A troponina C é o componente do complexo heterotrimérico troponina ao qual o Ca2+ se associa. Essa associação torna a contração muscular um processo regulado por Ca2+. Pearlstone et al. (Biochemistry 31, 6545, (1992)) utilizaram o cDNA da troponina C de músculo esquelético de galinha (sTnC) para construir um mutante onde a fenilalanina da posição 29 foi substituída por triptofano (mutante F29W). Esse mutante permitiu que a ligação de Ca2+ aos sítios regulatórios amino terminais fosse acompanhada através de técnicas fluorescentes. Entretanto, algumas propriedades da sTnC foram alteradas pela mutação (Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330). No presente estudo, ensaios de ligação direta de Ca2+ bem como titulações de Ca2+ seguidas por fluorescência foram usadas para melhor se entenderem os efeitos da mutação Phe→Trp na posição 29 bem como a influência de certos aminoácidos componentes do sítio de ligação de Ca2+ nas propriedades do domínio regulatório. Dois novos mutantes foram construídos nos quais os análogos do triptofano 5-hidroxitriptofano ou 7 -azatriptofano foram introduzidos na posição 29 (resultando nos mutantes F29HW e F29ZW, respectivamente). Os dados mostraram que, quando comparada com a sTnC, a afinidade por Ca2+ dos sítios amino terminais foi elevada na F29W em aproximadamente seis vezes, três vezes na F29ZW e levemente diminuída na F29HW . A curva de fluorescência associada à ligação de Ca2+ à F29ZW mostrou-se bimodal, com cada fase podendo ser relacionada à ligação de Ca2+ a cada um dos sítios regulatórios. Esta é a primeira descrição através de técnicas de fluorescência da ligação sequencial de Ca2+ aos sítios amino terminais. Para investigar a influência de cada um dos sítios amino terminais nas propriedades de ligação ao Ca2+ ou propriedades fluorescentes da sTnC, F29W, F29HW e F29ZW , construímos mutantes duplos e triplos através da substituição do aspartato da posição 30 ou 66 (ou ambos) por alanina. Essas mutações afetam respectivamente a capacidade de ligação ao Ca2+ dos sítios I e II. Os dados mostraram que: 1) nas concentrações de Ca2+ analisadas, a mutação Asp→Ala na posição 30 impede somente a ligação de Ca2+ ao sítio I, enquanto a mutação Asp → Ala na posição 66 impede a ligação de Ca2+ aos sítios I e II, e 2) a mutação Asp → Ala na posição 30 torna silenciosa a substituição da fenilalanina da posição 29 por Trp, 5-hidroxitriptofano ou 7-azatriptofano. Concluímos que o sítio I é essencialmente inativo sem a ligação prévia de Ca2+ ao sítio II e que a posição 29 influencia a afinidade ao Ca2+ do sítio I \"ajustado\". / Troponin C is the Ca2+ binding component of heterotrimeric troponin. It makes skeletal muscle contraction a Ca2+ regulated process. We have previously used the cDNA of chicken skeletal TnC (sTnC) to construct a mutant where phenylalanine at position 29 was replaced by tryptophan (F29W mutant) [Pearlstone et al. (1992) Biochemistry 31, 6545]. This mutant allowed calcium binding to the regulatory amino terminal sites to be followed through fluorescence techniques, but altered some properties of sTnC [Li et al. (1995) Biochemistry 34, 8330]. In the present study, direct calcium binding assays and fluorescence followed calcium titrations were used to better understand the effects of the Phe→Trp mutation at position 29 as well as the influence of each amino site on the calcium binding properties of the regulatory domain. Two new mutants were constructed in which the tryptophan analogs 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan were introduced at position 29 (resulting in F29HW and F29ZW mutants, respectively). The data showed that when compared to sTnC, the Ca2+ affinity of amino sites was increased sixfold in F29W, nearly threefold in F29ZW and slightly decreased in F29HW. The F29ZW fluorescence followed Ca2+ titration displayed a bimodal curve that could be related to Ca2+ binding to each of the amino sites. This is the first report of fluorescence detection of the sequential Ca2+ binding to the regulatory sites. To investigate the influence of each amino site in the calcium binding or fluorescence properties of sTnC, F29W, F29HW and F29ZW, we have constructed double and triple mutants by replacing aspartate at position 30 or 66 (or both) by alanine. These mutations affect respectively the binding capacity of sites I and II. The data showed that: 1) in the calcium concentration range analyzed, the Asp→Ala mutation at position 30 impairs calcium binding to site I on1y, while Asp→Ala mutation at position 66 impairs calcium binding to both sites I and II, and 2) the Asp→Ala mutation at position 30 makes silent the replacement of Phe at position 29 by Trp, 5-hydroxytryptophan or 7-azatryptophan. We conclude that site I is essentially defunct without previous binding to site II and that position 29 influences the affinity of this adjusted site I.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-04Bitstream added on 2014-06-13T18:50:35Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_ccp_me_sjrp.pdf: 1317102 bytes, checksum: 8fd688580bc2bbfa18f313fc2ce6db07 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A linguiça cuiabana tem grande aceitação no município de São José do Rio Preto-SP e regiões adjacentes. Originalmente é constituída de carne bovina (corte traseiro), leite, cebolinha, pimenta bode, pimenta do reino, alho e sal refinado. Atualmente, encontramos no comércio diversos tipos de linguiça cuiabana, diferenciadas por condimentos, queijos, cortes musculares ou por espécies animais (suína, bovina, frango). No presente trabalho, juntamente com seu levantamento histórico, estudaram-se as características tecnológicas/ sensoriais da linguiça cuiabana. Foi realizado o processamento sob condições assépticas, de 4 formulações da linguiça tipo cuiabana, variando a principal matéria-prima utilizada (carne bovina, frango, suína). No processamento, as matérias-primas (bovina, frango e suína) foram cortadas em cubos que, juntamente com outros ingredientes (alho, queijo, pimenta e cebolinha), foram pesados e homogeneizados. A massa resultante foi deixada em repouso sob refrigeração por 24 horas para melhor desenvolvimento do sabor. Após descanso da massa, foi realizado o embutimento em tripas naturais. A partir destas amostras foram realizadas a caracterização do perfil físico-químico e avaliação sob refrigeração, ao longo de 7 dias de armazenamento por meio de análises microbiológicas (coliformes totais e termotolerantes (fecais), clostrídrios sulfito redutores, Salmonella spp., Staphylococcus coagulase positiva), pH, TBA. Por fim, a avaliação sensorial e estatística das diferentes linguiças tipo cuiabana processadas em laboratório. Os resultados mostraram que as variações ao longo do tempo na formulação das linguiças cuiabanas são fatores positivos, ficando evidente que as transformações são bem mais aceitas que a precursora, o que possivelmente ocorreram em função da demanda do mercado. / The cuiabana sausage has wide acceptance in the municipality of Sao Jose do Rio Preto and surrounding regions. Originally, it consisted of beef (cut back), milk, chives, goat pepper, black pepper, garlic and salt. Currently, various types of cuiabana sausage are found in trade and they are distinguished by spices, cheeses, muscle cut or animal species (bovine, chicken and swine). In this paper, along with a historical survey, we studied the technical/ sensory characteristics of cuiabana sausage. Processing was performed under aseptic conditions for 4 formulations of sausage type cuiabana, varying the main raw material (bovine, chicken and swine). In processing, the raw meat (beef, chicken and pork) was cut into cubes, which together with other ingredients (garlic, cheese, pepper and chives), were weighed and homogenized. The resulting mass was subjected to refrigeration for 24 hours in order to develop better. After the dough we rested, the inlay was inserted in natural casings. These samples were used to characterize both the physical-chemical profile and also the evaluation under refrigeration, for over a 7 days-storage in order to assess microbiological contamination (total coliforms and thermotolerant (fecal), sulphite reducing clostrídrios, Salmonella spp. , Staphylococcus coagulase positive), pH, TBA. Finally, the sensory evaluation and statistics of the different types of cuiabana sausage processed in the laboratory were performed. The results showed that changes over time in the formulation of cuiabana sausages are positive factors, demonstrating, thus, that the changes are much more accepted than the precursor, which possibly occurred as a function of market demand.

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