Este estudo foi elaborado com o objetivo de elucidar os mecanismos de resistência às quinolonas presentes em enterobactérias isoladas de pacientes de duas regiões metropolitanas brasileiras. Foram avaliadas possíveis alterações nas proteínas relacionadas com o sítio de ação das quinolonas, bem como a presença de plasmídeos e integrons que carregam determinantes gênicos que codificam resistência às quinolonas. A associação destes com mecanismos plasmideais de resistência aos antibióticos -lactâmicos também foi analisada. Foram avaliadas 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico isoladas de pacientes hospitalizados e da comunidade no período de 2000 a 2005. Por PCR e seqüenciamento, foram analisadas as mutações presentes nos genes cromossômicos gyrA e parC e as estruturas gênicas associadas com determinantes plasmideais de resistência às quinolonas, Qnr, e aos -lactâmicos de amplo espectro. Foram determinados os perfis plasmideais e a transferabilidade dos plasmídeos que carrearam estes determinantes. A extração e a análise das proteínas de membrana externa foi realizada para avaliar uma possível perda ou diminuição da expressão de porinas, também relacionada com os mecanismos de resistência avaliados. Todas as amostras foram resistentes ao ácido nalidíxico, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) superior a 16 g/mL, e em média, 70% apresentaram diminuição de sensibilidade às fluoroquinolonas testadas. De 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico, em seis enterobactérias (2,3%), incluindo 3 E. coli, 2 K. pneumoniae e 1 C. freundii foi encontrado o gene qnrB. Cinco linhagens apresentaram suas seqüências idênticas ao gene qnrB2, e uma linhagem, C. freundii JF79, apresentou uma seqüência idêntica ao gene qnrB8. Em uma linhagem de E. cloacae foi detectado o gene qnrA1 (0,37%). Os genes qnrA e qnrB apresentaram-se localizados em plasmídeos que apresentaram de 55 a 180 kilobases. A análise da estrutura gênica indicou que os genes qnrA1 e qnrB2 estavam associados com um integron classe 1 e localizados entre o elemento ISCR1 e a segunda cópia do segmento conservado 3. Na coleção bacteriana avaliada, as principais mutações observadas foram nos códons 83 e 87 em gyrA, e nos códons 80 e 84 em parC. Todas as enterobactérias que exibiram unicamente mutações no gene gyrA apresentaram CIM 16 µg/mL para o ácido nalidíxico. A diferença encontrada nos valores da CIM de fluoroquinolonas em enterobactérias que apresentaram as mesmas substituições em GyrA e ParC foi explicada pela ausência ou diminuição da expressão de porinas. Em relação à produção de -lactamase de espectro ampliado (ESBL), sua presença foi comprovada em 24 (9,3%) enterobactérias. O seqüenciamento de blaCTX-M identificou 18 determinantes: CTX-M-2 (n=13), incluindo dois novos variantes, CTX-M-8 (n=2) e CTX-M-9 (n=3) mediados por plasmídeos de 48 a 180 kilobases, não conjugativos, em maioria. O gene blaSHV-5 foi detectado em seis enterobactérias. Todos os determinantes do grupo 2 apresentaram-se associados com um elemento ISCR1, enquanto que aqueles do grupo 9 estiveram relacionados com ISEcp1. Concluindo, o principal mecanismo de resistência às quinolonas detectado foi a presença de substituições em GyrA e ParC, apesar de outros mecanismos, como a diminuição da expressão de porinas estarem envolvidos nas enterobactérias avaliadas. A associação da produção de ESBL foi significativa devido ao encontro de uma grande diversidade de genótipos circulando na comunidade, com uma predominância de enterobactérias produtoras de CTX-M. Quanto aos determinantes Qnr descritos neste estudo, que notoriamente foram os primeiros relatos no Brasil, somente dois deles apresentaram-se relacionados com a produção de ESBL. / The aim of this study was to investigate the main mechanisms of quinolone resistance among enterobacterial isolates recovered from hospitalized patients and outpatients in Brazil. The modification of the quinolone targets with changes of DNA gyrase and of topoisomerase IV genes and the presence of determinants codifying plasmid- mediated quinolone and oxymino- cephalosporins resistance were investigated. Two hundred fifty seven non-duplicate nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates recovered from January 2000 to May 2005 were analysed. Mutations in the topoisomerases gyrA and parC genes and the genetic structures surrounding Qnr and CTX-M determinants were recognized by PCR and sequencing. Conjugation experiments were performed to determine whether the qnr- and blaCTX-M carrying plasmids were self transferable. Also, decrease in the level of porin expression related to quinolone resistance was assessed. All enterobacterial isolates were resistant to nalidixic-acid, showing minimal inhibitory concentrations (MIC) 16 g/mL and 70% of these isolates showed decreased susceptibility to fluoroquinolone. Six qnrB-positive (2.3%) out of 257 nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates, were identified, including 3 Escherichia coli, 2 Klebsiella pneumoniae and 1 Citrobacter freundii. Five isolates had an identical qnrB2 sequence and one isolate, C. freundii 79, possessed the qnrB8. A single Enterobacter cloacae carrying a plasmid encoding qnrA gene was identified (0.37%). All isolates were negative for the qnrS genes. Plasmid-mediated quinolone resistance ranged from 55- to 180-kb in size. Sequence analysis of the genetic structures surrounding of the qnrA and qnrB genes identified an ISCR1 element at the left-hand boundary and a partial copy of the 3-end segment of class 1 integrons. Concerning the changes of DNA gyrase and topoisomerase IV, the most common modification in the enterobacterial isolates analyzed were present at codons 83 and 87 in GyrA and in ParC at codons 80 and 84. All isolates that exhibited mutations in gyrA gene showed nalidixic-acid MIC 16 µg/mL. The finding of different MIC values to fluoroquinolones in enterobacterial isolates with the same GyrA and ParC modification was explained by a decreasing in the level of porin expression. Regarding -lactam resistance mechanisms, twenty four (9.3%) ESBL-producing enterobacterial isolates were detected. Sequencing of the CTX-M-encoding genes identified 18 determinants belonging to CTX-M-2 (n=13), CTX-M-8 (n=2) and CTX-M-9 (n=3) groups. CTX-M-2 group determinants included blaCTX-M-2 and the two novel variants. Plasmids harboring blaCTX-M genes ranged from 48- to 180- kb in size and were not transferable, in their majority. The blaSHV-5 genes were detected in all the 6 blaCTX-M negative isolates. All alleles belonging to the group 2 were associated with ISCR1 element, while all blaCTX-M-9 genes were related to ISEcp1 element. In conclusion, alterations in the targets of quinolones, GyrA and ParC was the main mechanism of quinolone resistance identified in this study, although a decreasing of the porins expression had been identified among nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates. In the surveyed area, the prevalence of ESBL producers was important (9.3%), provided that this finding was related to a large diversity of genotypes circulating in the community, mainly CTX-M-producing isolates. This study constituted the first epidemiological survey of QnrA and QnrB determinants among Brazilian isolates. Interestingly, the qnrB2 gene was identified in non ESBL producers isolates and qnrS genes were not found.

Este estudo foi elaborado com o objetivo de elucidar os mecanismos de resistência às quinolonas presentes em enterobactérias isoladas de pacientes de duas regiões metropolitanas brasileiras. Foram avaliadas possíveis alterações nas proteínas relacionadas com o sítio de ação das quinolonas, bem como a presença de plasmídeos e integrons que carregam determinantes gênicos que codificam resistência às quinolonas. A associação destes com mecanismos plasmideais de resistência aos antibióticos -lactâmicos também foi analisada. Foram avaliadas 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico isoladas de pacientes hospitalizados e da comunidade no período de 2000 a 2005. Por PCR e seqüenciamento, foram analisadas as mutações presentes nos genes cromossômicos gyrA e parC e as estruturas gênicas associadas com determinantes plasmideais de resistência às quinolonas, Qnr, e aos -lactâmicos de amplo espectro. Foram determinados os perfis plasmideais e a transferabilidade dos plasmídeos que carrearam estes determinantes. A extração e a análise das proteínas de membrana externa foi realizada para avaliar uma possível perda ou diminuição da expressão de porinas, também relacionada com os mecanismos de resistência avaliados. Todas as amostras foram resistentes ao ácido nalidíxico, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) superior a 16 g/mL, e em média, 70% apresentaram diminuição de sensibilidade às fluoroquinolonas testadas. De 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico, em seis enterobactérias (2,3%), incluindo 3 E. coli, 2 K. pneumoniae e 1 C. freundii foi encontrado o gene qnrB. Cinco linhagens apresentaram suas seqüências idênticas ao gene qnrB2, e uma linhagem, C. freundii JF79, apresentou uma seqüência idêntica ao gene qnrB8. Em uma linhagem de E. cloacae foi detectado o gene qnrA1 (0,37%). Os genes qnrA e qnrB apresentaram-se localizados em plasmídeos que apresentaram de 55 a 180 kilobases. A análise da estrutura gênica indicou que os genes qnrA1 e qnrB2 estavam associados com um integron classe 1 e localizados entre o elemento ISCR1 e a segunda cópia do segmento conservado 3. Na coleção bacteriana avaliada, as principais mutações observadas foram nos códons 83 e 87 em gyrA, e nos códons 80 e 84 em parC. Todas as enterobactérias que exibiram unicamente mutações no gene gyrA apresentaram CIM 16 µg/mL para o ácido nalidíxico. A diferença encontrada nos valores da CIM de fluoroquinolonas em enterobactérias que apresentaram as mesmas substituições em GyrA e ParC foi explicada pela ausência ou diminuição da expressão de porinas. Em relação à produção de -lactamase de espectro ampliado (ESBL), sua presença foi comprovada em 24 (9,3%) enterobactérias. O seqüenciamento de blaCTX-M identificou 18 determinantes: CTX-M-2 (n=13), incluindo dois novos variantes, CTX-M-8 (n=2) e CTX-M-9 (n=3) mediados por plasmídeos de 48 a 180 kilobases, não conjugativos, em maioria. O gene blaSHV-5 foi detectado em seis enterobactérias. Todos os determinantes do grupo 2 apresentaram-se associados com um elemento ISCR1, enquanto que aqueles do grupo 9 estiveram relacionados com ISEcp1. Concluindo, o principal mecanismo de resistência às quinolonas detectado foi a presença de substituições em GyrA e ParC, apesar de outros mecanismos, como a diminuição da expressão de porinas estarem envolvidos nas enterobactérias avaliadas. A associação da produção de ESBL foi significativa devido ao encontro de uma grande diversidade de genótipos circulando na comunidade, com uma predominância de enterobactérias produtoras de CTX-M. Quanto aos determinantes Qnr descritos neste estudo, que notoriamente foram os primeiros relatos no Brasil, somente dois deles apresentaram-se relacionados com a produção de ESBL. / The aim of this study was to investigate the main mechanisms of quinolone resistance among enterobacterial isolates recovered from hospitalized patients and outpatients in Brazil. The modification of the quinolone targets with changes of DNA gyrase and of topoisomerase IV genes and the presence of determinants codifying plasmid- mediated quinolone and oxymino- cephalosporins resistance were investigated. Two hundred fifty seven non-duplicate nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates recovered from January 2000 to May 2005 were analysed. Mutations in the topoisomerases gyrA and parC genes and the genetic structures surrounding Qnr and CTX-M determinants were recognized by PCR and sequencing. Conjugation experiments were performed to determine whether the qnr- and blaCTX-M carrying plasmids were self transferable. Also, decrease in the level of porin expression related to quinolone resistance was assessed. All enterobacterial isolates were resistant to nalidixic-acid, showing minimal inhibitory concentrations (MIC) 16 g/mL and 70% of these isolates showed decreased susceptibility to fluoroquinolone. Six qnrB-positive (2.3%) out of 257 nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates, were identified, including 3 Escherichia coli, 2 Klebsiella pneumoniae and 1 Citrobacter freundii. Five isolates had an identical qnrB2 sequence and one isolate, C. freundii 79, possessed the qnrB8. A single Enterobacter cloacae carrying a plasmid encoding qnrA gene was identified (0.37%). All isolates were negative for the qnrS genes. Plasmid-mediated quinolone resistance ranged from 55- to 180-kb in size. Sequence analysis of the genetic structures surrounding of the qnrA and qnrB genes identified an ISCR1 element at the left-hand boundary and a partial copy of the 3-end segment of class 1 integrons. Concerning the changes of DNA gyrase and topoisomerase IV, the most common modification in the enterobacterial isolates analyzed were present at codons 83 and 87 in GyrA and in ParC at codons 80 and 84. All isolates that exhibited mutations in gyrA gene showed nalidixic-acid MIC 16 µg/mL. The finding of different MIC values to fluoroquinolones in enterobacterial isolates with the same GyrA and ParC modification was explained by a decreasing in the level of porin expression. Regarding -lactam resistance mechanisms, twenty four (9.3%) ESBL-producing enterobacterial isolates were detected. Sequencing of the CTX-M-encoding genes identified 18 determinants belonging to CTX-M-2 (n=13), CTX-M-8 (n=2) and CTX-M-9 (n=3) groups. CTX-M-2 group determinants included blaCTX-M-2 and the two novel variants. Plasmids harboring blaCTX-M genes ranged from 48- to 180- kb in size and were not transferable, in their majority. The blaSHV-5 genes were detected in all the 6 blaCTX-M negative isolates. All alleles belonging to the group 2 were associated with ISCR1 element, while all blaCTX-M-9 genes were related to ISEcp1 element. In conclusion, alterations in the targets of quinolones, GyrA and ParC was the main mechanism of quinolone resistance identified in this study, although a decreasing of the porins expression had been identified among nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates. In the surveyed area, the prevalence of ESBL producers was important (9.3%), provided that this finding was related to a large diversity of genotypes circulating in the community, mainly CTX-M-producing isolates. This study constituted the first epidemiological survey of QnrA and QnrB determinants among Brazilian isolates. Interestingly, the qnrB2 gene was identified in non ESBL producers isolates and qnrS genes were not found.

O presente estudo visou determinar a prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de produzem b-lactamases de amplo espectro (ESBL) e resistência adquirida a quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR) em animais de estimação, investigando o potencial papel destes hospedeiros como portadores assintomáticos. Em 2012, foram coletadas 216 amostras (fezes e saliva) de 108 animais de companhia (29 gatos e 79 cães) abrigados em casas de família, um centro de acolhimento de animais abandonados, e no Centro de Controle de Zoonoses da Cidade de São Paulo. Do total de cepas estudadas, 85% apresentaram fenótipo sugestivo de PMQR; enquanto que 62% dos isolados exibiram um fenótipo característico e sugestivo para produção de ESBL, sendo na sua maioria identificadas como E. coli. Dentre os isolados, 14 carregaram variantes do gene blaCTX-M, 9 foram positivos para o gene blaTEM, e 6 foram positivos para blaSHV. Em relação às cepas resistentes às Q/FQ, 56% (n= 43) foram positivas para a presença do gene qnr, o qual foi identificado em 11 espécies diferentes. Os resultados apresentados demostram que animais de companhia podem ser portadores assintomáticos de cepas produtoras de ESBL e PMQR. / The present study aimed to determine the prevalence of Gram-negative bacteria producing b-lactamases producing broad-spectrum (ESBL) and acquired resistance to quinolones mediated by plasmids (PMQR) in pets, investigating the potential role of these hosts as asymptomatic carriers. In 2012, 216 samples (feces and saliva) of 108 companion animals (29 cats and 79 dogs) housed in shelters or a Zoonosis Control Center were collected from São Paulo city. Of the total strains studied, 85% had a phenotype suggestive for PMQR; while 62 % of the isolates exhibited a characteristic phenotype and suggestive for ESBL-producing genes, with the most identified as E. coli. Among the isolates, 14 carried variants blaCTX -M gene 9 were positive for blaTEM gene, and 6 were positive for blaSHV. Regarding resistant Q/FQ isolates, 56% (n = 43) were positive for the presence of qnr gene, which was identified on 11 different species. The results presented demonstrate that pets can be asymptomatic carriers of ESBL producing strains and PMQR.

O presente estudo visou determinar a prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de produzem b-lactamases de amplo espectro (ESBL) e resistência adquirida a quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR) em animais de estimação, investigando o potencial papel destes hospedeiros como portadores assintomáticos. Em 2012, foram coletadas 216 amostras (fezes e saliva) de 108 animais de companhia (29 gatos e 79 cães) abrigados em casas de família, um centro de acolhimento de animais abandonados, e no Centro de Controle de Zoonoses da Cidade de São Paulo. Do total de cepas estudadas, 85% apresentaram fenótipo sugestivo de PMQR; enquanto que 62% dos isolados exibiram um fenótipo característico e sugestivo para produção de ESBL, sendo na sua maioria identificadas como E. coli. Dentre os isolados, 14 carregaram variantes do gene blaCTX-M, 9 foram positivos para o gene blaTEM, e 6 foram positivos para blaSHV. Em relação às cepas resistentes às Q/FQ, 56% (n= 43) foram positivas para a presença do gene qnr, o qual foi identificado em 11 espécies diferentes. Os resultados apresentados demostram que animais de companhia podem ser portadores assintomáticos de cepas produtoras de ESBL e PMQR. / The present study aimed to determine the prevalence of Gram-negative bacteria producing b-lactamases producing broad-spectrum (ESBL) and acquired resistance to quinolones mediated by plasmids (PMQR) in pets, investigating the potential role of these hosts as asymptomatic carriers. In 2012, 216 samples (feces and saliva) of 108 companion animals (29 cats and 79 dogs) housed in shelters or a Zoonosis Control Center were collected from São Paulo city. Of the total strains studied, 85% had a phenotype suggestive for PMQR; while 62 % of the isolates exhibited a characteristic phenotype and suggestive for ESBL-producing genes, with the most identified as E. coli. Among the isolates, 14 carried variants blaCTX -M gene 9 were positive for blaTEM gene, and 6 were positive for blaSHV. Regarding resistant Q/FQ isolates, 56% (n = 43) were positive for the presence of qnr gene, which was identified on 11 different species. The results presented demonstrate that pets can be asymptomatic carriers of ESBL producing strains and PMQR.

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