Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T05:42:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peres_RenataMariaBorges.pdf: 1155626 bytes, checksum: 762e48191487fb6a14f74846243c214b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O citomegalovírus humano (HCMV) é um vírus cosmopolita pertencente à família Herpesviridae, subfamília Betaherpesvirinae. É amplamente disseminado na população, com soroprevalência entre 40 e 100%. Sua transmissão se dá através do contato direto com secreções contendo o vírus como: sêmen, secreção cervical, urina, saliva, leite materno, hemoderivados e também através de transplante de órgãos e tecidos. Durante a infecção primária o HCMV apresenta intensa replicação e em seguida estabelece um estágio de latência no hospedeiro. Periódicas reativações ocorrem em situações de estresse, imunossupressão, doenças auto-imunes e uso de quimioterápicos. O impacto desta infecção em receptores de Transplante de Células Tronco Hematopoéticas (TCTH) é grande podendo causar pneumonia intersticial, doença no trato gastrointestinal, hepatite, mielossupressão, retinite, nefrite, encefalite, atraso da pega medular, doença do enxerto contra hospedeiro, infecções por outros organismos oportunistas, aceleração da perda do enxerto e óbito. Por este motivo, é de suma importância o uso de técnicas laboratoriais, suficientemente sensíveis e específicas, capazes de fazer o diagnóstico precoce da infecção ativa pelo HCMV e estudos mais aprofundados sobre a real relação e correlação clínica que estas técnicas apresentam a fim de prevenir o aparecimento da doença pelo HCMV e demais complicações associadas ao HCMV. Neste estudo foram monitorizados semanalmente, 30 pacientes submetidos a TCTH do tipo alogênico desde o dia do transplante até o dia 150 pós-transplante pelas técnicas de antigenemia, Nested-PCR e Real-time PCR. O tratamento precoce com medicamento antiviral foi iniciado a partir dos seguintes resultados: = 1 célula pp65 positiva/3x105 leucócitos e/ou 2 ou mais Nested-PCR positivas consecutivas. O cut-off da Real-time PCR para a infecção ativa pelo HCMV foi padronizado neste estudo, sendo de 418,39 cópias virais/104 leucócitos periféricos. Vinte e sete pacientes (90%) apresentaram infecção ativa pelo HCMV, com maior incidência durante o segundo mês pós-TCTH. Destes 27 pacientes, 21 (77,78%) foram submetidos ao tratamento precoce com Ganciclovir, 18 (66,67%) apresentaram infecções oportunistas, 11 (40,74%) tiveram DECH aguda, 9 pacientes (33,33%) tiveram infecção ativa recorrente pelo HCMV, 5 (18,52%) tiveram rejeição crônica do enxerto, 2 (7,4%) desenvolveram doença pelo HCMV e 11 (40,47%) evoluíram a óbito, sendo 1 (3,7%) por doença por HCMV associado a DECH aguda e infecção bacteriana. O teste mais precoce para o diagnóstico da infecção ativa pelo HCMV foi a Nested-PCR com mediana de 33 dias pós-TCTH, seguido pela Real-time PCR e antigenemia, ambas com mediana de 40 dias pós-TCTH. A Real-time PCR foi o teste mais sensível (S=92,3%) e que apresentou melhor valor preditivo negativo (VPN=85,71%) para o diagnóstico da infecção ativa pelo HCMV. Já a antigenemia foi o teste mais específico (E=77,77%) e que apresentou melhor valor preditivo positivo (VPP=84,61%) para este diagnóstico. Os testes utilizados no estudo foram eficazes no monitoramento da infecção ativa pelo HCMV, pois somente 2 (7,4%) dos 27 pacientes que apresentaram infecção ativa pelo HCMV desenvolveram doença por HCMV. / Abstract: Human cytomegalovirus (HCMV) is a member of the Herpesviridae family and Betaherpesvirinae subfamily. HCMV is distributed worldwide, with prevalence of HCMV-positive antibodies of 40% to 100%. Transmission occurs during close personal contact with secretions of infected persons such as: semen, cervical secretions, urine, saliva, breast milk, blood products and transplanted organs and hematopoietic stem cell. During primary infection occurs intense replication followed by latent infection in host. Periodic reactivations occur in stress situations, immunosuppression, autoimmune diseases and use of chemotherapy. The impact of HCMV infection on recipients HSCT is large and can cause pneumonitis, gastrointestinal diseases, hepatitis, marrowsuppression, retinitis, nephritis, encephalitis, delay of bone marrow engraftment, severe acute graft-versus host disease (GVHD), opportunistic infections, chronic rejection and death. For this reason it is extremely important the use of sensitive and specific methods for early diagnostic of active HCMV infection and deeper studies about the real clinical relation and correlation these techniques show in order to prevent the disease through HCMV and further complications connected to HCMV. In this study 30 patients recipients of allogenic HSCT were monitored at weekly intervals from D+0 to D+150 post-transplant by antigenemia, Nested-PCR and Real-time PCR. Antiviral preemptive therapy was initiated upon a result = 1 positive pp65 cell/3x105 of PML and/or two or more consecutive positive Nested-PCR. The optimal cut-off value by Real-time PCR for active HCMV infection was 418,39 copies/104 of PBL. Twenty seven (90%) patients had active HCMV infection, with the highest incidence occurring during the second month after HSCT. Twenty one (77,78%) of the 27 patients who had active HCMV infection received preemptive antiviral therapy with Ganciclovir, 18 (66,67%) had opportunist infection, 11 (40,74%) had acute graft-versus host disease (GVHD), 9 (33,33%) had recurrence of HCMV infection, 5 (18,51%) had chronic rejection, 2 (7,4%) developed HCMV disease and 11 (40,47%) died, one (3,7%) by HCMV disease associated with GVHD and bacterial infection. The most precocious test for diagnostic of active HCMV was Nested-PCR after a median of 33 days after HSCT followed by Real-time PCR and antigenemia, both with a median of 40 days after HSCT. Real-time PCR was the most sensitive (Sensitive=92,3%) and with the best predictive negative value (PNV=85,71%) for diagnostic of active HCMV infection. Antigenemia was the most specific (Specific=77,77%) and with the best predictive positive value (PPV=84,61%) for this diagnostic. The three assays utilized in this study were effective in active HCMV infection surveillance because only 2 (7,4%) of 27 patients that had active HCMV infection had HCMV disease. / Universidade Estadual de Campi / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:16:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_PaulaDurante_M.pdf: 3994483 bytes, checksum: eca47ce9f7df65d68a6da3ad72ad056b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O Citomegalovírus Humano (HCMV) é o principal causador de complicações pós-transplante. Métodos específicos que permitam identificar, precocemente, os pacientes com risco de desenvolvimento de doença, para os quais tratamento é indicado, têm sido requeridos, a fim de que poucos pacientes sejam desnecessariamente tratados e para a efetiva instituição terapêutica. A "Nested-PCR", dupla Reação em Cadeia da Polimerase, é um teste comumente utilizado no diagnóstico da infecção ativa por HCMV, contudo, quando realizada em leucócitos do sangue periférico, devido à sua alta sensibilidade, não apresenta boa correlação com o desenvolvimento de doença por HCMV. A detecção do DNA do HCMV no soro, pela PCR, tem sido associada com o desenvolvimento de doença por HCMV. Neste estudo, nós aplicamos a "Nested-PCR" em leucócitos do sangue periférico (denominada "L-PCR"), o método Convencional do Laboratório, e em soro ("sPCR"), para o diagnóstico da infecção ativa por HCMV, a fim de estabelecermos a correlação dos resultados obtidos, de ambos os métodos, com o desenvolvimento de infecção sintomática. Com este propósito, nós avaliamos, prospectivamente, amostras de 37 pacientes, 20 submetidos a transplante renal, e 17 submetidos a transplante de células tronco hematopoiéticas. Para excluir resultados falso negativos, na reação de amplificação pela "sPCR", um controle interno foi construído e todas as reações foram realizadas utilizando-o. De acordo com os critérios estabelecidos neste estudo, 21 pacientes (21/37 - 57%) desenvolveram infecção ativa por HCMV. Todos os pacientes com infecção ativa por HCMV foram positivos para a "L-PCR" (p= 0,0003). A "sPCR" foi positiva para somente 10 pacientes (10/37 - 27%) (p= 0,01). Resultados discordantes foram observados em 11 pacientes que foram positivos para infecção ativa para a "L-PCR", mas negativos para a "sPCR", 5 dos quais desenvolveram sintomas clínicos para o HCMV. O coeficiente Kappa de concordância observado para ambos os métodos foi de 0,44 (acordo moderado). Em dezesseis pacientes (43%), dos 37 estudados, não foram observados resultados positivos por nenhum dos métodos empregados - não desenvolveram infecção ativa -, contudo, 2 destes desenvolveram sintomas clínicos de provável doença por HCMV e um apresentou, posteriormente, biópsia confirmativa para doença por HCMV. Sintomas clínicos foram observados em 14 pacientes, em 12 deles infecção ativa foi diagnosticada através da "L-PCR" (p= 0,007) e, em 7, através da "sPCR" (p= 0,02). Ausência de sintomas clínicos foram observados em 9 pacientes nos quais a "L-PCR" detectou infecção ativa e em 3 pacientes nos quais a "sPCR" detectou (coeficiente Kappa 0,57, acordo moderado). De 14 pacientes sintomáticos, 2 pacientes soronegativos para o HCMV que receberam rins soropositivos desenvolveram infecção primária. Analizando os dois métodos para o diagnóstico da infecção ativa, nós observamos maior sensibilidade e valor preditivo negativo da "L-PCR" ("L-PCR" 100% vs. "sPCR" 62%), e maior especificidade e valor preditivo positivo da "sPCR" ("sPCR" 81% vs. "L-PCR" 50% e 72%). O valor dos testes positivos, "L-PCR" e "sPCR", para predizer doença por HCMV foram, respectivamente, 57% e 70%, e o valor dos testes negativos para predizer que doença não desenvolveria foi 88% para "L-PCR" e 74% para a "sPCR". A análise comparativa entre os primeiros resultados positivos para a presença de infecção ativa por HCMV e o aparecimento de sintomas mostrou que a "L-PCR" precedeu o inicio dos sintomas clínicos 19 dias (mediana) em 8 pacientes. Em 2 pacientes, a "sPCR" precedeu 7 dias (mediana) a "L-PCR" na detecção de infecção sintomática por HCMV. A "L-PCR" e a "sPCR" foram considerados métodos complementares para o diagnóstico e monitoramento da infecção sintomática por HCMV. / Abstract: The Human Cytomegalovirus (HCMV) is the main cause of post-transplant complications. Specific methods that allow to identify early patients with risk of developing disease for which treatment is indicated, have been required so that few patients are treated unnecessarily and for the effective therapeutic institution. The "Nested-PCR" has been commonly used in the diagnosis of HCMV infection, however, when performed in peripheral blood leukocytes, due to its high sensitivity does not present good correlation with the development of HCMV disease. Detection of HCMV DNA in serum by PCR has been associated with the development of HCMV disease. In this study, we apply the "Nested-PCR" in peripheral blood leukocytes (termed "L-PCR"), the conventional method of Laboratory, and in serum ("sPCR"), for the diagnosis of active HCMV infection, in order to establish the correlation of results obtained of both methods with the development of symptomatic infection. With this purpose, we evaluated prospectively samples of 37 patients, 20 undergoing kidney transplantation, and 17 submitted to haematopoietic stem cells transplantation. To exclude false negative results in the amplification reaction by "sPCR", an internal control was constructed and all reactions were carried out by using it. According to the criteria established in this study, 21 patients (21/37 - 57%) developed active HCMV infection. All patients with active HCMV infection were positive by LPCR (p= 0,0003). The serum PCR were active HCMV infection positive for only 10 patients (10/37 - 27%) (p= 0,01). Discordant results were observed in 11 patients who had active HCMV infection positive for "L-PCR" but negative for "sPCR", of which 5 developed clinical symptoms for HCMV. The observed Kappa coefficient of agreement for both assays was 0,44 (moderate agreement). Sixteen of 37 patients (43%) did not develop active HCMV infection by neither of the methods employed, however 2 of these developed clinical symptoms of probable HCMV disease and one presented later confirmative biopsy for HCMV disease. Clinical symptoms were observed in 14 patients, in 12 of whom active infection was diagnosed by "LPCR" (p= 0,007) and in 7 by "sPCR" (p= 0,02). Absence of clinical symptoms were observed in 9 patients in which the "L-PCR" detected active HCMV infection and in 3 patients in which the "sPCR" detect it (kappa coefficient 0,57, moderate agreement). Of the fourteen symptomatic patients, 2 HCMV-seronegative patients who received seropositive Kidneys developed primary infection. Analyzing the two methods for the diagnosis of active infection, we observed higher sensitivity and negative predictive value of the "L-PCR" ("L-PCR" 100% vs. "sPCR" 62%), and higher specificity and positive predictive value of "sPCR" ("sPCR" 81% vs. "L-PCR" 50% e 72%). The value of positive "L-PCR" or "sPCR" tests to predict HCMV disease were respectively 57% and 70% and, the value of the negative tests to predict that HCMV disease would not develop was 88% to "L-PCR" and 74% to "sPCR". The comparative analysis between the first positive results for the presence of active HCMV infection and the onset of symptoms, showed that the "L-PCR" test preceded the onset of clinical symptoms 19 days (median) in 8 patients. In two patients the "sPCR" preceded 7 days (median) the "L-PCR" in the detection of symptomatic HCMV infection. Therefore the "L-PCR" and the "sPCR" were considered complementary methods for the diagnosis and manegement of HCMV symptomatic infection. / Mestrado / Mestre em Farmacologia