L'objectif principal de cette thèse a été d'étudier et de développer les méthodes électrophorétiques pour la détermination de la charge effective de petits ions, de (bio)macromolécules et de nanoparticules. En effet, la charge effective est un paramètre physico-chimique qui contrôle les interactions électrostatiques et qui permet d'accéder aux taux de condensation des contre-ions dans le cas de polyélectrolytes. Dans une première partie, différents modèles sur la mobilité électrophorétique (Nernst-Einstein, O'Brien-White-Ohshima, Yoon-Kim) ont été comparés pour la détermination de la charge effective à partir des valeurs expérimentales de mobilité électrophorétique et de rayon hydrodynamique. Trois autres méthodes expérimentales basées sur la sensibilité de détection UV en mode indirect, sur la sensibilité de détection en conductimétrie et sur la longueur des zones isotachophorétiques ont été étudiées. Ces méthodes ont été appliquées en particulier à la détermination de la charge effective de dendrimères greffés de la lysine et de polymères utilisés en délivrance de principe actif.Une étude du comportement électrophorétique en fonction de la force ionique nous a mené à proposer une représentation graphique, appelée « slope-plot », permettant de distinguer les solutés en fonction de leur nature (petits ions, polyélectrolytes, nanoparticules). Cette représentation peut s'avérer très utile pour l'optimisation des séparations en électrophorèse capillaire en fonction de la force ionique. / The main objective of this thesis was to study and develop electrophoretic methods for effective charge determination of small ions, (bio)macromolecules and nanoparticles. Effective charge is a physical parameter that controls the electrostatic interactions and allows for the determination of condensed counter-ion fraction in the case of polyelectrolytes. In a first part, different models of electrophoretic mobility (Nernst-Einstein, O'Brien-White-Ohshima, Yoon-Kim) have been compared for effective charge determination from experimental values of electrophoretic mobility and hydrodynamic radius. Three other experimental methods based on the sensitivity of UV detection in indirect mode and in conductivity detection, or on the length of the isotachophoretic zones, were studied. These methods were applied to effective charge determination of dendrigraft poly-L-lysines and on drug delivery polymeric systems. A study of the ionic strength dependence of the electrophoretic mobility leads us to propose a graphical representation, called the slope-plot, allowing for the distinction between solutes according to their nature (small ions, polyelectrolytes, nanopaticles). The slop-plot can also be used for the optimization of electrophoretic separations according to the ionic strength.

Ces travaux de thèse ont permis de mettre en œuvre une méthode de criblage de l'activité antibactérienne des dendrimères greffés de la L-lysine (DGL) par électrophorèse capillaire (EC). Le principe de la méthode est basé sur le suivi du profil électrophorétique des bactéries avant et après leur rencontre avec une bande de composé cationique dont on souhaite cribler l'activité. La mise en œuvre de cette méthode a nécessité plusieurs étapes. Dans la première étape, une nouvelle méthodologie permettant la focalisation, la mobilisation et la quantification des bactéries par EC a été développée. Cette méthode a été appliquée pour la quantification de la flore totale dans des eaux naturelles. Dans la seconde étape, plusieurs revêtements neutres de capillaire ont été comparés pour l'analyse simultanée de composés polycationiques et polyanioniques. Dans la dernière partie, la méthodologie de criblage a été mise en œuvre pour l'étude de l'activité des DGL. / In this work, a new analytical methodology has been implemented for the screening of antibacterial activity of dendrigraft poly-L-lysines (DGL) by capillary electrophoresis (CE). The principle of this methodology is based on the monitoring of the electrophoretic profile of bacteria before and after the meeting with a zone containing the cationic compound to be screened. The implementation of this methodology has required several steps. In a first experimental part, a new methodology has been developed for the focalization, mobilization and quantification of bacteria. This focusing mode has been applied for the quantification of bacteria in natural waters. In a second experimental part, several neutral capillary coatings were compared for the simultaneous CE analysis of polyanionic and polycationic compounds. In the last experimental part, the screening of antibacterial activity has been implemented on DGL.

L’objectif de ce projet doctoral a été de coupler la chromatographie en phase supercritique (SFC) avec un spectromètre de masse haute résolution pour l’analyse de substances naturelles apolaires. La SFC est une technique dite « verte » contrairement à la chromatographie liquide en phase normale (NPLC), très consommatrice de solvants organiques toxiques pour l’environnement, puisque la phase mobile est principalement constituée de CO2. Le CO2 ayant une faible viscosité, cela implique une diffusivité, des débits élevés et des temps d’analyse courts. Notre attention a été focalisée sur des molécules apolaires : les lipides. Le but était de mettre au point des dosages dans des matrices alimentaires et biologiques et de débuter une approche lipidomique d’étude de la maladie de Parkinson. La première partie a été dédiée au développement du système SFC avec une détection UV, prêté par le constructeur Agilent Technologies. La première étude s’est portée sur 6 composés de la famille des vitamines A. Une phase d’optimisation a été réalisée afin d’obtenir une séparation satisfaisante des composés, en testant différents paramètres chromatographiques comme le type de phase stationnaire ou encore la composition de la phase mobile, afin d’obtenir une résolution optimale. Ensuite, des études de linéarité et de répétabilité ont été réalisées et des limites de détection et de quantification ont été déterminées afin d’obtenir une méthode fiable et robuste. Une deuxième partie a concerné la mise en place du couplage entre la SFC et un spectromètre de masse de type quadripôle-temps de vol (Q-TOF), afin d’améliorer la spécificité et la sensibilité des analyses. Différentes sources d’ionisation ont été utilisées : ESI, APCI et APPI. Chacune des sources présente des modes d’ionisation différents, qui permettent de pouvoir balayer une large gamme de polarité des analytes. Nous avons choisi 8 dérivés de la vitamine E, composés apolaires pour lesquels la SFC paraît être la technique d’analyse idéale. La séparation de ces composés a été optimisée de façon à obtenir une bonne résolution chromatographique et un temps d’analyse minimal. L’ionisation des composés est réalisée avec les 3 sources disponibles en faisant varier les paramètres de sources ou encore le solvant « make-up », de façon à obtenir une sensibilité optimale. La source APPI a été finalement choisie après une étude sur les performances de la méthode. Cette source présente une bonne répétabilité, linéarité et des limites de détection de l’ordre de celles retrouvées dans la littérature par HPLC-MS. Nous avons ensuite réalisé la quantification des ces composés dans 2 types de matrices alimentaire et biologique : l’huile de soja et le plasma de rat. Une troisième partie a été débutée sur le profilage de lipides à polarités variées par SFC-MS. Cette technique se révèle idéale de par la faible polarité de ces composés et leur absence d’absorbance dans le domaine UV. En effet, l’intégrité des lipides peut être altérée suite aux dommages causés par les radicaux libres, qui sont potentiellement impliqués dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Il parait primordial de développer des outils analytiques présentant une haute sensibilité et résolution et la possibilité d’accéder aux informations structurales. La source d’ionisation ESI nous a permis de détecter 12 lipides sur les 20 sous-classes analysées en mode positif et 8 lipides en mode négatif. Une application a été réalisée sur un échantillon de plasma humain. Il serait intéressant à l’avenir d’effectuer cette étude en utilisant la source APPI, source propice à l’analyse structurale de lipides et présentant une bonne sensibilité et répétabilité. Ce couplage SFC-MS, présentant une bonne sensibilité et répétabilité, sera par la suite étendu à l’analyse de lipides dans diverses matrices biologiques et pourra à l’avenir être appliqué à l’étude de nouveaux biomarqueurs et au screening rapide d’un grand nombre d’échantillons / The aim of this PhD project was to couple supercritical fluid chromatography (SFC) with a high resolution mass spectrometer for apolar natural compounds analysis. Because mobile phase is principally constituted of CO2, SFC is called “green technic” contrary to normal phase liquid chromatography (NPLC), which uses lot of organic solvents toxic for environment. The CO2 presents a low viscosity, in this way high diffusivity and flow rate, and lower analysis times are obtained. Our work was focused on apolar molecules: the lipids. The aim was to quantify molecules in alimentary and biological matrices and to a lipidomic approach to study Parkinson disease. The first part was to develop the system SFC with a UV detection on a system on loan by Agilent Technologies. This first study was carried out on 6 vitamin A compounds. An optimization of chromatographic parameters has been realized in order to obtain a good separation of the compounds. Then, linearity, repeatability, detection and quantification limits have been determined in order to have a reliable and robust method. A second part concerned the coupling of SFC and a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Q-TOF), in order to improve specificity and sensitivity of analysis. Different ionization sources have been tested: ESI, APCI and APPI. Each ion source presents different ionization mode, which permits to analyze a wide range of polarities of compounds. We have chosen 8 vitamin E derivatives, which are apolar compounds for which SFC seems to be well suited. Separation compounds have been optimized in order to have a good chromatographic resolution and a short analysis time. This compounds ionization is realized with the 3 sources, varying ionization parameters and make-up solvent, to have an optimal sensitivity. The APPI source has been chosen after a performance evaluation method. This source presents a good repeatability, linearity and detection limit in the same order of magnitude than those found in the literature by HPLC-MS. Then we have quantified these compounds in alimentary and biological matrices: a soya oil and plasma rat. A third study has been started on lipid profiling with various polarities by SFC-MS. This technic is well suited because of the low polarity of this molecules and their lack of absorbance in the UV range. The integrity of lipids can be altered with damages caused by free radicals, and are potentially involved in neurodegenerative diseases. It is essential to develop analytical systems with a high sensitivity and resolution and the possibility to access to structural information. The ESI source permits to detect 12 lipids on the 20 sub-classes analyzed in positive ion mode and 8 lipids in negative mode. An application has been realized on human plasma. In the future, it will be interesting to analyze these lipids with the APPI source, which is good choice for structural analysis of lipids, with good sensitivity and repeatability. Studies with this SFC-MS system, presenting good sensitivity and repeatability, will be extended to lipid analysis in biological matrices and could be applied to new biomarkers study and for fast screening of a large number of samples