L’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration (EDUF) est une technique de séparation innovante, particulièrement performante pour le fractionnement sélectif de peptides bioactifs à partir d’hydrolysats enzymatiques. Cependant, les mécanismes de séparation des peptides en EDUF n’ont pas été parfaitement élucidés en raison du caractère complexe des mélanges utilisés. L’objectif de ce travail de thèse était d’étudier la séparation de mélanges peptidiques modèles afin d’identifier les mécanismes régissant la séparation de peptides. Deux peptides synthétiques anionique et cationique ont été sélectionnés. Avant leur séparation par électrodialyse, les deux peptides ont été caractérisés en termes de mobilité électrophorétique, ce qui nous a permis de définir des conditions optimales de migration. Les résultats de séparation de solutions simples puis de mélanges montrent que, dans les conditions opératoires utilisées, les phénomènes limitant le transfert des deux peptides en EDUF sont essentiellement dus à la dissociation de l’eau dans le cas du peptide anionique et au colmatage membranaire dans kjkle cas du peptide cationique. Un ajout de KCl a été effectué dans le but d’augmenter la conductivité du système. Ceci a permis de ralentir la dissociation de l’eau et par conséquent de restaurer le flux initial du peptide anionique. En revanche, l’ajout de KCl n’a pas eu d’effet sur la migration du peptide cationique. Un colmatage important de la membrane échangeuse de cations au cours de l’électrodialyse par ce dernier explique ce phénomène. L’étude confirme par ailleurs que le transfert peptidique dans ce procédé est régi essentiellement par électromigration. / Electrodialysis with ultrafiltration membranes (EDUF) is an innovative and performant separation technique, particularly used for the selective bioactive peptide fractionation from enzymatic hydrolysates. However, considering the solution mixture complexity used, the peptide separation mechanisms in EDUF process remain unclear. The purpose of this thesis was to study a peptides models mixture separation in order to identify the peptides separation mechanisms in EDUF process. Both anionic and cationic synthetic peptides were selected. First, the anionic and cationic peptides were characterized in terms of electrophoretic mobility. For both peptides, electrophoretic mobility was measured in order to define the optimal conditions for their migration. Furthermore, peptide electrodialytic separation results have showed, under the operating conditions used, the important role played by water dissociation on anionic peptide and membrane fouling on cationic peptide electromigration. KCl addition was performed in order to increase the system conductivity and to slow down water splitting, which led to a restore of the anionic peptide initial flux. In contrast, the water dissociation did not affect the cationic peptide electromigration. An important cation exchange membrane fouling caused by the cationic peptide explain this phenomena. The study also confirms that the peptide transfer in EDUF is mainly governed by electromigration.

Grâce à leurs propriétés particulières dues à leur petite taille, les nanomatériaux (dimension < 100 nm) sont utilisés dans de nombreuses applications grand public (cosmétique, matériaux nanostructurés,...). Cependant, leur présence grandissante inquiète car leur impact potentiel sur les humains et l'environnement reste mal connu. Cette étude est consacrée à une compréhension approfondie des interactions physicochimiques et biologiques entre deux modèles cellulaires présents dans l'environnement : Synechocystis (cyanobactérie contribuant au maintien de la biosphère) et Escherichia coli (bactérie des intestins des mammifères) avec des nanoparticules d'oxyde de cérium (abondance environnementale croissante, ex : additif au diesel). <br />La complexité de l'étude des nanoparticules nécessite une approche différente (multidisciplinaire) de celle des tests de toxicité utilisés pour les composés classiques. En effet, nous montrons que les paramètres physicochimiques (stabilité, agrégation, dissolution et état de surface) des nanoparticules dans le milieu de contact, influencent fortement la toxicité observée sur les cellules. De plus, les interactions physicochimiques (floculation, adsorption, mécanismes redox) sont liées au modèle biologique, en particulier à la présence d'exopolysaccharides (chez Synechocystis) comme barrière naturelle entre la paroi cellulaire et les nanoparticules. La composition du milieu de dispersion des nanoparticules (notamment son pH) a aussi une influence majeure sur la toxicité (survie et intégrité membranaire). Tandis que pour E. coli, ce sont majoritairement les nanoparticules qui provoquent la mortalité (confirmé par analyses métabonomiques par RMN).

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion de lipides ainsi que des protéines. L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'&#945;-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. / After the genome, the new challenge is the proteome. We have progressed toward electrophoretic separation of membrane proteins in a medium that they love, a supported lipid bilayer. The main parameter, measured by FRAPP, was the diffusion coefficient of different objects (lipids, proteins). Studying bilayer behaviour has showed that, on particular supports and in a given temperature range, ripple phase can exist, despite the proximity of the support. Adding salt decreases coulombic interactions which turns to increase the diffusion coefficient over several orders of magnitude, reaching the value for a free-standing bilayer in the fluid phase, meanwhile the main characteristic steps of the global gel/fluid transition are still observed. Estimation of the value of the interaction energy has been made and compared to results of a preliminary DSC study. &#945;-Hémolysin self-inserts spontaneously as an heptameric pore in supported bilayers and diffuses freely. Incubating in a gel/fluid mixture leads to protein complex formation. Diffusion varies with size as 1/R2, R being the equivalent radius of the inserted part of the object. Applying an electric field results in an electrophoretic motion where direction and magnitude are modulated by the charge of the object. Electrophoretic mobility varies also as 1/R2. Size dependence, magnitude of mobilities and a simple building protocol allow to hope carrying out soon a real electrophoretic separation of a protein mixture.

L'objectif principal de cette thèse a été d'étudier et de développer les méthodes électrophorétiques pour la détermination de la charge effective de petits ions, de (bio)macromolécules et de nanoparticules. En effet, la charge effective est un paramètre physico-chimique qui contrôle les interactions électrostatiques et qui permet d'accéder aux taux de condensation des contre-ions dans le cas de polyélectrolytes. Dans une première partie, différents modèles sur la mobilité électrophorétique (Nernst-Einstein, O'Brien-White-Ohshima, Yoon-Kim) ont été comparés pour la détermination de la charge effective à partir des valeurs expérimentales de mobilité électrophorétique et de rayon hydrodynamique. Trois autres méthodes expérimentales basées sur la sensibilité de détection UV en mode indirect, sur la sensibilité de détection en conductimétrie et sur la longueur des zones isotachophorétiques ont été étudiées. Ces méthodes ont été appliquées en particulier à la détermination de la charge effective de dendrimères greffés de la lysine et de polymères utilisés en délivrance de principe actif.Une étude du comportement électrophorétique en fonction de la force ionique nous a mené à proposer une représentation graphique, appelée « slope-plot », permettant de distinguer les solutés en fonction de leur nature (petits ions, polyélectrolytes, nanoparticules). Cette représentation peut s'avérer très utile pour l'optimisation des séparations en électrophorèse capillaire en fonction de la force ionique. / The main objective of this thesis was to study and develop electrophoretic methods for effective charge determination of small ions, (bio)macromolecules and nanoparticles. Effective charge is a physical parameter that controls the electrostatic interactions and allows for the determination of condensed counter-ion fraction in the case of polyelectrolytes. In a first part, different models of electrophoretic mobility (Nernst-Einstein, O'Brien-White-Ohshima, Yoon-Kim) have been compared for effective charge determination from experimental values of electrophoretic mobility and hydrodynamic radius. Three other experimental methods based on the sensitivity of UV detection in indirect mode and in conductivity detection, or on the length of the isotachophoretic zones, were studied. These methods were applied to effective charge determination of dendrigraft poly-L-lysines and on drug delivery polymeric systems. A study of the ionic strength dependence of the electrophoretic mobility leads us to propose a graphical representation, called the slope-plot, allowing for the distinction between solutes according to their nature (small ions, polyelectrolytes, nanopaticles). The slop-plot can also be used for the optimization of electrophoretic separations according to the ionic strength.

Les bactériocines de classe IIa présentent une activité antimicrobienne résultant d'un mécanisme d'action ciblant les membranes des bactéries à Gram positif. Cette activité est modulée par différentes caractéristiques des surfaces bactériennes. Les propriétés physico-chimiques de surface de dix-huit souches bactériennes ont été déterminées afin d'étudier le lien entre ces propriétés et les phénotypes de résistance/sensibilité à Cbn BM1. Les résultats obtenus indiquent une grande diversité des propriétés physico-chimiques des surfaces analysées, sans cependant permettre d’établir un lien entre celles-ci et le phénotype de sensibilité/résistance à CbnBM1. Les mécanismes d'action de Cbn BM1 ont ensuite été étudiés sur Carnobacterium maltaromaticum DSM20730 et Listeria monocytogenes EGDe. L'atteinte de l'intégrité physique des membranes plasmiques par l'action de Cbn BM1 montre une hétérogénéité de réponse des populations bactériennes. Ce résultat a été confirmé par microscopie de force atomique in vivo à haute résolution. L'interaction de Cbn BM1 avec les membranes a été mise en évidence par mesure de l'anisotropie de fluorescence. Cette approche a révélé que Cbn BM1 présente des degrés de pénétration différents dans la membrane de C. maltaromaticum DSM20730 par rapport à L. monocytogenes EGDe. L'action de Cbn BM1 conduit cependant, pour les deux souches, à la modification de la force protomotrice membranaire. Ces différentes approches retenues pour l'étude des mécanismes d'action ont révélé que C. maltaromaticum DSM20730 et L. monocytogenes EGDe présentent une sensibilité à Cbn BM1 uniquement lorsque les cellules sont en phase exponentielle de croissance. / The antimicrobial activity of class IIa bacteriocins toward Gram positive bacteria relies on their membrane targeting mechanisms of action. These mechanisms are modulated by the bacterial surface properties. The physico-chemical surface properties of eighteen bacterial strains were determined to link these properties to the resistance/sensitivity to Cbn BM1 of the bacterial strains. In this way, two approaches were undertaken : the microbial adhesion to solvents and electrophoretic mobility measurements. The results show a large diversity of the determined properties among the strains but without establishing a direct link between the surface properties and the resistance/sensitivity phenotypes. Mechanisms of action of the bacteriocin Cbn BM1 on Carnobacterium maltaromaticum DSM20730 and Listeria monocytogenes EGDe were determined. Syto9® and propidium iodide allowed to show the heterogeneity of the bacterial populations toward the alteration of the membrane integrity. The interaction of Cbn BM1 with the bacterial membrane was studied by monitoring the fluorescence anisotropy of DPH and TMA-DPH. The results highlight a difference between the mechanism of action of Cbn BM1 on C. maltaromaticum DSM20730 and on L. monocytogenes EGDe. However, a treatment by Cbn BM1 leads to a perturbation of the component of the proton-motive force of the membrane for both strains. These approaches revealed that these bacterial strains exhibit a sensitivity to Cbn BM1 only when treated in log growth phase. Modification of nano-mechanical properties of C. maltaromaticum DSM20730 after a treatment by Cbn BM1 were assessed by an atomic force microscopy approach.