L’Autophagie médiée par les protéines chaperonnes (ou CMA pour Chaperone-Mediated Autophagy) est une voie majeure du catabolisme lysosomal considérée aujourd’hui comme un acteur central de contrôle de nombreuses fonctions cellulaires, et dont les défauts sont associés à plusieurs pathologies humaines, dont des maladies neurodégénératives, des cancers et des troubles du système immunitaire. Selon l’idée actuellement admise, cette fonction cellulaire n’existerait que chez les mammifères ou les oiseaux, qui seraient les seuls à exprimer la protéine LAMP2A, une protéine nécessaire au fonctionnement de la CMA. Or, récemment, nous avons pu mettre en évidence l’existence de séquences exprimées présentant une forte homologie avec LAMP2A de mammifères chez plusieurs espèces de poissons, remettant ainsi en question ce point de vue et suggérant que la CMA soit apparue beaucoup plus tôt au cours de l'évolution qu'on ne l'avait initialement cru. Dans cette thèse, nous retraçons l’histoire évolutive du gène LAMP2 chez les vertébrés. Nous démontrons que ce gène est apparu après la seconde duplication complète du génome survenue chez l'ancêtre commun des vertébrés il y a environ 500 millions d'années. En outre, en adaptant une méthode récemment décrite pour mesurer l’activité de la CMA dans des cellules de mammifères à une lignée de fibroblastes de medaka (Oryzias latipes), nous apportons la preuve de l’existence de cette fonction cellulaire chez cette espèce de poisson. Enfin, afin de caractériser le rôle physiologique de cette fonction chez les poissons, nous avons procédé à l’invalidation par crispR-cas9 de lamp2a chez le medaka. Les poissons générés présentaient de sévères perturbations du métabolisme intermédiaire, comme précédemment décrit chez des souris dont LAMP2A a été invalidée dans le foie. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent clairement, et pour la toute première fois, qu’il existe bien une activité CMA fonctionnelle chez les poissons, et apportent ainsi de nouvelles perspectives dans ce domaine de recherche, notamment en autorisant l'utilisation de modèles génétiques complémentaires, tels que le poisson zèbre ou le medaka, pour faire avancer nos connaissances sur les mécanismes régissant cette fonction cellulaire. / Chaperone-Mediated Autophagy (CMA) is a major pathway of lysosomal proteolysis recognized as a key player in the control of numerous cellular functions, and whose defects have been associated to several human pathologies, including neurodegenerative diseases, cancers and immune disorders. To date, this cellular function was presumed to be restricted to mammals and birds, due to the absence of an identifiable lysosome-associated membrane protein 2A (LAMP2A), a limiting and essential protein for CMA, in non-tetrapod species. However, we recently identified the existence of expressed sequences displaying high homology with the mammalian LAMP2A in several fish species, challenging that view and suggesting that CMA appeared much earlier during evolution than initially thought. In the present thesis, we first present new evidences about the evolutionary history of the gene LAMP2 in vertebrates. We demonstrate that LAMP2 appeared after the second whole genome duplication that occurred at the root of the vertebrate lineage approximately 500 million years ago. By using a fluorescent reporter previously used to track CMA in mammalian cells, we then revealed the existence of a CMA-like pathway in a fibroblast cell line of the fish medaka (Oryzias latipes). Finally, to address the physiological role of Lamp2a in fish, we generated, medaka knockout for the splice variant lamp2a, and found severe alterations in the intermediary metabolism, as previously demonstrated in mice deficient for CMA in liver. Altogether, our data provide the first evidence for a CMA-like pathway in fish and bring new perspectives on the use of complementary genetic models, such as zebrafish or medaka, for studying CMA in an evolutionary perspective.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21339号 / 医博第4397号 / 新制||医||1031(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 井上 治久, 教授 宮本 享, 教授 林 康紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

The aryl hydrocarbon receptor (AHR) is a ligand-activated signaling molecule which controls tumor growth and metastasis, T cell differentiation, and liver development. Expression levels of this receptor protein are sensitive to the cellular p23 protein levels in immortalized cancer cell lines. As little as 30% reduction of the p23 cellular content can suppress the AHR function. Here we reported that down-regulation of the p23 protein content in normal, untransformed human bronchial/tracheal epithelial cells to 48% of its content also suppresses the AHR protein levels to 54% of its content. This p23-mediated suppression of AHR is responsible for the repression of (1) the ligand-dependent induction of the cyp1a1 gene transcription; (2) the benzo[a]pyrene- or cigarette smoke condensate-induced CYP1A1 enzyme activity, and (3) the benzo[a]pyrene and cigarette smoke condensate-mediated production of reactive oxygen species. Reduction of the p23 content does not alter expression of oxidative stress genes or production of PGE2. Down-regulation of p23 suppresses the AHR protein levels in two other untransformed cell types, namely human breast MCF-10A and mouse immune regulatory Tr1 cells. Collectively, down-regulation of p23 suppresses the AHR protein levels in normal and untransformed cells and can in principle protect our lung epithelial cells from AHR-dependent oxidative damage caused by exposure to agents from environment and cigarette smoking. The AHR is expressed in triple-negative and non-triple-negative breast cancer cells. It affects breast cancer growth and crosstalk with the estrogen receptor signaling. Normally the AHR is degraded shortly after ligand activation via the action of 26S proteasome. Here we report that the piperazinylpyrimidine compound Q18 triggers AHR protein degradation which is mediated through chaperone-mediated autophagy in triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-468 and MDA-MB-231). This lysosomal degradation of AHR exhibits the following characteristics: (1) not observed in non-triple-negative breast cancer cells (MCF-7, T47D, and MDA-MB-361); (2) inhibited by progesterone receptor B but not estrogen receptor alpha; (3) reversed by chloroquine but not MG132; (4) required LAMP2A; (5) triggered by 6 amino-nicotinamide and starvation and (6) involved AHR-LAMP2A interaction mediated by 6 amino-nicotinamide and starvation. The NEKFF sequence localized at amino acid 558 of human AHR is a KFERQ-like motif of chaperone-mediated autophagy, essential for the LAMP2A-mediated AHR protein degradation.