Near IR (NIR) sensitive Au-Au₂S nanoparticles were prepared by mixing HAuCl₄ and Na₂S in aqueous solutions. An anti-tumor drug, cis-platin, was adsorbed onto Au-Au₂S nanoparticle surface via the 11-mercaptoundecanoic acid layers. The results showed that the degree of adsorption of cis-platin onto Au-Au₂S nanoparticles was controlled by the pH value of solution, and the drug release was sensitive to NIR irradiation. The cis-platin loaded Au-Au₂S nanoparticles can be potentially applied as NIR activated drug delivery carrier. / Singapore-MIT Alliance (SMA)

Die Identifizierung von Apoptose-modifizierten Proteinen erfolgte durch Proteomanalyse per 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie. Zunächst wurde eine 2DE-Datenbank errichtet, die im Internet zugänglich ist. Die Identifikation von Proteinen durch Peptidmassenfingerabdruck konnte durch Verwendung einer zweiten Matrix verbessert werden. Die Analyse ausgelassener tryptischer Spaltstellen, N-terminaler Pyroglutamatbildung und Oxidation von Tryptophan konnte die Identifikation von Proteinen mittels Peptidmassenfingerabdruck verbessern. Die Apoptose wurde über den Fas-Rezeptor-Signalweg oder durch DNA-Schädigung mittels Cis-Platin eingeleitet und das Totallysat oder die Kompartimente von Jurkat T-Zellen der Proteomanalyse unterworfen. Große Übereinstimmungen der beiden Prozesse wurden festgestellt. 95 Apoptose-modifizierte Proteine wurden identifiziert, wovon 78 Proteine bisher unbekannt für den Apoptoseprozess waren. Auffällig war, dass 40 % der Proteine RNA-Bindungsmotive enthielten und das 21 Onkoprotein oder Onkoprotein-interagierende Proteine identifiziert wurden. Für 39 Proteine konnten bisher proteolytische Spaltungen vorausgesagt werden. Eine Fülle von Informationen wurde über putative Translokationen der Proteine erhalten. Für das Protein p54nrb wurden drei Caspase-3 Spaltstellen durch die Einführung von Mutationen und die Abhängigkeit der Caspase-3 Spaltung von RNA bewiesen. Mitochondriale ribosomale Proteine von Mensch, Maus und Ratte wurden durch Abgleichung von EST-Datenbanken mit partiellen Aminosäuresequenzen aus dem Rind bestimmt. Die Konservierung der Sequenzen der Säugetierproteine der mitochondrialen ribosomalen Proteinen war geringer als von den bekannten cytosolischen ribosomalen Proteinen. Weiterhin wurden unterschiedliche Ergebnisse bzgl. der mitochondrialen Signalsequenzen der Proteine gefunden. RNA-Protein-Wechselwirkungen im Ribosom wurden nach Quervernetzung auf einzelne Aminosäuen bzw. Nukleotide bestimmt. Die Daten wurden zur Verbesserung von ribosomalen Modellen verwendet. Die mittlerweile erhaltenen Kristallstrukturen des Ribosoms zeigten, dass die Ergebnisse der Quervernetzungsexperimente mit den tatsächlichen RNA-Protein-Wechselwirkungen weitgehend übereinstimmen. Die Affinität von verschiedenen Komponenten zu einem Zielmolekül zur Bildung von nicht-kovalenten RNA-Peptid-Wechselwirkungen wurde mit Hilfe von MALDI-MS ermittelt. Die Interaktionen sind stark abhängig von der Anzahl der Arginine. / Apoptosis-modified proteins were identified by proteome analysis via 2D gel electrophoresis and mass spectrometry. First, a internet-accessible 2DE database was rendered. The identification of the proteins by peptide mass fingerprinting was improved using a second matrix. The analysis of missed tryptic cleavage sites, the formation of N-terminal pyroglutamine and oxidation of tryptophan could improve the identification of proteins by peptide mass fingerprinting. Apoptosis was induced via the Fas-receptor signaling pathway or by means of DNA damage by cis-platin. The total lysate and the compartments of Jurkat T cells were analyzed by proteome analysis. High similarities between both processes were observed. 95 apoptosis-modified proteins were identified, 78 of these were until now unknown to be involved in apoptosis. Noticeable, 40% of the proteins include a RNA-binding motif and 21 oncogene or oncogene-interacting proteins were identified. A proteolytic cleavage could be predicted for 39 proteins. Some information was received about the putative translocation of the proteins. Three caspase-3 cleavage sites were shown for the protein p54nrb with the incorporation of mutations. Furthermore, the caspase-3 cleavage was dependent on the occurrence of RNA. Mitochondrial ribosomal proteins of human, mouse and rat were determined by screening of EST-databases with partial amino acid sequences from bovine. The conservation of sequences of mammalian proteins of the mitochondrial ribosomal proteins was less than for known cytosolic ribosomal proteins. Furthermore, different results were obtained considering mitochondrial signal sequences. RNA-protein interaction within the ribosome were determined on single amino acids and nucleotides, respectively, after cross-linking. These data were used to improve models of the ribosome. The in the meantime obtained 3D-structures of the ribosome showed high consistency with the revealed RNA-protein interaction sites after cross-linking. The affinity of different components to a target molecule to form RNA-peptide interactions was determined by MALDI-MS. The interactions were strongly dependent on the number of arginines.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques localisées aux extrémités des chromosomes. Ils jouent un rôle important dans le maintien de l’information génétique, la stabilité et la protection des extrémités chromosomiques. Les télomères sont composés de séquences d’ADN répétées riches en guanines (TTAGGG) et des protéines télomériques qui les protègent. Parmi celles-ci, TRF1 et TRF2 se fixent directement sur le double brin. Toute modification de la structure des télomères (composition en protéines télomériques, raccourcissement de leur longueur, dommages) peut entrainer la mort des cellules cancéreuses. Ainsi les télomères sont considérés comme des cibles thérapeutiques. Etant riches en guanines adjacentes, les télomères sont donc des cibles potentielles du cis-platine, agent pharmacologique utilisé dans le traitement d’un certain nombre de tumeurs. Nous avons analysé, sur deux lignées de cancer d’ovaire A2780 sensibles et résistantes au cis- platine, les modifications éventuelles de la structure de leurs télomères après traitement par le cis-platine et quantifié le cis-platine fixé au niveau des télomères afin de déterminer s’il pourrait être l’origine de ces perturbations. Suite au traitement par le cis-platine, une délocalisation de TRF2 des télomères (maximum 55%) a été mise en évidence dans les deux lignées, accompagnée de dommages au niveau des télomères (2-3 dommages/cellule) mais elle est cependant insuffisante pour induire leur raccourcissement. Ensuite, la quantification par ICP-MS du cis-platine fixé au niveau de l’ADN télomérique purifié montre que le cis-platine se fixe bien au niveau des télomères. Cependant cette quantité fixée est 5 fois moins importante que celle trouvée au niveau de l’ADN génomique et 12 fois moins importante que celle attendue d’après les études in vitro, suggérant que les guanines de l’ADN télomérique sont moins accessibles que celles de l’ADN génomique. D’autre part, la quantité de cis-platine fixé par base est trop faible pour expliquer le déplacement de TRF2. Ces résultats suggèrent que la fixation du cis-platine au niveau des télomères ne peut donc pas être le mécanisme majoritaire responsable du déplacement de TRF2 des télomères et de la mort des cellules. Ce travail ouvre ainsi la voie à la conception de nouveaux complexes anti-tumoraux de platine qui cibleraient plus spécifiquement les télomères des cellules cancéreuses afin de les déstructurer plus efficacement. / Telomeres are nucleoprotein structures located at the ends of chromosomes. They play an important role in the maintenance of the genetic information, the stability and protection of chromosome’s ends. Telomeres consist of repeated DNA sequences G-rich (TTAGGG)n, and telomeric proteins that protect them. Among them, TRF1 and TRF2 bind directly to double-stranded. Any change in the structure of telomeres (telomeric protein composition, shortening their length, damage) can cause the death of cancer cells. Thus telomeres are considered as therapeutic targets. Since they are rich in adjacent guanines, telomeres are therefore potential targets for cis-platin, a pharmacological agent used in the treatment of a certain number of tumours. We looked for, at the cellular level, using two lines of ovarian cancer A2780: sensitive and resistant to cis-platin any changes in the structure of their telomeres after cis-platin treatment. And we checked the amount of cis-platin bound to telomeres to determine if it could be the cause of these perturbations. Following treatment with cis-platin, a delocalisation of TRF2 from telomere (maximum 55%) was observed within both cell lines, with damages at telomeres (2-3 damages / cell). But it is still not enough to induce their shortening. Then, the quantification by ICP-MS of the cis-platin fixed at purified telomeric DNA, shows that cis-platin binds well at telomeres. However, this amount is 5 times less than that the one found at genomic DNA and 12 times less than the one expected from in vitro studies, suggesting that the guanines of the telomeric DNA are less accessible than those of the genomic DNA. On the other hand, the amount of cis-platin bound by base is too small to explain the displacement of TRF2. So, these results suggest that the binding of cis-platin at telomeres cannot be the principal mechanism responsible of cell death, and that the displacement of TRF2 from telomere is not related directly to this phenomenon. Thus, this work opens the way for the design of new anti-tumour platinum complexes that target telomeres of cancer cells more specifically, in order to induce more efficiently their dysfunction.

Nanoparticles were synthesized and modified for target drug delivery. The research involved the aqueous synthesis of near infrared (NIR) sensitive Au-Au₂S nanoparticles. An anti-cancer drug (<i>cis-platin</i>) was subsequently adsorbed onto the Au-Au₂S nanoparticle surface via the 11-mercaptoundecanoic acid layers. The results showed that the degree of adsorption of cis-platin onto Au-Au₂S nanoparticles was controlled by the pH value of solution, and the rate of drug release was sensitive to NIR irradiation. The results of the synthesis, drug-release properties and nanoparticle-cell interactions will be discussed. / Singapore-MIT Alliance (SMA)