Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Suraia Said / Banca: Luiz Henrique Souza Guimarães / Banca: Tais Maria Bauab / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Resumo: Enzimas são catalisadores fundamentais para os sistemas biológicos sendo amplamente estudadas e aplicadas em todo o mundo, especialmente na área da saúde. Neste trabalho foi avaliada a aplicação de enzimas quitinolíticas e queratinolíticas em ensaios in vitro contra Pedicullus humanus capitis e na degradação de calos humanos, respectivamente. Foram selecionados os micro-organismos com maior potencial para produção dessas enzimas e determinados os parâmetros de produção, as condições de separação, purificação e caracterização das enzimas. Os micro-organismos com maior potencial para a produção de quitinases e queratinases foram os fungos Metarhizium anisopliae CG374 e Aspergillus oryzae, respectivamente. As maiores produções de quitinases foram obtidas em biorreator a 28°C, pH 7,0, 1,5 vvm e 200 rpm após 120 h. Quando produzida em biorreator hiperbárico sob pressão de 5 bar, apresentou um aumento de 21,3% na produtividade em relação ao biorreator convencional. Para queratinases em biorreator, os parâmetros de produção foram 28°C, pH 6, 200 rpm, 1,5 vvm e 120 h. A produção das quitinases e queratinases em biorreator foi 83 e 154% maior do que em frascos Erlenmeyer, respectivamente. A quitinase foi concentrada 5,12 vezes na purificação apresentando massas molares aproximadas de 24, 28 e 80 kDa. Fração purificada contendo quitinase apresentou estabilidade a 40°C por 60 minutos. A queratinase foi concentrada 4,52 vezes após purificação com massas molares de 40 e 50 kDa apresentando estabilidade térmica a 40°C por 60 min. A avaliação das enzimas quitinolíticas frente a piolhos humanos apontou para uma eficiência 9,1% maior quando comparadas com produtos comerciais. A avaliação da ação de enzimas queratinolíticas na degradação de calos humanos demonstrou resultados significativos quando comparados com produtos disponíveis no mercado... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enzymes are catalysts for fundamental biological systems is extensively studied and applied worldwide, especially in health. In this study were evaluated the application of enzymes chitinolytic and keratinolytic in tests in vitro against Pedicullus humanus capitis and degradation of human callus, respectively. Were selected microorganisms with the greatest potential for production of these enzymes and determined the production parameters, conditions of separation, purification and characterization of enzymes. The microorganisms with the higher potential for the production of chitinases and keratinases were Metarhizium anisopliae CG374 and Aspergillus oryzae, respectively. The highest yields of chitinases obtained in fermentations in a bioreactor were 28°C, pH 7.0, 1.5 vvm and 200 rpm after 120 h. When produced in the hyperbaric bioreactor at a pressure of 5 bar, an increase of 21.3% in yield over conventional production in a conventional bioreactor was observed. To keratinases in a bioreactor, the production parameters were 28°C, pH 6.0, 200 rpm, and 1.5 vvm after 120h. The production of chitinases and keratinases in bioreactor was 83 and 154% higher than in Erlenmeyer flasks, respectively. The chitinase was 5.12 times concentred on the purification presenting molar weight of approximately 24, 28 and 78 kDa. Fraction containing purified chitinase showed thermal stability of 40°C for 60 min. Keratinase was concentred 4.52 times after purification and presents molar weight of 40 and 50 kDa. The purified fraction was thermal stability at 40°C for 60 min. Evaluation of chitinolytic enzymes against human lice showed an efficiency of 9.1% higher for the enzymatic extract when compared with commercial products. The evaluation of the action of keratinolytic enzyme in the degradation of human callus showed significative results when compared to products on the market less time reaching maximum degradation / Doutor

Orientadora: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Banca: Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas-Bôas / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Resumo: Aedes aegypti (Linnaeus), principal vetor da dengue no Brasil, tem sido combatido com o uso maciço de produtos químicos, contribuindo com o desenvolvimento de resistência e inviabilizando o controle do inseto. Bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis vêm apresentando resultados satisfatórios no controle de dípteros, devido à produção de proteínas bioinseticidas denominadas Cry (cristal), Cyt (citolíticas) e Chi (quitinase) e os efeitos sinergísticos existentes entre elas. O presente trabalho objetivou a seleção de isolados de B. thuringiensis, portadores de genes cry, cyt e chi com alta eficiência no controle de A. aegypti. Uma coleção de 1073 isolados de B. thuringiensis, provenientes de diversas regiões brasileiras, foi submetida à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com base nos iniciadores específicos para os genes cry4Aa, cry4Ba, cry10Aa, cry11Aa, cry11Ba, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt2Aa e chi. Os isolados dípteros-específico foram avaliados quanto à estruturação genética e através de bioensaios seletivos e quantitativos, para determinação da CL50 e CL90. Apenas 45 (4,19%) apresentaram amplificação para os genes cry e cyt e destes, 25 (54,34%) eram quitinolíticos. Foram definidos 21 haplótipos entre os 45 isolados de B. thuringiensis, os quais foram submetidos aos bioensaios seletivos, indicando 13 isolados que causaram 100% de mortalidade às larvas de A. aegypti. Os bioensaios quantitativos e análise de agrupamento permitiram selecionar quatro isolados altamente tóxicos às larvas de A. aegypti. A identificação dos genes cry, cyt e chi de B. thuringiensis e análise dos efeitos sinergísticos entre as toxinas, associadas à análise da toxicidade a insetos vetores permitiram a seleção de isolados que poderão ser utilizados em formulações de novos bioinseticidas brasileiros, podendo contornar possíveis problemas de resistência. / Abstract: Aedes aegypti (Linnaeus), the main vector of dengue fever in Brazil, has been controlled with massive use of chemical products wich, contributed to the development of resistance decreasing the insect control efficacy. Bioinsecticides based on Bacillus thuringiensis is currently presenting satisfactory results on controlling dipterans, due to the production of Cry proteins (crystal proteins), Cyt (citolitic) and Chi (chitinase) with synergistic effects between them. The present work aimed to select B. thuringiensis isolates with cry, cyt and chi genes exhibiting high efficiency on A. aegypti larvae. A bacterial collection containing 1073 isolates of B. thuringiensis, obtained from different Brazilian locations, had their DNA isolated and submitted to PCR amplifications using specific primers for the genes cry4Aa, cry4Ba, cry10Aa, cry11Aa, cry11Ba, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt2Aa e chi. The dipterans-especific isolates were then evaluated for the genetic structure and through selective and latter to quantitative bioassays for the determination of LC50 and LC90. Forty five out of 1073 isolates (4.19%) presented amplicons for the cry and cyt genes and from these 25 (54.34%) were detected as chitinolitic. Twenty one haplotypes were identified among the 45 isolates of B. thuringiensis, which were submitted to the selective bioassays, indicating 13 isolates that caused 100% mortality of A. aegypti larvae. The quantitative bioassays and the statistical analysis have pointed four toxic isolates to A. aegypti larvae. The identification of the cry, cyt and chi genes of B. thuringiensis and the analysis of the synergistic effects among the toxins, along with the toxicity analysis towards the vector insects allowed the selection of a set of isolates that can be used for the formulation of new bioinsecticides from Brazilian origin, that would avoid or at least delay the appearance of resistance problems. / Doutor

Orientador: Edson Luiz Furtado / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Mariangela Cristofani Yali / Banca: Sylvia Dias Guzzo / Resumo: A ferrugem causada por Puccinia psidii é uma das principais doenças do eucalipto no Brasil, provocando prejuízos em viveiros e no campo. Ataca plantas jovens com menos de dois anos de idade, sempre em órgãos tenros como primórdios foliares e terminais de galhos. A resistência genética é apontada como a melhor opção para o controle da doença, mesmo em genótipos suscetíveis é possível ativar os mecanismos de resistência por meio de tratamento com agentes bióticos ou abióticos, sendo conhecida como 'indução de resistência'. Com o objetivo de estudar os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos no processo de defesa do eucalipto contra P. psidii, quatro ensaios foram executados com mudas de dois genótipos híbridos (Eucalyptus grandis x E. urophylla) denominados VR e C0. No primeiro ensaio, mudas foram tratadas com Acibenzolar-S-metil (ASM), Agro-Mos, Saccharomyces cerevisiae, Dipel, Ecolife40 e Crop-set, cinco dias antes da inoculação com o patógeno. A severidade da doença foi estimada 15 dias após a inoculação por meio de comparação com uma escala de notas. Nos tratamentos mais eficientes analisou-se a atividade das enzimas quitinase e peroxidase, 48 horas após inoculação (h.a.i). No segundo ensaio as mudas foram tratadas com ASM cinco dias antes da inoculação e a atividade de peroxidase e quitinase foi determinada 0, 24, 72 e 96 h.a.i nas folhas em diferentes estágios de desenvolvimento (1º, 2º e 4º pares). No terceiro ensaio a ação dos indutores ASM e S. cerevisiae, aplicados cinco dias antes da inoculação, foi correlacionada com possíveis alterações bioquímicas nas plantas. A atividade de quitinase, peroxidase, fenilalanina amônialiase (FAL) e polifenoloxidase em folhas do 1º e 2º pares coletadas em 5 períodos 0, 24, 48, 72 e 96 h.a.i. foi determinada. Finalmente, no quarto ensaio foi analisado o padrão de expressão gênica... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Common bacterial blight of snap bean (CBCSB), caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli responsible for expressive culture damage and reduction of seeds production and quality. The environmental impact of the indiscriminate use of pesticides has lead to search alternative methods of plant pathogens control. Resistance inducers have been efficiently successful on several plant pathogens control. Thus, this study aimed to evaluate the potential of alcohol extracts of Lippia alba (Melissa), Lippia sidoides (pepper-rosmarin), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (horsetail) and Hedera helix (English Ivy), essential oils of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and, pyraclostrobin and acibenzolar-S-metil on the control of common bacterial blight in snap beans, Bragança cultivar. These products were used in the following assays: in vitro bactericidal activity (except for acibenzolar-S-metil), in vivo activity of greenhouse-cultivated plants treated with products and the area under the disease progress curve (AUPDC) was calculated; activity of poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins in treated anduntreated bean leaves, infected and non-infected leave collected in different stages (0, 3, 5, 8 and 10 days after sprinkling with alcohol extracts, essential oils, acibenzolar-S-metil and pyraclostrobin). Results showed in vitro activity against X. axonopodis pv. phaseoli for L. alba and L. sidoides extracts, and essential oils while pyraclostrobin did not show any in vitro activity effect. L. Alba alcohol extract, pyraclostrobin and acibenzolar-S-methy showed the lowest AUPDC values compared to control treatment. The highest poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins values were observed in plant leaflets sprinkled with these products which probably are related to resistance induction. Essential oils did not show difference on AUPDC nor protein induction. / Doutor