O presente estudo visou determinar a prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de produzem b-lactamases de amplo espectro (ESBL) e resistência adquirida a quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR) em animais de estimação, investigando o potencial papel destes hospedeiros como portadores assintomáticos. Em 2012, foram coletadas 216 amostras (fezes e saliva) de 108 animais de companhia (29 gatos e 79 cães) abrigados em casas de família, um centro de acolhimento de animais abandonados, e no Centro de Controle de Zoonoses da Cidade de São Paulo. Do total de cepas estudadas, 85% apresentaram fenótipo sugestivo de PMQR; enquanto que 62% dos isolados exibiram um fenótipo característico e sugestivo para produção de ESBL, sendo na sua maioria identificadas como E. coli. Dentre os isolados, 14 carregaram variantes do gene blaCTX-M, 9 foram positivos para o gene blaTEM, e 6 foram positivos para blaSHV. Em relação às cepas resistentes às Q/FQ, 56% (n= 43) foram positivas para a presença do gene qnr, o qual foi identificado em 11 espécies diferentes. Os resultados apresentados demostram que animais de companhia podem ser portadores assintomáticos de cepas produtoras de ESBL e PMQR. / The present study aimed to determine the prevalence of Gram-negative bacteria producing b-lactamases producing broad-spectrum (ESBL) and acquired resistance to quinolones mediated by plasmids (PMQR) in pets, investigating the potential role of these hosts as asymptomatic carriers. In 2012, 216 samples (feces and saliva) of 108 companion animals (29 cats and 79 dogs) housed in shelters or a Zoonosis Control Center were collected from São Paulo city. Of the total strains studied, 85% had a phenotype suggestive for PMQR; while 62 % of the isolates exhibited a characteristic phenotype and suggestive for ESBL-producing genes, with the most identified as E. coli. Among the isolates, 14 carried variants blaCTX -M gene 9 were positive for blaTEM gene, and 6 were positive for blaSHV. Regarding resistant Q/FQ isolates, 56% (n = 43) were positive for the presence of qnr gene, which was identified on 11 different species. The results presented demonstrate that pets can be asymptomatic carriers of ESBL producing strains and PMQR.

Metallohydrolases with dinuclear-zinc active sites perform many important biological hydrolytic reactions on a variety of substrates. In this regard, metallo-β-lactamases (mβ1, class B) represent a unique subset of zine hydrolases that hydrolyze the β-lactam ring in several antibiotics. The antibiotic resistance that results from this hydrolysis is becoming an increased threat for the clinical community. These metalloenzymes can hydrolyze a wide range of β-lactam substrates, such as cephamycins and imipenem that are generally resistant t the serine-containing β-lactamases. Therefore, the clinical application of the entire range of antibiotics is severely compromised in bacteria that produce mβls. Due to the lack of information on the mechanism of mβls, to-date, no clinically known inhibitors is there for mβls. In this present study, we synthesized several mono and dizinc complexes as models for the mβls and investigated the differences in their hydrolytic properties. This study supports the assumption that the second zinc in the dinuclear enzymes does not directly involve in the catalysis, but may orient the substrates for hydrolysis and the basic amino acid residues such as Asp and His may activate the zinc-bound water molecules, fulfilling the role of the second zinc in the mononuclear enzymes. The effect of various side chains on the hydrolysis of some commonly used cephalosporin antibiotics by mβl from B.cereus is described. It is shown that the cephalosporins having heterocyclic thiol side chains are more resistance to mβl-mediated hydrolysis than the antibiotics that do not have such side chains. This is partly due to the inhibition of enzyme activity by the thiol moieties eliminated during the hydrolysis. It is also observed that the heterocyclic side chains in pure form inhibit the lactamase activity of mβl as well as its synthetic mimics. The mode of binding of these heterocyclic side chains to the zinc has been analyzed from the crystal structure of the tetranuclear zinc complexes. The theoretical studies suggest that the eliminated heterocyclic thiols undergo a rapid tautomerism to produce the corresponding thiones. These thiones are found to irreversibly inhibit the LPO-catalyzed iodination reaction. The reaction of various thiones with I2 leads to the formation of thione-iodine complexes similar to that of the most commonly used antithyroid drug methimazole(MMI). These observations suggest that some of the latest generation of antibiotics may show negative effects on thyroid gland upon hydrolysis. Synthetic organophosphorus compounds have been used extensively as pesticides and petroleum additives. These compounds are very toxic to mammals and their widespread use in agriculture leads to serious environmental problems. Therfore, degradation of organophosphorus trimesters and remediation of associated contaminated sites are of worldwide concern. In this regards, the bacterial phsophotriesterase (PTE) enzyme plays an important role in degrading a wide range of organophosphorus esters and the active side of PTE has been shown to be very similar to that of mβl. This identification prompted us to check the hydrolysis of phosphotriesters by the mβl and its mimics. It has been observed that the dinuclear zine(II) complexes that do not allow a strong binding of phosphodiestes would be a better PTE mimics.

[Truncated abstract] The prinicipal aim of this thesis was to explore the relationship between 3rd generation cephalosporin antibiotics and hospital-acquired Clostridium difficile-associated diarrhoea (CDAD). This antibiotic class has been implicated in the aetiology of CDAD; therefore restriction of these antibiotics via antibiotic policies represents a potential strategy for prevention and control of CDAD. Successful control of CDAD in hospitals translates to improved quality of care for patients, and a reduction of pressure on hospital resources. Therefore, the objectives of this study were to determine whether 3rd generation cephalosporins were related to CDAD, to evaluate the effect of changes to antibiotic policy on the incidence of CDAD, and to determine the impact of CDAD on patient length of stay and hospital costs. The study was conducted in Sir Charles Gairdner Hospital (SCGH), a public teaching hospital located in Perth, the capital city of the state of Western Australia. Evidence for an association between 3rd generation cephalosporins and CDAD was obtained from studies of ecologic- and individual-level data. A time series analysis of the relationship between monthly consumption of 3rd generation cephalosporins and the incidence of CDAD in SCGH was undertaken covering the period 1994 to 2000. The results demonstrated a positive relationship between the use of 3rd generation cephalosporins and CDAD. A matched case-control study that involved 193 adult inpatients diagnosed with CDAD and 386 adult inpatients without CDAD, selected from the period 1996 to 2000, was conducted. Information was collected on exposure to 3rd generation cephalosporin antibiotics during hospitalisation, as well as exposure to other antibiotics and medications, procedures, and comorbidities. Results from conditional logistic regression analyses found CDAD cases were six times more likely to be exposed to 3rd generation cephalosporins during their admission, prior to the onset of diarrhoea, than controls (adjusted odds ratio [OR] = 6.17, 95% confidence interval [CI] = 1.56-24.37). Approximately one third of CDAD in the study population could be attributed to 3rd generation cephalosporins. CDAD cases were also four times more likely to have been exposed to either amoxicillin-clavulanate or ticarcillin-clavulanate (adjusted OR=4.23, 95% CI=1.81-9.93). In October 1998, an antibiotic policy was introduced at SCGH that restricted the use of ceftriaxone, the 3rd generation cephalosporin most commonly used by the hospital. During 1999 and 2000, the incidence of CDAD halved as ceftriaxone consumption fell in response to this policy. The effect of this policy was demonstrated in the time series model; during the post-policy period the relationship between ceftriaxone and CDAD that was evident prior to the policy was cancelled out. From the individual-level data, obtained from the case-control study, a reduction in the prevalence of exposure to 3rd generation cephalosporins from 11% to 1% accounted for a 30% reduction in the incidence of CDAD. Data from the case-control study was also used to analyse the independent contribution of CDAD to length of stay and admission costs using multiple linear regression

Antibiotika sind für die Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten in der Human- und Veterinärmedizin von immenser Bedeutung. Angesichts der Korrelation zwischen Antibiotika-Einsatzmengen und der Häufigkeit resistenter Organismen ist eine unsachgemäße bzw. übermäßige Verwendung dieser antibakteriellen Wirkstoffe sowie deren Eintrag über die Kläranlagen in die Umwelt äußerst problematisch. Neben Vermeidungs- und Verminderungsstrategien besteht ein Ansatz zur Problemlösung in der Entwicklung innovativer Technologien zur Entfernung von Antibiotikarückständen aus Wässern, da konventionelle Kläranlagen dieser Anforderung nicht vollständig genügen. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und charakterisierte biologische Verfahren basiert auf genetisch modifizierten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, welche spezielle Enzyme sezernieren, die zur Umsetzung von Antibiotika herangezogen werden können. Als Modellsystem diente die enzymatische Hydrolyse des β-Lactam-Antibiotikums Ampicillin mit der β-Lactamase TEM-1. Unter Verwendung von enzymhaltigen Hefe-Kulturüberständen gelang es, die grundsätzliche Eignung des Systems zur Entfernung dieses Antibiotikums nachzuweisen. Untersuchungen mit weiteren β-Lactam-Antibiotika zeigten in Übereinstimmung mit der Literatur, dass TEM-1 Penicilline und Cephalosporine der 1. Generation hydrolysieren kann. Am Beispiel der TEM-8 wurde die Übertragbarkeit des Expressionssystems auf andere Lactamase-Varianten erfolgreich demonstriert. Das erweiterte Wirkspektrum dieses Enzyms, welches neben Penicillinen auch Monobactame und Cephalosporine bis zur 4. Generation umfasst, konnte bestätigt werden. Eine mittels Histidin-tag gereinigte TEM-1-His wurde eingesetzt, um systematisch den Einfluss verschiedener Faktoren, wie Temperatur, Substratkonzentration oder pH-Wert, unbeeinflusst von der Matrix der Hefe-Kulturüberstände untersuchen zu können. In diesem Zusammenhang wurde auch die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Modell- auf Realwässer, wie Kläranlagenzu- und -ablauf, untersucht, mit dem Ergebnis, dass zumindest die TEM-1 temporär in allen getesteten Matrices aktiv ist. Mit dem Ziel, auch weitere Antibiotikaklassen transformieren zu können, wurden Esterase Ere-A-produzierende Zellen zur Umsetzung von Makrolid-Antibiotika, wie Erythromycin, herangezogen. Die Analyse der gebildeten Transformationsprodukte ergab, dass die antibakterielle Wirkung jeweils durch hydrolytische Spaltung des β-Lactam- bzw. des Makrolid-Ringes irreversibel verloren geht. Somit kann dieses biologische Verfahren prinzipiell zur gezielten Inaktivierung von Antibiotika eingesetzt werden, wobei der größte Vorteil in der erheblichen Beschleunigung der natürlicherweise ablaufenden Umsetzungsprozesse besteht. Diese Methode kann als ergänzende Technologie bei der Aufbereitung von Konzentraten und Wässern aus Spezialanwendungen angewendet werden.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung / Antibiotics play an important role in human and veterinary medicine for the treatment of bacterial infectious diseases. However, regarding the known correlation between the quantities of antibiotics applied and the frequency of resistant organisms, the improper and excessive use of these antibacterial agents leads to serious problems. Their presence in the environment is largely caused by sewage systems due to their incomplete removal in conventional wastewater treatment plants. Therefore, besides avoidance and reduction strategies, one approach to address this issue is to develop innovative technologies for the removal of antibiotic residues from water. The biological method developed and characterized within this work is based on genetically modified Saccharomyces cerevisiae cells, which secrete special enzymes that can be used for the transformation of antibiotics. The enzymatic hydrolysis of the β-lactam-antibiotic ampicillin by the β-lactamase TEM-1 was employed as a model system. By using enzyme-containing yeast culture supernatants, it was possible to prove the suitability of the developed system for the removal of the mentioned antibiotic. The obtained results with other β-lactam-antibiotics showed in accordance with the literature, that TEM-1 was able to hydrolyse penicillins and the cephalosporins of the first-generation. Taking TEM-8 as an example, the transferability of this expression system to alternative lactamase was successfully demonstrated. The activity of this enzyme toward an extended substrate spectrum, which includes not only penicillins but also monobactams and cephalosporins up to the fourth-generation, could be confirmed. The histidine-tagged purified TEM-1-His was used to systematically investigate the influence of various factors, such as temperature, substrate concentration or pH value, independently from the matrix of the yeast culture supernatants. Furthermore, the transferability of the results from model to real water (e. g. influent and effluent from a sewage treatment plant) was investigated with the result that TEM-1 was at least temporarily active in all tested matrices. In order to be able to transform other classes of antibiotics, esterase Ere-A-producing cells were employed to transform macrolide antibiotics, such as erythromycin. The analysis of the formed transformation products revealed that the antibacterial activity is irreversibly lost by the hydrolytic cleavage of the β-lactam or macrolide ring. Therefore, the biological process can be generally used for the selective inactivation of antibiotics, affording a considerable acceleration of the naturally occurring transformation process as its greatest advantage. This method is considered to be a complementary technology for the treatment of concentrates and water from special applications.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung