La seqüenciació del genoma de Saccharomyces cerevisiae al 1996 va revelar que el 60% dels aproximadament 6000 gens del llevat codificaven per proteïnes de funció desconeguda. Donat que el nostre laboratori investiga l'estructura i funció d'enzims de la superfamíla de les deshidrogenases/reductases de cadena mitja (MDR), vàrem realitzar una búsqueda en el genoma del llevat de possibles membres MDR encara no caracteritzats. Es van identificar 12 ORFs, dels quals 5 eren de funció desconeguda. La present tesi doctoral ha estudiat la funció de l'enzim codificat per un d'aquests gens, el YAL060W.S'ha clonat i expressat el gen YAL060W de S. cerevisiae per determinar l'activitat del seu producte gènic. El gen YAL060W, que s'ha anomenat BDH1, codifica per una butanodiol deshidrogenasa: la Bdh1p. Aquest enzim pertany a la superfamília enzimàtica de les MDR i és la primera butanodiol deshidrogenasa d'aquesta superfamília descrita en un organisme eucariòtic.Els principals substrats de l'enzim són l'acetoïna i el 2,3-butanodiol, i a més, és estereoespecífic pels isòmers d'aquests substrats en configuració R. Altres substrats de l'enzim són el diacetil i la 2,3-pentanodiona, a més de compostos amb grups diol, dicetona o hidroxicetona contigus. La Bdh1p és un enzim específic pel coenzim NAD(H). La Bdh1p s'expressa preferencialment a la fase estacionària quan s'esgota la glucosa del medi, així com quan es creix el llevat en fonts de carboni com l'etanol o la galactosa. S'ha identificat un altre enzim actiu amb diacetil i NADH en els homogenats de S. cerevisiae que ha resultat ser l'alcohol deshidrogenasa II (Adh2p). Aquest enzim és també actiu amb 2,3-pentanodiona, però no ho és amb acetoïna o 2,3-butanodiol. La reducció d'aquests compostos també és estereoespecífica però pels grups en configuració S.Durant la fermentació, S. cerevisiae produeix i acumula acetoïna i 2,3-butanodiol. La Bdh1p és la responsable de la producció de l'isòmer (2R,3R)-2,3-butanodiol. La deleció del gen BDH1 elimina l'acumulació d'aquest compost al medi així com l'activitat acetoïna reductasa en homogenats de llevat crescut en glucosa. Per tant, durant la fermentació alcohòlica la Bdh1p reduiria l'acetoïna sintetitzada a partir d'acetaldehid per la piruvat descarboxilasa, produint el 2,3-butanodiol. La Bdh1p seria l'enzim responsable d'aquesta branca secundària del metabolisme fermentatiu, que podria contribuir a regular el balanç redox de manera fina. En canvi la deleció dels gens ADH2 i YAL061W (amb un 51% d'identitat seqüencial amb el BDH1) no afecten al patró d'excreció del butanodiol, però es veu reduïda l'activitat diacetil reductasa en un 58% en fase exponencial i un 34% a la fase estacionària.Diacetil i 2,3-pentanodiona, també anomenats VDKs, són compostos organolèptics indesitjables que es produeixen durant la fabricació industrial de cervesa i que són eliminats durant un llarg període de maduració. Les VDKs són substrats de la Bdh1p, el que donava la possibilitat de que soques de llevat que sobreexpressessin la Bdh1p acceleressin l'eliminació d'aquests compostos i poguessin reduir el temps de maduració de la cervesa. Per això es va sobreexpressar la Bdh1p sota el control del promotor ADH1 en la soca industrial cervesera SID amb vectors centromèrics i multicòpia. Aquestes soques disminuïen, en certes condicions, l'acumulació de VDKs durant la fermentació del most. També es va modificar genèticament la mateixa soca industrial per tal de sobreexpressar la Bdh1p de manera estable, però la fermentació de most industrial amb aquesta soca modificada no va afectar els nivells d'acumulació de VDKs al medi. Les aplicacions biotecnològiques es varen estudiar amb la participació de l'empresa S.A. Damm. / The sequencing of the genome of the yeast Saccharomyces cerevisiae finished in 1996, revealing that approximately 60% of their 6000 genes, coded for proteins of unknown function. As our laboratory is interested in the relationship between the structure and function of medium chain dehydrogenases/reductases (MDR), we screened the yeast genome for MDR members uncharacterised until then. We identified 12 ORFs, 5 of which were of unknown function. The present doctoral thesis presents the studies carried out with the enzyme encoded by one of those genes, YAL060W.The YAL060W gene from S. cerevisiae has been cloned and expressed in a yeast vector. The gene, that we have named BDH1, codes for a butanediol dehydrogenase: Bdh1p. This enzyme is the first butanediol dehydrogenase described in an eukaryote, belonging to the MDR superfamily.Acetoin and 2,3-butanediol are the best substrates for the enzyme, that is stereoespecific for the oxidation of the R isomers of the diol and for the reduction of the acetoin yielding a centre with an R configuration. Other substrates for the enzyme are diacetyl and 2,3-pentanodione, and also those compounds containing vicinal diol, diketone or hydroxy-ketone groups. Bdh1p is extremely specific for NAD(H) as coenzyme.Bdh1p is induced in the stationary phase when yeast has exhausted the glucose from the medium. It is also expressed in yeasts grown in ethanol or galactose as carbon sources.We identified another enzyme active with diacetyl and NADH in S. cerevisiae extracts that turned out to be alcohol dehydrogenase II (Adh2p). Adh2p is also active with 2,3-pentanedione, but not with acetoin or 2,3-butanediol. Reduction of these compounds is also stereospecific, but yielding an hydroxyketone with an S configuration.All the stereoisomers of 2,3-butanediol and acetoin are produced by S. cerevisiae during fermentation, being Bdh1p responsible of the production of (2R,3R)-2,3-butanediol. Deletion of the BDH1 gene eliminates the excretion of (2R,3R)-2,3-butanediol, resulting in an accumulation of R-acetoin. So, during alcoholic fermentation Bdh1p reduces acetoin, synthesised by pyruvate decarboxylase from acetaldehyde, to 2,3-butanediol. By its presence in this secondary fermentative pathway, Bdh1p can contribute to the regulation of the redox balance in yeast.Deletion of the ADH2 andYAL061W (with a 51% of sequence identity with BDH1) genes, results in a substantial decrease of the diacetyl reductase activity (58% in the exponential phase and 34% in the stationary phase), although doesn't affect the proportion of butanediol isomers excreted during alcoholic fermentation.Diacetyl and 2,3-pentanedione, also called VDKs, have unpleasant organoleptic properties above a certain threshold, and are produced during the industrial production of beer. The concentration of both compounds needs to be reduced during a long maturation time. Since VDKs are substrates of Bdh1p, we hypothesized that yeast strains overexpressing Bdh1p could accelerate the elimination of these compounds, resulting, then, in a shortenig of the maturation step in beer production. We overexpressed Bdh1p under the control of the ADH1 promoter by using centromeric and multicopy vectors in an industrial beer yeast strain, called SID. The overexpression of Bdh1p from yeast expression vectors in the industrial strain, reduced, in some conditions, the accumulation of VDKs during must fermentation. In order to overexpress Bdh1p in a stable way, we then inserted the Bdh1p construct in the SID genome, but must fermentation with this strain did not result in reduced levels of VDKs. These biotechnological applications were done in collaboration with the firm S.A. DAMM.

Les glutaredoxines són enzims que intervenen en reaccions redox i que la sevafunció principal consisteix en protegir les cèl·lules contra estrès oxidatiu mitjançant elmanteniment de l'estat redox adequat dels grups sulfidril de les proteïnes cel·lulars.Treballs anteriors han descrit l'existència de dues glutaredoxines en el llevatSaccharomyces cerevisiae, Grx1 i Grx2, que contenen dues cisteïnes en el seu centreactiu les quals són essencials per a mantenir la seva funció. Aquestes duesglutaredoxines juguen diferents papers en la cèl·lula en la protecció contra estrèsoxidatiu.Aquest treball consisteix en l'estudi i caracterització d'una nova família deglutaredoxines en S. cerevisiae, formada per Grx3, Grx4 i Grx5, que es diferencia de laja descrita perquè les proteïnes tenen una única cisteina en el seu centre actiu. S'harealitzat un anàlisi comparatiu de les seqüències de les dues famílies de glutaredoxinesde llevat amb les existents en altres organismes, i s'ha vist que l'estructura bàsica de lesmateixes està conservada des de bacteris a humans. L'anàlisi funcional dels mutantsd'aquesta nova família ha revelat que, de les tres glutaredoxines monotiòliques, Grx5 ésla que desenvolupa una funció més important en la protecció contra estrès oxidatiu,clarament diferenciada de Grx3 i Grx4. Grx5 s'ha vist localitzada en la mitocòndria,essent aquesta localització indispensable per al normal funcionament de l'enzim. Grx3 iGrx4, en canvi, es troben al nucli. D'acord amb la sublocalització cel·lular, es mostrendiferents evidències de què Grx5 es troba directament implicada en la biosíntesi delscentres Fe/S, que en llevats té lloc a la mitocòndria. Els mutants mancats de Grx5 sóndefectuosos en l'activitat d'enzims amb centres Fe/S i acumulen en excés de ferro, tantal citosol com a la mitocòndria. Estudis mitjançant la tècnica del doble-híbrid handemostrat una interacció física entre Grx5 i Isa1, una altra proteïna de la matriumitocondrial que intervé en la síntesi dels centres Fe/S. Les dades existents indiquenque les glutaredoxines monotiòliques poden portar a terme funcions especialitzadescada una d'elles en diferents compartiments del llevat, sense excloure la possibleredundància funcional entre Grx3 i Grx4. / Las glutaredoxinas son enzimas que intervienen en reacciones redox y cuyafunción principal consiste en proteger las células contra estrés oxidativo a través delmantenimiento del estado redox adecuado de los grupos sulfidrilo de las proteínascelulares. Trabajos anteriores han descrito la existencia de dos glutaredoxinas en lalevadura Saccharomyces cerevisiae, Grx1 y Grx2, que contienen dos cisteínas en sucentro activo las cuales son esenciales para mantener su función. Estas dosglutaredoxinas juegan diferentes papeles en la célula en la protección contra estrésoxidativo.El presente trabajo consiste en el estudio y caracterización de una nueva familiade glutaredoxinas en S. cerevisiae, formada por Grx3, Grx4 y Grx5, que se diferencia dela ya descrita porque las proteínas poseen una única cisteína en su centro activo. Se harealizado un análisis comparativo de las secuencias de las dos familias deglutaredoxinas de levadura con las existentes en otros organismos, observándose que laestructura básica de las mismas está conservada desde bacterias a humanos. El análisisfuncional de los mutantes de esta nueva familia ha revelado que, de las tresglutaredoxinas monotiólicas, Grx5 es la que desarrolla una función más importante en laprotección contra estrés oxidativo, claramente diferenciada de Grx3 y Grx4. Grx5 se havisto localizada en la mitocondria, siendo esta localización indispensable para el normalfuncionamiento de la enzima. Grx3 y Grx4, en cambio, se encuentran en el núcleo. Enconcordancia con la sublocalización celular, se muestran varias evidencias de que Grx5se halla directamente implicada en la biosíntesis de los centros Fe/S, que en levadurastiene lugar en la mitocondria. Los mutantes carentes de Grx5 son defectivos en laactividad de enzimas con centros Fe/S y acumulan un exceso de hierro, tanto en elcitosol como en la mitocondria. Estudios mediante la técnica del doble-híbrido handemostrado una interacción física entre Grx5 e Isa1, otra proteína de la matrizmitocondrial que interviene en la síntesis de centros Fe/S. Los datos existentes apuntana que las glutaredoxinas monotiólicas pueden desempeñar funciones especializadas cadauna de ellas en compartimentos diversos de la levadura, sin excluir la posibleredundancia funcional entre Grx3 y Grx4. / Glutaredoxins are enzymes involved in redox reactions, whose main functionconsists of protecting cells against oxidative stress through maintaining a normal redoxstatus of sulfhydril groups in cellular proteins. Previous work has described twoglutaredoxins in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Grx1 and Grx2, that contain twocysteines residues in their active site, which are essential for their enzymatic function.These two glutaredoxins play different roles in protecting cells against oxidative stress.The present work consists of the study and characterisation of a new family ofglutaredoxins in S. cerevisiae, composed by Grx3, Grx4 and Grx5. These have a singlecysteine in the active site of the protein, in contrast to the previous glutaredoxins. Acomparative analysis of the sequences of the two families of the yeast glutaredoxinsand the glutaredoxins of other organisms has been carried out, and the basic structure ofthese enzymes is indeed conserved from bacteria to humans. The functional analysis ofmutants of this new family reveals that Grx5 is the most important monothiolicglutaredoxin in protecting cells against oxidative stress, and that its function is differentfrom that of Grx3 and Grx4. Grx5 is located in mitochondria and this localisation isneeded for the normal function of the enzyme. In contrast, Grx3 and Grx4 are located atthe nucleus. According to the subcellular location, several evidences are showndemonstrating that Grx5 is directly involved in the biosynthesis of Fe/S clusters, whichtakes place at the mitochondrial matrix in yeast. The grx5 mutants are defective in theactivity of Fe/S enzymes and accumulate iron both in mitochondria and cytosol. Twohybridassays show that there is a physical interaction between Grx5 and Isa1, anothermatrix mitochondrial protein that participates in the synthesis of Fe/S clusters. All thesedata suggest that monothiolic glutaredoxins play specialised functions in differentcompartments of yeast, which does not exclude the possibility that Grx3 and Grx4 couldbe functionally redundant.

Els nutrients són els factors tràfics més importants per al llevat, i la sevalimitació provoca una aturada del cicle en la fase G1. Aquesta resposta d'adaptació alscanvis nutricionals del medi assegura la màxima viabilitat de la cèl·lula, i permet l'inicide diferents processos de diferenciació segons les condicions nutricionals.El cicle cel·lular de Saccharomyces cerevisiae està regulat en diferents puntsper mecanismes de control intern que asseguren la proliferació sense cap anomalia enels diferents processos cel·lulars. Al final de fa fase G1, si les condicions nutricionalssón òptimes, es dóna el compromís de continuar el cicle fins a la propera fase G1. Lavia de senyalització de la limitació de nutrients essencials com la font de nitrogenencara no havia estat determinada. Hem estudiat la regulació de les ciclines de faseG1 en el model de limitació de font de nitrogen, i hem demostrat que la proteïna Cln3està regulada post-transcripcionalment de dues formes diferents: una majorinestabilitat que depèn de la via de la ubiquitina, i una inhibició traduccional queprovoca la total desaparició de Cln3, causant així la repressió de gens dependents deSBF i MBF en la següent fase G1. La presència de Sic1, l'inhibidor de complexesClb/Cdc28, permet explicar en termes moleculars l'aturada en G1.En condicions de limitació nutricional les cèl·lules diploides també s'aturen enG1, però inicien un procés diferenciador anomenat meiosi, que implica la replicado delDNA, dues divisions meiòtiques i la formació d'espores com a unitats de resistència acondicions adverses. La proteïna Ime1 és la principal inductora de tots els processosde meiosi i activa l'expressió del primer grup de gens que participen en la replicadopremeiòtica del DNA. En aquest treball mostrem que, en les condicions nutricionals enque es dóna la meiosi, les ciclines G1 desapareixen ràpidament, però d'altra banda esprodueix una alta expressió de CLB5 que depèn d'Imel. Els nivells de Sic1disminueixen, de manera també dependent d'Imel, el que indica un mecanisme deregulació d'entrada en la fase S premeiòtica molt semblant al cicle mitòtic, però induitper Ime1 enlloc de Cdc28/Cln3. En mutants cln la meiosi pot iniciar-se en medi ric, elque implica a les ciclines G1 com a mediadores d'un senyal nutricional sobre l'inici dela meiosi. Les ciclines G1 inhibeixen la via Ime1 mitjançant dos controls negatius:repressió transcripcional d'IMEI, i inhibició de l'acumulació en el nucli d'Imel,reprimint així l'expressió del gens meiòtics. Aquests resultats demostren l'existènciad'un control negatiu dels activadors clau de la mitosi sobre els de la meiosi, fent queaquestes dues opcions del cicle cel·lular siguin incompatibles.

No description available.