Les ADN topoisomérases de type 2 (Top2) sont des protéines universelles et essentielles à la vie cellulaire. Elles ont pour fonction de réguler de manière fine l’équilibre topologique de l’ADN. Chez l’homme, les Top2 (HsTop2) sont des cibles thérapeutiques de première importance en oncologie. Des molécules telles que l’étoposide et la doxorubicine font partie des traitements anticancéreux les plus utilisés en clinique à l’heure actuelle, elles agissent en stabilisant les complexes Top2/ADN/inhibiteurs qui sont transformés en lésions permanentes dont l’accumulation entraîne la mort cellulaire. Mon travail de thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle et structurale des isoformes des HsTop2 entières en complexe avec des composés thérapeutiques. Mon projet de thèse comporte trois axes principaux et complémentaires : (i) La production et la caractérisation fonctionnelle in vitro des isoformes recombinantes. Nous avons optimisé et simplifié les protocoles de surexpression des deux isoformes dans la levure et avons également mis au point leur expression dans les cellules de mammifère. (ii) une étude structurale par cryo-microscopie électronique sur les HsTop2 entières en complexe avec des composés thérapeutiques et des oligonucléotides. Ces premiers travaux ont permis l’obtention d’une carte tridimensionnelle de l’enzyme entière qui servira de base pour l’étude de l’architecture des HsTop2 au sein de complexes protéiques de plus grande taille. (iii) des expériences de protéomique chimique permettant de mettre à jour les cibles secondaires potentielles de l’étoposide et de la doxorubicine dans des extraits cellulaires de lignées cancéreuses. / The type 2 DNA topoisomerases are universal proteins essential for cell survival. These enzyme fine tune the topological equilibrium of the DNA in cells. The human proteins are major targets of therapeutics drugs used in oncology. Molecules like etoposide and doxorubicin are among the most effective anticancer drugs used in chemotherapy treatments; they form stable Top2/DNA/drugs complexes which are then transformed in permanent DNA damages. This thesis project focuses on the functional and structural characterization of these complexes using 3 main strategies:(i) the production and the in vitro functional characterization of the recombinant isoforms. We optimized and simplified the production and purification procedures and overexpressed both isoforms in mammalian cells. (ii) a structural study by cryoelectron microscopy on the full enzyme complex with DNA and therapeutic drugs. We obtained a 3D density map that will be used for further studies on the architecture of large HsTop2 associated complexes. (iii) ChemoProteomic experiments on cancer cell lines to highlight the potential etoposide and doxorubicin secondary targets.