of human Sfi1 in centriole biogenesis.

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Les cellules multiciliées jouent un rôle essentiel dans la propulsion des fluides physiologiques. Leur dysfonctionnement provoque des maladies chroniques. Contrairement à la plupart des cellules de mammifères qui possèdent un centrosome composé de deux centrioles, les cellules multiciliées possèdent une centaine de centrioles qui servent de base à la nucléation des cils motiles. Les mécanismes d'amplification de centrioles ou de régulation du nombre de centrioles dans ce type cellulaire étaient jusque-là inconnus. Les centrioles nouvellement formés étaient considérés comme apparaissant " de novo ". Une approche de vidéomicroscopie et de microscopie de super-résolution corrélative nous a d'abord permis de déterminer que tous les procentrioles sont générés à partir du centrosome préexistant. Nous démontrons que le centriole fils du centrosome est le site principal de nucléation de 95% de centrioles nouvellement formés dans les cellules multiciliées. Ces résultats réfutent par conséquent l'origine " de novo " des centrioles dans ce type cellulaire. Puis, nous montrons que la machinerie mitotique orchestre la progression spatio-temporelle de la dynamique centriolaire dans ces cellules post-mitotiques et en phase terminale de différentiation. L'amortissement de l'activité de Cdk1 empêche la rentrée en mitose tout en permettant la coordination du nombre de centrioles, leur croissance, et leur désengagement par des transitions phasiques nécessaires à la nucléation de cils motiles. Cette thèse aide à mieux comprendre la différentiation des cellules multiciliées, les ciliopathies, ainsi que l'amplification centriolaire pathologique associée avec le cancer et la microcéphalie. / Multiciliated mammalian cells play a crucial role in the propulsion of physiological fluids. Their dysfunction causes severe chronic diseases. In contrast to the strict centriole number control in cycling cells, multiciliated cell differentiation is marked by the production of up to several hundred centrioles, each nucleating a motile cilium. The mechanisms of centriole amplification or centriole number control in these cells were unknown and new centrioles were thought to appear de novo in the cytoplasm. First, videomicroscopy combined with correlative super-resolution and electron microscopy has enabled us to determine that all procentrioles are generated via runs of nucleation from the pre-existing progenitor cell centrosome. We show that the daughter centriole of the centrosome is the primary nucleation site for 95% of the new centrioles in multiciliated cells and thus refute the de novo hypothesis. Then, we provide evidence of an activation of the mitosis regulatory network during the centriole dynamic. With single cell live imaging and pharmacological modulation of mitosis regulators, we show that the mitosis machinery orchestrates the spatiotemporal progression of centriole amplification in terminally differentiating multiciliated cell progenitors. The fine-tuning of Cdk1 activity prevents mitosis while allowing the timely coordination of centriole number, growth, and disengagement through checkpoint-like phase transitions necessary for subsequent functional motile ciliation. This PhD provides a new paradigm for studying multiciliated cell differentiation, cilia-related diseases and pathological centriole amplification associated with cancer and microcephaly.

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