Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-28T17:46:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1469986 bytes, checksum: e8c4bc08377a4e9b73214f04fb2116fc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-28T17:46:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1469986 bytes, checksum: e8c4bc08377a4e9b73214f04fb2116fc (MD5) Previous issue date: 2017-12-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A suplementação proteica da dieta de novilhas alimentadas com forragens com baixo conteúdo de proteína é importante para garantir o balanço de nitrogênio e a fermentação adequada dos alimentos no rúmen. Bactérias que degradam proteínas e aminoácidos possuem papel essencial no metabolismo de nitrogênio no rúmen e as bactérias hiperprodutoras de amônia (HAB) parecem influenciar a taxa de produção de amônia nesse ecossistema. Neste trabalho, objetivou-se avaliar a utilização de diferentes fontes de substratos nitrogenados e/ou carboidratos por bactérias hiperprodutoras de amônia isoladas do rúmen visando entender as funções desse grupo bacteriano no metabolismo de nitrogênio no rúmen e avaliar os parâmetros ruminais e a diversidade bacteriana in vivo, em novilhas Nelore suplementadas com proteína e energia. Quando os isolados bacterianos foram cultivados em meio suplementado com substratos nitrogenados, foram observadas diferenças na velocidade específica de crescimento entre os substratos analisados. O isolado C116 apresentou maior (P<0,05) velocidade específica de crescimento em Trypticase quando comparado aos demais substratos, porém a cultura com maior densidade óptica neste substrato foi o isolado R96. O isolado C118 apresentou maior (P<0,05) atividade específica de desaminação (AED), entre 713,88 e 872,11 nmol de NH 3 .mg proteína -1 .min -1 , quando cultivado em meio contendo casaminoácidos e peptona de caseína, respectivamente. No entanto, a maior (P<0,05) concentração de amônia (42,18 mmol/L) foi obtida para o isolado R96 quando cultivado em meio com Trypticase e peptona de caseína como fonte de carbono e energia. Todos os isolados apresentaram produção de ácidos orgânicos totais acima de 50,48 mmol/L quando cultivados em meio contendo Trypticase, casaminoácidos ou peptona de caseína. Os isolados cultivados em meio contendo glicose apresentaram maior velocidade especifica de crescimento e densidade óptica > 1,0. O isolado C114 foi a cultura mais versátil em metabolizar os carboidratos glicose, maltose e celobiose. Os principais produtos finais do metabolismo de carboidratos foram: ácido acético, ácido propiônico e ácido láctico. O consumo da glicose esteve associado com a produção de ácido láctico para todos os isolados testados. Os animais que receberam suplementos proteico e energético apresentaram maiores (P<0,05) concentrações de amônia no líquido ruminal quando comparados ao controle sem suplementação. Animais suplementados e não suplementados com proteína e energia apresentaram concentrações semelhantes de proteína microbiana no líquido ruminal. Observou-se efeito do dia de suplementação sobre a concentração final de ácidos orgânicos totais e de acetato no rúmen. A concentração final ruminal de butirato foi maior (P<0,05) nos animais que receberam suplementação. A taxa de degradação da matéria seca foi maior que 90% em todos os animais que receberam diferentes níves de suplementação de proteína e energia. A concentração de DNA microbiano extraído do farelo de soja nos animais que receberam suplementação de proteína frequente, proteína e energia frequente e proteína infrequente foram acima de 1000 ng/μL/g matéria seca. A análise da diversidade bacteriana avaliada por meio da amplificação do gene do rRNA 16S utilizando oligonucleotídeos específicos para os filos Bacteroidetes e Firmicutes revelaram baixa similaridade entre os tratamentos e os tempos de coleta das amostras do farelo de soja. Esses resultados indicam que a composição dos substratos afeta a atividade de desaminação de bactérias hiperprodutoras de amônia e que carboidratos são utilizados preferencialmente pelas HABs como fonte de carbono e energia em meio contendo mistura dos substratos. Além disso, os resultados demonstram que, nas condições avaliadas neste trabalho, a suplementação proteica e energéticia aumenta a concentração de amônia no rúmen, porém os efeitos sobre os demais parâmetros bioquímicos e sobre a microbiota que participa da degradação das fontes de proteína no rúmen são limitados. / Protein supplementation of the diet of cattle fed with low protein content forages is important to ensure nitrogen balance and adequate fermentation of feedstuffs in the rumen. Bacteria that degrade proteins and amino acids play an essential role in the metabolism of nitrogen in the rumen and the hyper-ammonia-producing bacteria (HAB) appear to influence the rate of ammonia production in this ecosystem. The objective of this work was to evaluate the use of different sources of nitrogenous substrates and/or carbohydrates by hyper-ammonia-producing bacteria isolated from the rumen to understand the functions of this bacterial group in the metabolism of nitrogen in the rumen and to evaluate ruminal parameters and bacterial diversity in vivo in Nellore steers supplemented with protein and energy. When bacterial isolates were grown in medium supplemented with nitrogen substrates, differences in the specific growth rate were observed between the substrates analyzed. The isolate C116 presented higher (P<0.05) specific growth rate in Trypticase when compared to the other substrates, but the culture with the highest optical density in this substrate was the isolate R96. The isolate C118 showed a higher (P<0.05) specific activity of deamination (AED), between 713.88 and 872.11 nmol of NH3.mg protein -1 .min -1 , when grown in media containing casamino acids and casein peptone, respectively. However, the highest (P<0.05) ammonia concentration was 42.18 mmol/L obtained for the isolate R96 when growing in media containing Trypticase or casein peptone as sole carbon and energy sources. All isolates presented total organic acid concentrations above 50.48 mmol/L when growing with Trypticase, casamino acids or casein peptone. The isolates cultured in glucose presented higher specific growth rate and optical density > 1.0. The isolate C114 was the most versatile strain in metabolizing the carbohydrates glucose, maltose and cellobiose. The main end products of carbohydrate metabolism were: acetic acid, propionic acid and lactic acid. Glucose consumption was associated with lactic acid production among all isolates. Animals that received proteic and energetic supplements had higher (P<0.05) ammonia concentrations in their ruminal fluid when compared to the controls without supplementation. Animals fed diets that were supplemented or non-supplemented with protein and energy showed similar concentrations of microbial protein in ruminal fluid. The day of supplementation affected the concentration of total organic acids and acetate in the rumen. The final concentration of butyrate in the rumen was higher (P<0.05) in animals receiving supplementation. The rate of dry matter degradation was greater than 90% in all animals that received different levels of protein and energy supplementation. The concentration of microbial DNA extracted from soybean meal in animals receiving frequent protein, frequent energy and protein supplementation and infrequent protein were above 1000 ng/μL/g dry matter. The analysis of the bacterial diversity evaluated by amplification of the 16S rRNA gene using oligonucleotides specific for the Bacteroidetes and Firmicutes phyla revealed low similarity between the treatments and the time of collection of the soybean meal samples. These results indicate that the composition of the substrates affects the deamination activity of hyper-ammonia-producing bacteria and that carbohydrates were used preferentially by the HABs as carbon and energy sources in media containing mixed substrates. In addition, these results demonstrate, under the conditions evaluated in this work, that protein and energy supplementation increases the concentration of ammonia in the rumen, but the effects on the other biochemical parameters and on the microbiota that participates in the degradation of protein sources in the rumen are limited.