L’énantiomérisme est un sujet majeur dans des domaines divers, en particulier celui de la pharmacie (principe actifs et métabolites). La commercialisation de médicaments sous forme racémique a longtemps été privilégiée au dépend d’éventuels effets secondaires. Depuis les années 90, le développement du nombre d’entités énantiomériquement pures est en hausse, notamment grâce au développement des techniques de séparation. La chromatographie chirale, à l’aide de support énantiosélectif, s’est très vite imposée pour la résolution rapide et directe de stéréoisomères. Cependant, la faible compréhension des mécanismes intervenant dans la reconnaissance chirale limite un choix rationnel reposant sur la structure des composés chiraux, conduisant à une procédure de développement de méthode de séparation chirale systématique, fastidieuse et coûteuse d’essais et erreurs. Ce projet de recherche se situe à l’interface des sciences analytiques et de la chémo-informatique. Il consiste en une amélioration de nos connaissances sur le mécanisme de reconnaissance chirale afin d’aborder le développement de méthode chirale de manière plus rigoureuse. / The subject of enantiomer separation is a major issue in various fields, particularly pharmaceuticals (metabolites and active principle). To prepare pharmaceutical formulations, the racemic form has long been favored at the expense of possible side effects. Since the 90s, the development of the number of enantiomerically pure entities is rising, particularly through the development of separation techniques. Chiral chromatography using enantioselective stationary phases is an excellent technique for fast and direct resolution of stereoisomers. However, limited understanding of the mechanism leads to tedious and expensive trial-and-error systematic chiral method development. No clear guideline for choosing a chromatographic system is available for a new chiral drug. In this project, we wish to achieve a better knowledge of enantioselective separation techniques in order to help in the choice of separation method that will be the most appropriate for any given chiral separation. This project is based on the rationalization of large amounts of experimental data with the help of modelling and chemometric techniques to unravel the enantioselective recognition mechanism.

Le développement de molécules chirales est devenu un enjeu majeur pour l’industrie pharmaceutique. Lors de la mise au point d’un nouveau principe actif, la chromatographie en phase supercritique (CPS) sur phases stationnaires énantiosélectives, est devenue une méthode incontournable pour l’analyse ou la purification d’énantiomères. Il n’en demeure pas moins que certains composés tels que les composés basiques restent délicats à analyser par cette technique et que l’ajout d’un additif basique dans la phase mobile est très souvent nécessaire. La quantité d’additif ajoutée dans la phase mobile est souvent choisie de manière arbitraire en se basant sur les spécifications des fournisseurs de phases stationnaires et sur les travaux publiés dans le domaine, sans se soucier de l’effet potentiel sur la résolution d’une modification de sa concentration. Ce travail de thèse a démontré l’importance de la concentration en additif dans la phase mobile lors de l’analyse de mélanges d’énantiomères par CPS, avec notamment des effets significatifs sur l’énantiosélectivité allant jusqu’à une inversion de leur ordre d’élution selon la concentration en additif. Dans un deuxième temps cette étude a consisté en une amélioration de notre compréhension des modes d’actions de l’additif, sur la phase stationnaire et sur la phase mobile permettant de poser des hypothèses sur les effets observés lors de la séparation d’énantiomères. La dernière partie est consacrée à la présentation de différents exemples, justifiant l’intérêt de moduler la concentration en additif lors de séparations d’énantiomères. / Nowadays, the development of chiral molecule is a strategic issue for the pharmaceutical industry. During the development of a new molecular entity, supercritical fluid chromatography using enantioselective stationary phases is essential for the analysis or the purification of racemates. Despite the advantages of SFC, the analysis of some compounds like basic compounds may still be a challenge. Their analysis most of the time, requires an additive in the mobile phase. In many cases additives concentration is chosen arbitrarily, based on the columns supplier guidelines and work already published, regardless of the impact of the additive concentration on the resolution. This work has shown the impact of the additives concentration for the analysis of enantiomers by SFC, in particular a significative impact on the enantioselectivity of chiral stationary phases, with for some of them a reversal elution order depending on the additive concentration. The second objective is to improve our knowledge on the mechanism of action of the additive both on the stationary phase and the mobile phase. The last part is dedicated to the presentation of a few examples highlighting the positive impact of the variation of the additives concentration for enantiomer separation.

Cette thèse vise à démontrer la pertinence de la chromatographie en phase supercritique (SFC) et de son couplage à la spectrométrie de masse tandem haute résolution (HRMS/MS) quant à l’étude de produits naturels en mélange complexe. Pour y parvenir trois projets ont été menés en parallèle.Une méthode d’analyse structurale ciblée sur les acétogénines d’Annonaceae a été développée. Le recours à une cationisation post-colonne par des sels de lithium a permis d’obtenir les informations structurales recherchées. Des études ont également été menées quant à l’influence de la nature du cation sur la conformation de l’adduit formé et les voies de fragmentation observées.Une séparation de composés polaires et ionisables a également été mise au point à travers l’étude des nucléosides modifiés de l’ARN. La SFC-HRMS permet la séparation et l’étude d’un grand nombre de modifications et constitue donc un nouvel outil d’analyse pour le biologiste.Pour finir, une étude en lipidomique globale a également été entreprise. Bien que préliminaires, les premiers résultats semblent très prometteurs avec pour but de développer des méthodes d’analyses non ciblées associés à des outils d’annotation automatique.Pour chaque projet, la pertinence de nos approches a été vérifiée par l’étude d’échantillons réels et complexes permettant de tirer des conclusions réalistes quant aux possibilités de la SFC-HRMS/MS pour l’étude de composés naturels. / This PhD work aims to demonstrate the relevance of supercritical fluid chromatography (SFC) and its hyphenation to high resolution tandem mass spectrometry (HRMS/MS) in the field of natural product analysis. Three different research projects were carried out.A new strategy for structural analysis of Annonaceous acetogenins was developed by SFC and targeted HRMS/MS including post-column lithium cationisation to give access to the relevant structural information. Investigations were conducted to observe the influence of cations onto the gas-phase conformation and fragmentation pathways.A separation of polar and ionisable compounds was also developed using modified nucleosides from RNA as models. The SFC-HRMS method led to the separation and analysis of several tens of modifications and demonstrated to be a new performant analytical tool for biologists.Finally, a global lipidomic approach was optimized. Preliminary results look compatible with the development of untargeted approaches using automatic annotation tools.For each project, the relevance of our work was evaluated analyzing complex samples to obtain a realistic point of view of the capabilities for SFC-HRMS/MS systems for natural product studies.

L’objectif de ce projet doctoral a été de coupler la chromatographie en phase supercritique (SFC) avec un spectromètre de masse haute résolution pour l’analyse de substances naturelles apolaires. La SFC est une technique dite « verte » contrairement à la chromatographie liquide en phase normale (NPLC), très consommatrice de solvants organiques toxiques pour l’environnement, puisque la phase mobile est principalement constituée de CO2. Le CO2 ayant une faible viscosité, cela implique une diffusivité, des débits élevés et des temps d’analyse courts. Notre attention a été focalisée sur des molécules apolaires : les lipides. Le but était de mettre au point des dosages dans des matrices alimentaires et biologiques et de débuter une approche lipidomique d’étude de la maladie de Parkinson. La première partie a été dédiée au développement du système SFC avec une détection UV, prêté par le constructeur Agilent Technologies. La première étude s’est portée sur 6 composés de la famille des vitamines A. Une phase d’optimisation a été réalisée afin d’obtenir une séparation satisfaisante des composés, en testant différents paramètres chromatographiques comme le type de phase stationnaire ou encore la composition de la phase mobile, afin d’obtenir une résolution optimale. Ensuite, des études de linéarité et de répétabilité ont été réalisées et des limites de détection et de quantification ont été déterminées afin d’obtenir une méthode fiable et robuste. Une deuxième partie a concerné la mise en place du couplage entre la SFC et un spectromètre de masse de type quadripôle-temps de vol (Q-TOF), afin d’améliorer la spécificité et la sensibilité des analyses. Différentes sources d’ionisation ont été utilisées : ESI, APCI et APPI. Chacune des sources présente des modes d’ionisation différents, qui permettent de pouvoir balayer une large gamme de polarité des analytes. Nous avons choisi 8 dérivés de la vitamine E, composés apolaires pour lesquels la SFC paraît être la technique d’analyse idéale. La séparation de ces composés a été optimisée de façon à obtenir une bonne résolution chromatographique et un temps d’analyse minimal. L’ionisation des composés est réalisée avec les 3 sources disponibles en faisant varier les paramètres de sources ou encore le solvant « make-up », de façon à obtenir une sensibilité optimale. La source APPI a été finalement choisie après une étude sur les performances de la méthode. Cette source présente une bonne répétabilité, linéarité et des limites de détection de l’ordre de celles retrouvées dans la littérature par HPLC-MS. Nous avons ensuite réalisé la quantification des ces composés dans 2 types de matrices alimentaire et biologique : l’huile de soja et le plasma de rat. Une troisième partie a été débutée sur le profilage de lipides à polarités variées par SFC-MS. Cette technique se révèle idéale de par la faible polarité de ces composés et leur absence d’absorbance dans le domaine UV. En effet, l’intégrité des lipides peut être altérée suite aux dommages causés par les radicaux libres, qui sont potentiellement impliqués dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Il parait primordial de développer des outils analytiques présentant une haute sensibilité et résolution et la possibilité d’accéder aux informations structurales. La source d’ionisation ESI nous a permis de détecter 12 lipides sur les 20 sous-classes analysées en mode positif et 8 lipides en mode négatif. Une application a été réalisée sur un échantillon de plasma humain. Il serait intéressant à l’avenir d’effectuer cette étude en utilisant la source APPI, source propice à l’analyse structurale de lipides et présentant une bonne sensibilité et répétabilité. Ce couplage SFC-MS, présentant une bonne sensibilité et répétabilité, sera par la suite étendu à l’analyse de lipides dans diverses matrices biologiques et pourra à l’avenir être appliqué à l’étude de nouveaux biomarqueurs et au screening rapide d’un grand nombre d’échantillons / The aim of this PhD project was to couple supercritical fluid chromatography (SFC) with a high resolution mass spectrometer for apolar natural compounds analysis. Because mobile phase is principally constituted of CO2, SFC is called “green technic” contrary to normal phase liquid chromatography (NPLC), which uses lot of organic solvents toxic for environment. The CO2 presents a low viscosity, in this way high diffusivity and flow rate, and lower analysis times are obtained. Our work was focused on apolar molecules: the lipids. The aim was to quantify molecules in alimentary and biological matrices and to a lipidomic approach to study Parkinson disease. The first part was to develop the system SFC with a UV detection on a system on loan by Agilent Technologies. This first study was carried out on 6 vitamin A compounds. An optimization of chromatographic parameters has been realized in order to obtain a good separation of the compounds. Then, linearity, repeatability, detection and quantification limits have been determined in order to have a reliable and robust method. A second part concerned the coupling of SFC and a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Q-TOF), in order to improve specificity and sensitivity of analysis. Different ionization sources have been tested: ESI, APCI and APPI. Each ion source presents different ionization mode, which permits to analyze a wide range of polarities of compounds. We have chosen 8 vitamin E derivatives, which are apolar compounds for which SFC seems to be well suited. Separation compounds have been optimized in order to have a good chromatographic resolution and a short analysis time. This compounds ionization is realized with the 3 sources, varying ionization parameters and make-up solvent, to have an optimal sensitivity. The APPI source has been chosen after a performance evaluation method. This source presents a good repeatability, linearity and detection limit in the same order of magnitude than those found in the literature by HPLC-MS. Then we have quantified these compounds in alimentary and biological matrices: a soya oil and plasma rat. A third study has been started on lipid profiling with various polarities by SFC-MS. This technic is well suited because of the low polarity of this molecules and their lack of absorbance in the UV range. The integrity of lipids can be altered with damages caused by free radicals, and are potentially involved in neurodegenerative diseases. It is essential to develop analytical systems with a high sensitivity and resolution and the possibility to access to structural information. The ESI source permits to detect 12 lipids on the 20 sub-classes analyzed in positive ion mode and 8 lipids in negative mode. An application has been realized on human plasma. In the future, it will be interesting to analyze these lipids with the APPI source, which is good choice for structural analysis of lipids, with good sensitivity and repeatability. Studies with this SFC-MS system, presenting good sensitivity and repeatability, will be extended to lipid analysis in biological matrices and could be applied to new biomarkers study and for fast screening of a large number of samples