Chloroperoxidase (CPO) is one of the most versatile heme enzyme isolated from the marine fungus, Caldariomyces fumago. Functionally, CPO can catalyze four types of reactions: peroxidation (peroxidase-like), dismutation (catalase-like), halogenation (halogenase-like), and peroxygenation (P450-like). Structurally, CPO has a distal and proximal pockets that can be best described as a hybrid of classical peroxidase and P450s. As a heme-thiolate protein, CPO contains the conserved proximal Pro28-Cys29-Pro30 stretch found in other members of the family. However, the structural and functional roles of these proline residues remain poorly understood. Site-directed mutagenesis was undertaken to generates three CPO mutants, P28A-, P30A-, P28A/P30A-CPO. The replacement of the rigid proline with a more flexible alanine residue, freed up the back bone amide for the formation of additional amide-sulfur hydrogen bond, allowing the investigation of the importance of these residues in CPO catalysis. The three CPO mutants displayed dramatic difference in ligand binding affinity and catalytic activities relative to WT-CPO. Any mutations on the proline resides within the proximal loop eliminated the halogenation and dismutation activities but enhanced the vii epoxidation and peroxidation activities by 4-14 fold. As the binding affinity for cyanide, the CPO mutants displayed significantly higher dissociation constant relative to WT-CPO. Our results revealed that Pro28 and Pro30 play important roles in maintaining the versatility of CPO. As a versatile enzyme, CPO has great application potential in pharmaceutical and chemical industry due to its ability to catalyze the formation of chiral epoxides. Phe103 and Phe186 located on the distal pocket have been proposed to guard the access of substrates to the ferryl oxygen of the heme center. The interactions of these two phenylalanine residues restricted the size of substrates and regulates CPO’s enantioselectivity. F186A- and F103A/F186A-CPO were generated and characterized where the rate of peroxidation and epoxidation were significantly enhanced at the expense of halogenation and dismutation activities. Our results demonstrated that Phe186 played a subtler role relative to Phe103 in terms of substrate specificity and product enantioselectivity of CPO.

Trace amounts of pharmaceuticals have been detected in water, from nanograms per liter to micrograms per liter, and have a negatively effect in the aquatic environment and an increased potential risk of drug poisoning for human and animals. In order to address the problem, drug degradation catalyzed by chloroperoxidase (CPO) has been investigated. CPO is a heme-containing glycoprotein secreted by the fungus, Caldariomyces fumago, it catalyzes two major types of oxidations, two one-electron oxidations as catalyzed by most peroxidases and two-electron oxidations which are rare for conventional peroxidases. Five common drugs from a variety of classes which were persistent in the environment have been studied. The metabolites of each drug were identified and the pathways of degradation were proposed. All of them were found to be 100% degradation efficiency in the CPO-H2O2-Cl- system which the catalyzation only required low concentration of CPO (normally nanomolar level) as well as relatively low concentration of H2O2 as cofactor. This degradation method is economic and highly efficient, the results of my experiment extensively support the hypothesis that CPO has a great potential in the environmental application. A new mutant of CPO has been constructed to investigate the role of histidine 105 in the active site of distal pocket. Histidine 105 was suggested to play an essential role in modulating the chlorination activity by forming hydrogen bond with glutamic acid 183, histidine has been replaced by arginine to generate CPO H105R mutant. The construction and transformation were a success but the protein was expressed as apoenzyme, suggesting the mutagenesis to a larger arginine residue at position105 disturbed the heme incorporation.

Peroxidasen des Typs ClassII sowie die Chlorperoxidase waren für mehrere Jahrzehnte die einzigen bekannten sekretorischen Hämperoxidasen aus Pilzen. Im Jahr 2004 wurde eine neue, ungewöhnliche Hämperoxidase aus dem Speisepilz Agrocybe aegerita isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese Peroxidase, heute offiziell Unspezifische Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) genannt, vereint in sich Eigenschaften sowohl intrazellulärer Cytochrom-P450-Enzyme als auch klassischer extrazellulärer, pilzlicher Peroxidasen des Typs ClassII. In dieser Arbeit wurden für den UPO-Modellorganismus A. aegerita und für andere UPO-produzierende Pilze erstmals Nukleotidsequenzen der Enzyme ermittelt und phylogenetisch analysiert. Die Genome zweier Stämme von A. aegerita wurden sequenziert. Die Ergebnisse legen nahe, dass UPOs gemeinsam mit der Chlorperoxidase Vertreter einer phylogenetisch alten Protein-Superfamilie (Häm-Thiolat-Peroxidasen) darstellen, die in allen echten Pilzen (Eumycota) zu finden ist, aber in echten Hefen und einigen hefeartig wachsenden Basidiomyceten sekundär reduziert wurde. Die natürliche Funktion dieser extrazellulären Enzyme ist bislang unbekannt. Im Labor können UPOs ausschließlich unter Verwendung leguminosenhaltiger Kulturmedien induziert werden. Die induzierende Komponente aus Soja wurde in dieser Arbeit als proteinogen identifiziert. Eine zweite neue, extrazelluläre Hämperoxidase-Superfamilie ausserhalb der ClassII-Peroxidasen wurde im Totholz bewohnenden Pilz Bjerkandera adusta entdeckt. Die als DyP-type-Peroxidasen benannten Enzyme (DyP, EC 1.11.1.19) wurden später auch in anderen Pilzen gefunden, von denen in dieser Arbeit ebenso Nukleotidsequenzen erhalten wurden. Die phylogenetische Analyse ergab, dass pilzliche Sequenzen der DyP-type-Peroxidase-Superfamilie sehr ungleichmäßig sowie ausschließlich in den Genomen höherer Pilze (Dikarya) verteilt sind und vermutlich einen prokaryotischen Ursprung haben. Transkripte von UPO- und DyP-Genen wurden in nahezu allen untersuchten Laubstreuproben aus unterschiedlich stark genutzten Waldgebieten der Deutschen Biodiversitätsexploratorien nachgewiesen. Dies legt eine biologische Funktion dieser neuen Hämperoxidase-Superfamilien in entsprechenden Habitaten nahe. / For several decades ClassII peroxidases and chloroperoxidase have been the only known secretory heme peroxidases from fungi. In 2004, a novel heme peroxidase was isolated and characterized from the edible mushroom Agrocybe aegerita. This enzym, nowadays called unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1), combines characteristics of intracellular cytochrom P450 enzymes as well as extracellular classII fungal peroxidases. In the course of this PhD work, for the first time nuleotide sequences of UPO model organism A. aegerita as well as other UPO producing fungi were obtained and phylogenetically analyzed. The whole-genome sequences of two strains of A.aegerita were obtained. The results suggest that UPOs and the chloroperoxidase together represent a phylogenetically old protein superfamily (of heme-thiolate peroxidases) that is found in all true fungi (Eumycota), but is secondarily reduced in true yeasts and a few yeast-like growing basidiomycetes. The natural function of these enzymes remains unclear. In the laboratory, fungi secrete UPOs solely in legume-containing culture media. The eliciting component of the legume soybean has been determined as proteinogenic. A second novel heme peroxidase superfamily outside the classII peroxidases was discovered in deadwood inhabiting fungus Bjerkandera adusta. These so-called DyP-type peroxidases (DyP, EC 1.11.1.19) were later found expressed in several other fungi for which nucleotide sequences were obtained in this work, too. Phylogenetical analysis revealed that fungal DyP sequences are exclusively but very unequally distributed in genomes of higher fungi (Dikarya). Fungal DyP sequences are seemingly decended from prokaryotes. Transcripts encoding UPOs and DyPs were found in almost every sample of leave litter (derived from forests with different intensity of human usage) investigated. This suggests biological functions of these new heme peroxidase superfamilies in respective habitats.

Peroxidasen des Typs ClassII sowie die Chlorperoxidase waren für mehrere Jahrzehnte die einzigen bekannten sekretorischen Hämperoxidasen aus Pilzen. Im Jahr 2004 wurde eine neue, ungewöhnliche Hämperoxidase aus dem Speisepilz Agrocybe aegerita isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese Peroxidase, heute offiziell Unspezifische Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) genannt, vereint in sich Eigenschaften sowohl intrazellulärer Cytochrom-P450-Enzyme als auch klassischer extrazellulärer, pilzlicher Peroxidasen des Typs ClassII. In dieser Arbeit wurden für den UPO-Modellorganismus A. aegerita und für andere UPO-produzierende Pilze erstmals Nukleotidsequenzen der Enzyme ermittelt und phylogenetisch analysiert. Die Genome zweier Stämme von A. aegerita wurden sequenziert. Die Ergebnisse legen nahe, dass UPOs gemeinsam mit der Chlorperoxidase Vertreter einer phylogenetisch alten Protein-Superfamilie (Häm-Thiolat-Peroxidasen) darstellen, die in allen echten Pilzen (Eumycota) zu finden ist, aber in echten Hefen und einigen hefeartig wachsenden Basidiomyceten sekundär reduziert wurde. Die natürliche Funktion dieser extrazellulären Enzyme ist bislang unbekannt. Im Labor können UPOs ausschließlich unter Verwendung leguminosenhaltiger Kulturmedien induziert werden. Die induzierende Komponente aus Soja wurde in dieser Arbeit als proteinogen identifiziert. Eine zweite neue, extrazelluläre Hämperoxidase-Superfamilie ausserhalb der ClassII-Peroxidasen wurde im Totholz bewohnenden Pilz Bjerkandera adusta entdeckt. Die als DyP-type-Peroxidasen benannten Enzyme (DyP, EC 1.11.1.19) wurden später auch in anderen Pilzen gefunden, von denen in dieser Arbeit ebenso Nukleotidsequenzen erhalten wurden. Die phylogenetische Analyse ergab, dass pilzliche Sequenzen der DyP-type-Peroxidase-Superfamilie sehr ungleichmäßig sowie ausschließlich in den Genomen höherer Pilze (Dikarya) verteilt sind und vermutlich einen prokaryotischen Ursprung haben. Transkripte von UPO- und DyP-Genen wurden in nahezu allen untersuchten Laubstreuproben aus unterschiedlich stark genutzten Waldgebieten der Deutschen Biodiversitätsexploratorien nachgewiesen. Dies legt eine biologische Funktion dieser neuen Hämperoxidase-Superfamilien in entsprechenden Habitaten nahe.:Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung 5 2. Theoretische Grundlagen 7 2.1. Hämperoxidasen 7 2.1.1. Häm – Pigment des Lebens 7 2.1.2. Mechanismus der Hämperoxidase-vermittelten Katalyse 10 2.1.3. Systematik 16 2.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 36 2.3. DyP-type-Peroxidasen 38 3. Anliegen der Arbeit 41 4. Material und Methoden 43 4.1. Organismen 43 4.2. Chemikalien 53 4.3. Methoden 55 4.3.1. Kultivierung 55 4.3.2. Nukleinsäure-Isolation und cDNA-Synthese 56 4.3.3. PCR 57 4.3.4. Klonierung und DNA-Sequenzierung 62 4.3.5. Protein-Sequenzierung 62 4.3.6. Sequenzierungsstrategien 63 4.3.7. Genomsequenzierungen 73 4.3.8. Transkriptomsequenzierung 76 4.3.9. Phylogenetische Analysen 77 4.3.10. Vorhersage von Gen- und Protein-Eigenschaften 79 4.3.11. Photometrische Enzymaktivitätsmessung 80 4.3.12. Proteinkonzentrationsbestimmung 83 4.3.13. SDS-PAGE 83 4.3.14. Hämperoxidasen in der Streuschicht von Laubwäldern 83 4.3.15. UPO-Induktionsversuche 85 4.3.16. Partielle Charakterisierung sekretierter Peptidasen im Sojamedium 89 5. Ergebnisse 91 5.1. Häm-Thiolat-Peroxidasen 91 5.1.1. Sequenzen 91 5.1.2. Phylogenetische Analyse 110 5.1.3. UPO-Geninventar und UPO-Aktivität im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 113 5.1.4. Physiologie der UPO-Bildung in A. aegerita TM-A1 116 5.2. DyP-type-Peroxidasen 126 5.2.1. Sequenzen charakterisierter Enzyme 126 5.2.2. Sequenzen hypothetischer Enzyme 130 5.2.3. Phylogenetische Analyse 135 5.3. Genom- und Transkriptomsequenzierung von A. aegerita TM-A1 und AaN 137 5.4. Hämperoxidasen in Umweltproben 142 6. Diskussion 143 6.1. Sekretorische Peroxidasen aus Pilzen 143 6.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 144 6.2.1. UPO-Geninventar und -expression im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 147 6.2.2. Induktion der Unspezifischen Peroxygenase in A. aegerita TM-A1 150 6.2.3. Biologische Funktion 152 6.2.4. Phylogenetik 154 6.2.5. Cytochrom-P450-Enzyme 159 6.2.6. Ein Vorschlag zur Nomenklatur 165 6.3. DyP-type-Peroxidasen 166 6.3.1. Differentiell exprimierte Isoenzyme 166 6.3.2. Hypothetische Sequenzen 168 6.3.3. Biologische Funktion 168 6.3.4. Prokaryotischer Ursprung pilzlicher DyP-type-Peroxidasen 169 6.3.5. DyPs sind Teil der strukturellen CDE-Superfamilie 170 6.3.6. Heterologe Expression 171 7. Ausblick 173 8. Thesen 177 Literaturverzeichnis 179 A. Peptidsequenzen 225 B. Genspezifische Oligonukleotide 231 C. Verbreitung von HTP-Sequenzen 241 D. Verbreitung von DyP-Sequenzen 255 E. Charakterisierte ClassII-Peroxidasen 261 F. ClassII-Aktivitäten in Reinkulturen 267 G. Physiologie von A. aegerita TM-A1 in Sojamedien 271 H. Einfluss der Soja-Inhaltsstoffe auf die UPO-Produktion in A. aegerita TM-A1 275 I. Inhaltsstoffe von Sojamedien 283 J. Transkriptomanalyse A. aegerita TM-A1 285 K. Bakterielle DyP-type-Peroxidasen 289 L. Publikationen 293 Danksagung 371 Rechtliche Erklärungen 373 / For several decades ClassII peroxidases and chloroperoxidase have been the only known secretory heme peroxidases from fungi. In 2004, a novel heme peroxidase was isolated and characterized from the edible mushroom Agrocybe aegerita. This enzym, nowadays called unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1), combines characteristics of intracellular cytochrom P450 enzymes as well as extracellular classII fungal peroxidases. In the course of this PhD work, for the first time nuleotide sequences of UPO model organism A. aegerita as well as other UPO producing fungi were obtained and phylogenetically analyzed. The whole-genome sequences of two strains of A.aegerita were obtained. The results suggest that UPOs and the chloroperoxidase together represent a phylogenetically old protein superfamily (of heme-thiolate peroxidases) that is found in all true fungi (Eumycota), but is secondarily reduced in true yeasts and a few yeast-like growing basidiomycetes. The natural function of these enzymes remains unclear. In the laboratory, fungi secrete UPOs solely in legume-containing culture media. The eliciting component of the legume soybean has been determined as proteinogenic. A second novel heme peroxidase superfamily outside the classII peroxidases was discovered in deadwood inhabiting fungus Bjerkandera adusta. These so-called DyP-type peroxidases (DyP, EC 1.11.1.19) were later found expressed in several other fungi for which nucleotide sequences were obtained in this work, too. Phylogenetical analysis revealed that fungal DyP sequences are exclusively but very unequally distributed in genomes of higher fungi (Dikarya). Fungal DyP sequences are seemingly decended from prokaryotes. Transcripts encoding UPOs and DyPs were found in almost every sample of leave litter (derived from forests with different intensity of human usage) investigated. This suggests biological functions of these new heme peroxidase superfamilies in respective habitats.:Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung 5 2. Theoretische Grundlagen 7 2.1. Hämperoxidasen 7 2.1.1. Häm – Pigment des Lebens 7 2.1.2. Mechanismus der Hämperoxidase-vermittelten Katalyse 10 2.1.3. Systematik 16 2.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 36 2.3. DyP-type-Peroxidasen 38 3. Anliegen der Arbeit 41 4. Material und Methoden 43 4.1. Organismen 43 4.2. Chemikalien 53 4.3. Methoden 55 4.3.1. Kultivierung 55 4.3.2. Nukleinsäure-Isolation und cDNA-Synthese 56 4.3.3. PCR 57 4.3.4. Klonierung und DNA-Sequenzierung 62 4.3.5. Protein-Sequenzierung 62 4.3.6. Sequenzierungsstrategien 63 4.3.7. Genomsequenzierungen 73 4.3.8. Transkriptomsequenzierung 76 4.3.9. Phylogenetische Analysen 77 4.3.10. Vorhersage von Gen- und Protein-Eigenschaften 79 4.3.11. Photometrische Enzymaktivitätsmessung 80 4.3.12. Proteinkonzentrationsbestimmung 83 4.3.13. SDS-PAGE 83 4.3.14. Hämperoxidasen in der Streuschicht von Laubwäldern 83 4.3.15. UPO-Induktionsversuche 85 4.3.16. Partielle Charakterisierung sekretierter Peptidasen im Sojamedium 89 5. Ergebnisse 91 5.1. Häm-Thiolat-Peroxidasen 91 5.1.1. Sequenzen 91 5.1.2. Phylogenetische Analyse 110 5.1.3. UPO-Geninventar und UPO-Aktivität im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 113 5.1.4. Physiologie der UPO-Bildung in A. aegerita TM-A1 116 5.2. DyP-type-Peroxidasen 126 5.2.1. Sequenzen charakterisierter Enzyme 126 5.2.2. Sequenzen hypothetischer Enzyme 130 5.2.3. Phylogenetische Analyse 135 5.3. Genom- und Transkriptomsequenzierung von A. aegerita TM-A1 und AaN 137 5.4. Hämperoxidasen in Umweltproben 142 6. Diskussion 143 6.1. Sekretorische Peroxidasen aus Pilzen 143 6.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 144 6.2.1. UPO-Geninventar und -expression im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 147 6.2.2. Induktion der Unspezifischen Peroxygenase in A. aegerita TM-A1 150 6.2.3. Biologische Funktion 152 6.2.4. Phylogenetik 154 6.2.5. Cytochrom-P450-Enzyme 159 6.2.6. Ein Vorschlag zur Nomenklatur 165 6.3. DyP-type-Peroxidasen 166 6.3.1. Differentiell exprimierte Isoenzyme 166 6.3.2. Hypothetische Sequenzen 168 6.3.3. Biologische Funktion 168 6.3.4. Prokaryotischer Ursprung pilzlicher DyP-type-Peroxidasen 169 6.3.5. DyPs sind Teil der strukturellen CDE-Superfamilie 170 6.3.6. Heterologe Expression 171 7. Ausblick 173 8. Thesen 177 Literaturverzeichnis 179 A. Peptidsequenzen 225 B. Genspezifische Oligonukleotide 231 C. Verbreitung von HTP-Sequenzen 241 D. Verbreitung von DyP-Sequenzen 255 E. Charakterisierte ClassII-Peroxidasen 261 F. ClassII-Aktivitäten in Reinkulturen 267 G. Physiologie von A. aegerita TM-A1 in Sojamedien 271 H. Einfluss der Soja-Inhaltsstoffe auf die UPO-Produktion in A. aegerita TM-A1 275 I. Inhaltsstoffe von Sojamedien 283 J. Transkriptomanalyse A. aegerita TM-A1 285 K. Bakterielle DyP-type-Peroxidasen 289 L. Publikationen 293 Danksagung 371 Rechtliche Erklärungen 373