Des charges cycliques élevées induisent la formation de microfissures dans l'os, déclenchant un processus de remodelage ciblé, mené par les ostéoclastes et suivi par les ostéoblastes, visant à réparer et à prévenir l'accumulation des dommages. L'os de cheval de course est un modèle idéal pour étudier les effets d'une charge de haute intensité, car il est sujet à une accumulation focale de microfissures et à la résorption qui s'ensuit dans les articulations. Les ostéoclastes équins ont rarement été étudiés in vitro. Le volume de résorption des ostéoclastes est considéré comme un paramètre direct de l'activité des ostéoclastes, mais des méthodes indirectes de quantification en 2D de la résorption osseuse sont plus souvent utilisées. L'objectif de cette étude était de développer une méthode précise, à haut débit et assistée par l'apprentissage profond pour quantifier le volume de résorption des ostéoclastes équins dans les images micro tomodensitométrie (µCT) 3D. Des ostéoclastes équins ont été cultivés sur des tranches d'os équins, imagés par μCT avant et après la culture. Le volume, le ratio de forme et la profondeur maximale de chaque événement de résorption ont été mesurés dans les images volumétriques de trois tranches d'os. Un convolution neural network (CNN) a ensuite été entraîné à identifier les événements de résorption sur les images μCT post-culture, puis le modèle a été appliqué à des tranches d'os d'archives (n=21), pour lesquelles l’aire de résorption en 2D, et la concentration du biomarqueur de résorption CTX-I étaient connues. Cela a permis d'obtenir des informations 3D sur la résorption des tranches d’os pour lesquels aucune imagerie n'avait été réalisée avant la mise en culture. La valeur modale du volume, la profondeur maximale et le ratio de forme des événements de résorption discrète étaient respectivement de 2,7*103µm3, 12 µm et 0,18. Le volume de résorption moyen par tranche d'os archivés était de 34155,34*103µm3. Le volume de résorption mesuré par le CNN était en forte corrélation avec les mesures de CTX-I (p <0,001) et d’aire (p <0,001). Cette technique de segmentation des images µCT des coupes osseuses assistée par apprentissage profond pour quantifier le volume de résorption osseuse des ostéoclastes équins permettra des recherches futures plus précises et plus approfondies sur l'activité des ostéoclastes. Par exemple, les effets antirésorptifs de médicaments tels que les corticostéroïdes et les bisphosphonates pourront être étudiés à l'avenir. / High cyclic loads induce the formation of microcracks in bone, initiating a process of targeted remodeling, led by osteoclasts, and followed by osteoblasts, aimed at repairing and preventing accumulation of damage. Racehorse bone is an ideal model for studying the effects of high-intensity loading, as it is subject to focal accumulation of microcracks and subsequent resorption within joints. Equine osteoclasts have rarely been investigated in vitro. The volume of osteoclast resorption is considered a direct parameter of osteoclast activity, but indirect 2D quantification methods are used more often. The objective of this study was to develop an accurate, high-throughput, deep learning-aided method to quantify equine osteoclast resorption volume in µCT 3D images. Equine osteoclasts were cultured on equine bone slices, imaged with μCT pre- and post-culture. Volume, aspect ratio (shape factor) and maximum depth of each resorption event were measured in volumetric images of three bone slices. A convolutional neural network (U-Net-like) was then trained to identify resorption events on post-culture μCT images and then the network was applied to archival bone slices (n=21), for which the area of resorption in 2D, and the concentration of a resorption biomarker CTX-I were known. This unlocked the 3D information on resorption for bone slices where no pre-culture imaging was done. The modal volume, maximum depth, and aspect ratio of discrete resorption events were 2.7*103µm3, 12 µm and 0.18 respectively. The mean resorption volume per bone slice on achieved bone samples was 34155.34*103µm3. The CNN-labeled resorption volume correlated strongly with both CTX-I (p <0.001) and area measurements (p <0.001). This technique of deep learning-aided feature segmentation of µCT images of bone slices for quantifying equine osteoclast bone resorption volume allows for more accurate and extensive future investigations on osteoclast activity. For example, the antiresorptive effects of medications like corticosteroids and bisphosphonates can be investigated in the future.

Chaque année, des chevaux de course décèdent de fractures complètes lors d’entrainement ou de course. A l’exercice, les charges supra-physiologiques cycliques entrainent des microfissures indiscernables par les techniques d’imagerie in vivo actuelles. Les ostéoclastes recrutés aux sites lésés induisent localement une lyse osseuse et une ostéopénie par résorption excessive, créant une concentration de contrainte à l’origine de fracture complète. Cependant, le rôle biologique des ostéoclastes dans les fractures de stress n’est à ce jour pas clairement identifié. Les objectifs de cette étude ont été d’établir des cultures in vitro d’ostéoclastes équins, corréler le nombre d’ostéoclastes avec l’isoforme 5b de l’enzyme phosphatase acide tartrate-résistante (TRACP 5b), corréler la résorption osseuse avec la TRACP-5b et le télopeptide C-terminal du collagène de type I (CTX-I) et étudier les effets de facteurs d’inflammation sur l’activité ostéoclastique. Après aspiration de moelle osseuse sternale, les cellules souches hématopoïétiques ont été isolées, conservées dans une banque cellulaire, décongelées, différenciées en ostéoclastes, avec ou sans os équin, et stimulées par des facteurs inflammatoires (IL-1β ou LPS). CTX-I et TRACP-5b ont été dosés par ELISA. Le nombre d’ostéoclastes colorés à la phosphatase acide tartrate-résistante et les aires de résorption osseuse colorées au bleu de toluidine ont été évalués. Dans les cultures d’ostéoclastes, la TRACP-5b augmentait (p < 0,0001) avec le temps et était corrélée (r = 0,63, p < 0.001) avec le nombre d’ostéoclastes. Dans les cultures d’ostéoclastes sur os, le CTX-I (p = 0,0018) et la TRACP-5b (p = 0,02) augmentaient avec le temps, étaient corrélés ensemble (r = 0,64, p < 0,002) et étaient tous deux corrélés avec la résorption osseuse (respectivement, r = 0,85, p < 0,001 et r = 0,82, p < 0,001). La stimulation inflammatoire n’a eu aucun effet significatif. Ostéoclastes équins et résorption osseuse ont été obtenus avec succès sur os équin à partir d’aspiration de moelle osseuse sternale. Pour la première fois, CTX-I et TRACP-5b ont été mesurés dans des cultures d’ostéoclastes équins. In vitro, CTX-I est un biomarqueur de résorption osseuse équine et TRACP-5b un biomarqueur du nombre d’ostéoclastes et de résorption osseuse équins. Des recherches ultérieures sont nécessaires afin d’évaluer si la TRACP 5b sérique permet la détection de toute résorption osseuse excessive chez les chevaux de course. / Every year racehorses die from complete catastrophic fractures in training and racing. Supra-physiological cyclic loads during exercise cause bone microcracks not discernible with current imaging in vivo. Osteoclasts recruited to the sites of the damage induce focal bone lysis and osteopenia by excessive resorption, creating a stress riser area susceptible to complete fracture. However, the biological impact of osteoclasts in stress fractures is not entirely understood. Our objectives were to establish in vitro cultures of equine osteoclasts, to correlate osteoclast numbers with the tartrate-resistant acid phosphatase 5b isoform (TRACP-5b), to correlate bone resorption with the TRACP-5b and the C-terminal telopeptide of type I collagen (CTX-I), as well as to investigate the effects of inflammatory factors on osteoclast activity. Following equine sternal bone marrow aspirations, hematopoietic stem cells were isolated, stored in a cell bank, thawed, differentiated into osteoclasts, with or without equine bone slices, and they finally underwent inflammatory stimulation (IL-1β or LPS). CTX-I and TRACP 5b were assayed by ELISAs. Osteoclasts stained with tartrate resistant acid phosphatase were counted and bone resorption areas stained with toluidine blue were measured. In the osteoclast cultures, the TRACP 5b increased (p < 0.0001) with time and correlated (r = 0.63, p < 0.001) with osteoclast number. In the osteoclast-bone cultures, both CTX-I (p = 0.0018) and TRACP-5b (p = 0.02) increased with time, correlated with each other (r = 0.64, p < 0.002) and both correlated with bone resorption (r = 0.85, p < 0.001 and r = 0.82, p < 0.001, respectively). The inflammatory stimuli had no significant effects. Equine osteoclasts and bone resorption were successfully induced on equine bone from sternal bone marrow aspiration. For the first time CTX-I and TRACP-5b were measured in equine osteoclast cultures. In vitro, CTX-I is a biomarker of equine bone resorption and TRACP-5b a biomarker of equine osteoclast number and bone resorption. Further investigations are required to measure the serum TRACP-5b capacity to detect excessive skeletal resorption in racehorses.